Ecofisiología del Cultivo in vitro

FOTOSÍNTESIS IN VITRO

Fotosíntesis de plantas cultivadas in vitro

La fotosíntesis neta de microplantas en condiciones ex vitro y analizada bajo condiciones

ambientales óptimas, comparada con la de plántulas obtenidas de semillas de esas mismas
especies es variable (Lee et al, 1985; Smith et al, 1986; Pospisilová et al, 1987; Kozai e
Iwanami, 1988; Pospisilová et al, 1988; Shimada et al, 1988; Yue et al, 1992). En
algunas especies, la tasa fotosintética es especialmente baja, probablemente a causa del
marchitamiento que se produce al extraer las hojas del recipiente para proceder a su
medida (Grout y Aston, 1978; Donnelly y Vidaver, 1984; Donnelly et al, 1984; Grout y
Millam, 1985; Smith et al, 1986; Lees et al, 1991; Mohammed et al, 1992). Aunque
existe una gran variabilidad de respuestas en los valores de fotosíntesis neta observados
respecto a la irradiancia o a la concentración de COi, generalmente son similares a los que
presentan las plantas ex vitro (Pospisilová et al, 1987; Pospisilová et al, 1988; Sólarová
et al, 1989; Kozai et al, 1990; Yue et al, 1992). Sin embargo, en algunas ocasiones,
como en Actinidia, Betula y Rubus la fotosíntesis es inferior frente a distintas ¿radiancias
(Donnelly y Vidaver, 1984; Smith et al, 1986; Infante et al, 1989). En otras especies, el
incremento de irradiancia aumenta la respuesta fotosintética (Lee et al, 1985; Kozai et al,
1990). Curiosamente, la fotosíntesis neta de Actinidia aumenta considerablemente al
aumentar la concentración de CÜ2únicamente hasta los 600 ppm (Infante et al, 1989).

El aparato fotosintético y sus actividades enzimáticas

El efecto de las condiciones ambientales de los cultivos sobre la fotosíntesis de las plantas
in vitro ha sido revisado recientemente por Pospisilová et al, (1997). La actividad
Ribulosa-l,5-bifosfato carboxilasa (Rubisco) disminuye al aumentar la concentración de
sacarosa en el medio de cultivo (por encima del 3%) (Hagimori et al, 1984; Watanabe et
al, 1990; Tanaka et al, 1991). Además, las actividades Rubisco y Fosfoenolpiruvato
carboxilasa (PEPC), se ven claramente afectadas al aumentar la concentración relativa de
oxígeno en el interior de la atmósfera de los recipientes de un 5% a un 21% (Tanaka et al,
1991; Hidder y Desjardins, 1994). Sin embargo en algunas ocasiones aunque se detectan
actividades apreciables de Rubisco en plantas micropropagadas en recipientes con baja
tasa de ventilación, la asimilación de COi, depende de la tasa de ventilación, o lo que es lo
mismo de la disponibilidad de COi. El estudio de las enzimas Rubisco o PEPC puso de
manifiesto que las actividades varían durante las distintas fases de cultivo,
incrementándose en el inicio de los cultivos y disminuyendo al final (Kumar et al, 1988).
Además parece que dichas actividades pueden estar condicionadas por los reguladores del
crecimiento empleados en cada fase de la micropropagación.
1029
La Ecofisiología Vegetal: Una Ciencia de Síntesis

Fotosíntesis en el interior de los recipientes

De forma genérica podríamos decir que en los recipientes de cultivo con baja tasa de
intercambio gaseoso, se pueden observar marcadas fluctuaciones diarias de la
concentración de CCb en su interior. Además, la liberación de CCh durante la
respiración que provoca un incremento de su concentración al final del período oscuro,
puede depender de las especies, tamaño de tallos o plantas, estado de desarrollo,
concentración de azúcares en el medio, volumen del recipiente, duración del
fotoperíodo, etc. (Pospisilová et al., 1997). A pesar de esta acumulación, durante las
primeras horas (1 a 4 h) del fotoperíodo, la concentración de CÜ2 disminuye hasta
niveles próximos al punto de compensación, y por tanto la fotosíntesis neta también
disminuye. En estas condiciones, los explantos precisan de una fuente de energía
exógena que se incorpora al medio de cultivo. Este hecho, unido a la baja
concentración de CÜ2 e intensidad de luz hace que se desarrolle en las plántulas una
nutrición heterótrofa, ya que no es sostenible la forma de nutrición autotrófica que
sería deseable para obtener un mejor rendimiento en la fase de aclimatación de las
plántulas. Estudios recientes han demostrado que los explantos clorofílicos tienen, en
general, capacidad fotosintética restringida principalmente por las bajas
concentraciones de CÜ2 en el recipiente de cultivo durante el fotoperíodo (Fujiwara et
al., 1987; Jeong et al, 1995) más que por la baja capacidad fotosintética de los
explantos (Pospisilová et al., 1997) (Fig. 4), debido a la baja tasa de intercambio
gaseoso, baja irradiancia y alto contenido en azúcares del medio (Langford y
Wainwright, 1987; Kozai, 1991). Por tanto el nivel de heterotrofía, mixotrofía o
autotrofía dependerá, no sólo de la capacidad fotosintética de la especie en cultivo, sino
también de la composición del medio, volumen y formas de los recipientes, y del
sistema de cierre de dichos recipientes. Además, la fijación de CÜ2 se ve inhibida por la
presencia de azúcares en el medio, aumentando significativamente en ausencia de
sacarosa (Solarova et al., 1989; Cournac et al., 1991), sobre todo si va acompañado de un
aumento en la concentración de CÜ2 atmosférico (Kozai et al., 1991; Deng y Donelli,
1993). Otros autores han observado que concentraciones de azúcar superiores a un 3%
disminuyen la fotosíntesis neta (Langford y Wainwright 1987; Capellades et al, 1991;
Lees et al, 1991; Desjardins, 1995). En cualquier caso el estudio de la respuesta
fotosintética frente a distintas concentraciones de CÜ2 y de sacarosa, parece indicar que el
desarrollo del aparato fotosintético depende principalmente de la concentración de CÜ2
existente en los recipientes de cultivo (Solarova et al, 1989; Posposilová et al, 1992).
Normalmente, los explantos cultivados en medios con sacarosa acumulan grandes
cantidades de almidón en los cloroplastos debido a la baja exportación de azúcares fuera
de la hoja (Capellades et al, 1991). Incluso la anatomía foliar cambia, encontrándose
diferencias notables en la acumulación de almidón del estroma y en la anatomía de las
células del parénquima en empalizada (Dimassi-Theriou y Bosabalidis, 1997).

1030
 Ecoflsiología del Cultivo in vitro

Figura 4. Fotosíntesis neta de plántulas de Cymbidium en el interior del recipiente de cultivo frente a la
concentración de CÜ2.

Utilización del potencial fotosintético durante las fases de micropropagación

De los distintos datos recogidos en varias revisiones (Kozai, 1992; Pospisilová et al.,
1997). Se pueden enunciar los siguientes principios respecto a la fotosíntesis de tejidos o
plantas durante las distintas fases de la micropropagación (Tabla 5):

Tabla 5. Ventajas y limitaciones del potencial fotosintético en la micropropagación de plantas

1. Las hojas de explantos/tallos/plantas in vitro tienen capacidad fotosintética

2. La capacidad fotosintética está restringida por una baja concentración de CÜ2 durante el fotoperíodo
3. Existe un crecimiento obligadamente heterótrofo o mixótrofo
4. La actividad Ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa (Rubisco) y la fotosíntesis neta disminuyen al aumentar la
concentración de sacarosa por encima del 2%
5. Una elevada irradiancia no aumenta la tasasfotosintética si la concentración de CÜ2 es limitante
6. Las plantas crecen más rápidamente bajo condiciones de autotrofía, con elevada irradiancia y CÜ2, que en
condiciones de hetera- o mixotrofía
7. El crecimiento inicial bajo condiciones autótrofas es mayor para explantos con hojas de mayor área y
elevada capacidad fotosintética
8. La composición del medio de cultivo definida para la micropropagagión hetera- o mixótrofa no es
adecuada para la micropropagación autótrofa
9. La falta de renovación del aire en el interior de los recipientes (además de la baja concentración de CÜ2
también limita la fotosíntesis)
10. La renovación del aire sea por difusión o ventilación forzada promueve la fotosíntesis y el crecimiento

1031
La Ecofisiología Vegetal: Una Ciencia de Síntesis

Sistemas de medida de fotosíntesis in vitro

La posibilidad de enriquecer con CÜ2 los recipientes de cultivo ha conducido al desarrollo

de sistemas de medida de la tasa de fotosíntesis en condiciones in vitro. Inicialmente la
fotosíntesis de las plantas producidas in vitro, fue analizada utilizando una pequeña cámara
de asimilación con una sistema de aire forzado bajo condiciones ambientales controladas.
En estos sistemas la concentración de CÜ2 del aire que se mueve desde dentro hacia afuera
de la cámara se mide con un analizador de infrarrojos (Grout y Aston, 1978; Donnelly y
Vidaver, 1984; De et al, 1993). Sin embargo las condiciones físicas y fisiológicas en la
cámara de medida, pueden ser diferentes de las encontradas habitualmente en los
recipientes de cultivo. Por ello la medida de la fotosíntesis neta in situ puede diferir de la
obtenida en una cámara de asimilación con idéntica concentración de COi, irradiancia, y
temperatura a las del interior del recipiente.

Figura 5. Diagrama que muestra la configuración de un sistema de cultivo fotoautotrófico con control de la
concentración de CÜ2 en línea mediante analizadores de infrarrojos. El flujo de gas y medio de cultivo se
representan por líneas sólidas y las señales eléctricas por trazos.

Sistemas alternativos para medir fotosíntesis in situ han sido desarrollados por Falqué
et al (1991) y Fujiwara et al (1992). Utilizando analizadores de infrarrojos (Fig. 5) para
medir el CÜ2, con la limitación de que la tasa de flujo mínima para el análisis en este tipo
de equipos es de 0,3 L min"1, lo que puede producir alteraciones del ambiente de los
recipientes, ya que los valores de la tasa de intercambio de CÜ2 no son suficientes para
determinar algunos parámetros de la fotosíntesis. Por tanto en muchas ocasiones la tasa
fotosintética no refleja los valores reales que se obtendrían con una ventilación natural por
difusión. Un aspecto importante que debe ser considerado en este tipo de estudios es que la
1032
 Ecofisiología del Cultivo in vitro

fotosíntesis neta de explantos y plántulas en cultivo de tejidos, en situaciones de

ventilación forzada, es superior a la que se obtiene con ventilación por difusión
(Nakayama et al, 1991; Kubota y Kozai, 1992). Recientemente, Niu et al (1998) han
diseñado un sistema que integra las aplicaciones y posibilidades de control descritos hasta
la fecha, y que puede analizar la concentración de CÜ2 mediante un cromatógrafo de gases
(Fig. 6).

A. Analizador de CÜ2
B. Bomba
C. Controlador de CO2
CO2. Cilindro de CO2
D. Deshumidificador
Fr. Regulador de flujo
Fg. Filtro membrana atmósfera
Fp. Prefiltro
Fs. Filtro membrana sustrato
Ps. Bomba peristáltica
R. Botella de nutrientes
Tg. Reloj de control de
válvulas solenoides
Ts. Reloj de control de la
bomba peristáltica
V. Válvula de dos o tres vías

Figura 6. Diagrama de un sistema para estimar la transpiración y fotosíntesis neta de plántulas in vitro a
diferentes valores de humedad relativa.

ACLIMATACIÓN Y CRONOLOGÍA DE LA ACLIMATACIÓN

Las características fisiológicas y anatómicas de las plantas obtenidas en recipientes con

baja tasa de intercambio gaseoso hacen imprescindible realizar una aclimatación
1033
Sin el seguimiento histológico detallado, la for-
mación del embrión somático sólo puede ser
confirmada por la germinación (Fig 1 F). Sin
embargo, debido al bajo porcentaje de embrio-
nes que llegan a esta etapa, esta tarea es casi
imprescindible para una correcta evaluación de
las respuestas encontradas con los diversos
medios de cultivo empleados.
Comparados con los embriones cigóticos de la
misma especie, los embriones somáticos fre-
cuentemente desarrollan de manera anormal
o son inmaduros. La anomalía más frecuente-
mente encontrada es la formación doble o tri-
ple del sistema vascular, causada por la pobre
polarización del transporte de auxinas. También
se puede encontrar un contenido excesivamen-
te alto, reducido o ausente de las reservas de
almidón y/o proteicas, que el meristema apical o
radical no estén desarrollados o que la embrio-
génesis sea repetitiva o secundaria (Fig 4 E).
La falta del meristema apical o una escasa
deposición de sustancias lipoproteicas en los
embriones somáticos de algunas especies no
debe ser tomada como una anormalía. Esto
puede ser un síntoma de inmadurez debido
a la rápida formación de los mismos. En este
caso una etapa intermedia que permita la ma-
duración de las estructuras formadas permitirá
incrementar el porcentaje de embriones somá-
ticos capaces de germinar.
4.- Factores que afectan los procesos
morfogénicos
Los cuatro principales factores que condicio-
nan la obtención y el crecimiento de nuevos
órganos in vitro son:
4.1.- el genotipo
4.2.- las condiciones químicas seleccionadas
para realizar el cultivo.
4.3.- las condiciones físicas seleccionadas
para realizar el cultivo.
4.4.- el explante.
4.1.- El genotipo es un factor determinante en
todos los procesos morfogénicos, desde la ca-
pacidad del explante para su establecimiento en
condiciones in vitro a la proliferación de callo, o
la diferenciación y crecimiento de nuevos órga-
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
nos. Por esta causa, no es posible generalizar
metodologías o protocolos de trabajo debido a
que los medios de cultivo, así como las condi-
ciones de cultivo seleccionados, deben ser es-
pecíficos para cada situación en particular. Un
ejemplo de ello es el protocolo empleado por
Stamp and Meredith en diferentes cultivares de
Vitis vinifera. En cuatro de ellos fue posible la
obtención de embriones somáticos a partir de
embriones cigóticos, pero estos resultados no
se repitieron con el cultivar "Pinot Noir".
4.2.- Varios son los compuestos químicos que
influyen en los patrones morfogénicos in vitro
dentro de los cuales podemos considerar:
4.2.1.- la composición salina del medio de culti-
vo. La composición salina más empleada para
inducir la formación de callo, la organogénesis
directa o indirecta en la mayoría de las espe-
cies vegetales, es la de Murashige & Skoog
(1962) (MS). Sin embargo, existen otras formu-
laciones diseñadas para inducir determinados
patrones morfogénicos. Existe además una es-
trecha relación entre la composición hormonal
del explante y la concentración de reguladores
del crecimiento agregada al medio de cultivo.
4.2.2.- reguladores del crecimiento. Estos
compuestos pueden promover la morfogénesis
aún cuando la concentración salina no sea la
adecuada. En condiciones óptimas de cultivo
pueden aumentar significativamente la dife-
renciación de órganos. Para la inducción de
embriones somáticos en muchas especies ve-
getales es necesario el agregado de auxinas,
como ocurre en Tilia spp. Sin embargo para
otras, como es el caso del crotón (Codiaeum
variegatum), es suficiente con el agregado de
thidiazurón. El genotipo y el tipo y concentra-
ción de reguladores del crecimiento empleados
están estrechamente relacionados.
4.2.3.- antibióticos. En procesos de transfor-
mación con Agrobacterium tumefaciens es
muy común el agregado de antibióticos del tipo
cefotaxime; kanamicina y carbenicilina para
la eliminación de la bacteria. En explantes de
hoja de diferentes cultivares de Malus domes-
tica se encontró que 250 mg L–1 de cefotaxime
aumentan significativamente la regeneración
de brotes mientras que 500 mg L–1 de carbe-
nicilina promueven la formación de callo y la
31
kanamicina inhibe los procesos morfogénicos.
4.2.4.- carbón activado. En general se usa para
adsorber compuestos tóxicos de la micro atmós-
fera gaseosa o el exceso de reguladores del cre-
cimiento presentes en el medio de cultivo pero
E.K. Pettersson y su equipo de colaboradores de
la Swedish University of Agriculture, demostraron
que puede promover la embriogénesis somática
debido a la incorporación de ciertos compuestos
al medio de cultivo por difusión.
4.2.5.- agar. Otro aspecto importante a tener en
cuenta es la consistencia del medio de cultivo.
Puede emplearse como semi-sólido o líquido. El
agente gelificante más utilizado en el cultivo in
vitro es el agar, extraído de diversas algas ma-
rinas. Las diferentes calidades existentes en el
mercado modifican la expresión morfogénica
debido a que pueden contener sustancias inhi-
bitorias o promotoras del crecimiento. Tal es el
caso del cultivo de hojas de Actinidia chilensis
(en medio de MS con el agregado de 0,1 mg/L de
AIA + 1 mg/L de BAP) cuya respuesta morfogéni-
ca varió según el tipo de agar utilizado. Cuando
el gelificante empleado fue Chubut-agar, de pro-
ducción nacional, se observó una gran diferen-
ciación de yemas adventicias, mientras que con
el agregado de agar SIGMA R sólo se indujo la
proliferación de callo.
En caso de seleccionar medios de cultivo líqui-
dos, la respuesta morfogénica observada varía
de manera considerable. El cultivo líquido es im-
prescindible cuando se busca promover la mor-
fogénesis indirecta a través de suspensiones ce-
lulares. Para ello es necesario cultivar los callos
en medio líquido con agitación para permitir que
las células se disgreguen y puedan diferenciar
raíces, brotes o embriones somáticos en forma
aislada.
La elección de un medio de cultivo líquido o
sólido depende, además, de la especie con la
que se trabaja. En Cymbidium, por ejemplo, se
ha observado que el empleo de medio líquido
promueve una mayor diferenciación de proto-
cormos respecto del mismo gelificado. A su vez,
este proceso puede mantenerse durante varios
subcultivos, mientras que en medio de cultivo ge-
lificado se observó que los protocormos tienden
a formar tallos.
4.2.6.- atmósfera gaseosa. Es un factor determi-
nante en los procesos morfogénicos y esta con-
32 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
dicionada por el tipo y tamaño del envase selec-
cionado para el cultivo, así como también por el
sistema de cobertura del mismo. Las tapas usa-
das en cultivo in vitro varían desde el tapón de
algodón; papel de aluminio; película de resinite
transparente o tapas rígidas de polipropileno. El
intercambio gaseoso es diferente para cada tipo
de tapa, en consecuencia la atmósfera interna
también sufrirá variaciones.
En condiciones in vivo la atmósfera contiene 78
% de nitrógeno; 21 % de oxígeno y 0,035 % de
dióxido de carbono. En cultivos in vitro se han
registrado además, etileno y otros compuestos
hidrocarbonados.
El nivel de oxígeno disponible para el explante
condiciona el crecimiento y los procesos morfo-
génicos. En general se necesita una buena airea-
ción para obtener cualquier tipo de proceso mor-
fogénico. En alfalfa se puede obtener un buen
incremento de material a partir de suspensiones
celulares embriogénicas cuando la solución se
satura con 70% de oxígeno. Por el contrario, una
tensión de oxígeno del 5 % estimula la produc-
ción de plantas a partir de anteras de tabaco.
La concentración de dióxido de carbono (CO2) en
la atmósfera gaseosa in vitro varía según la res-
piración y la actividad fotosintética de las plantas.
En condiciones de oscuridad, el CO2 incrementa
mientras que en condiciones de luz, disminuye.
En trabajos realizados con Ficus lyrata se han
encontrado concentraciones variables, entre 0,5
% y 8,5 %, según el tipo de sello o tapa emplea-
dos. Concentraciones superiores al 1 %, que son
generalmente tóxicas en condiciones in vivo, pro-
bablemente no fueron limitantes para la actividad
fotosintética.
La presencia de etileno en condiciones in vitro
promueve diversas respuestas. Su acumulación
tiene efectos inhibitorios sobre el cultivo de cé-
lulas, callos y anteras, La cantidad de etileno
producida in vitro varía con la especie, el tipo de
explante, la concentración de citocininas en el
medio de cultivo, el tipo de agar utilizado y con la
luz. Una forma de incorporar etileno al envase de
cultivo es a través de la esterilización del material
de disección realizada con el material embebido
en alcohol y flameado con mechero Bunsen. En
muchos casos el etileno actúa como promotor de
la morfogénesis pero luego es inhibitorio del cre-
cimiento de los órganos diferenciados
4.3.- Entre las condiciones físicas podemos men- cultivadas en un mismo medio de cultivo, según
cionar los efectos de la temperatura, la humedad la porción de la lámina utilizada (Pedroso y Pais,
relativa y la luz. 1993). Estos investigadores cultivaron estas ho-
4.3.1.- La temperatura de incubación de los cul- jas in vitro durante seis semanas previa inmersión
tivos es un factor importante a tener en cuenta. del explante en una solución de IBA (1 mg l–1) du-
Si bien en condiciones naturales las plantas ex- rante 20 minutos (Fig 5).
perimentan diferencias térmicas durante el día y
la noche, las temperaturas in vitro se mantienen
casi estables. Es importante señalar que cuanto
más se asemejen las condiciones in vitro a las
óptimas de crecimiento de la especie estudiada,
mayor será la respuesta obtenida. En cultivos de
hojas de Streptocarpus x hybridus sometidos a
diferentes temperaturas se observó que la rege-
neración mayor de brotes se producía a 12 ºC
mientras que por encima de los 30 ºC, práctica-
mente no se observó diferenciación.
4.3.2.- La humedad relativa (HR), como medida
de la cantidad de vapor de agua contenida en
la atmósfera gaseosa, es otro de los parámetros
físicos a tener en cuenta. La HR dependerá del Figura. 5: Esquema de las diferentes respuestas
sello o cobertura del envase empleado. Si este morfogénicas obtenidas después de seis semanas
cierre es hermético, la humedad interior será del de cultivo in vitro de hojas de Camellia japonica L.
según la porción de la lámina. 1, callo organogéni-
100 %. Si en cambio existe la posibilidad de un
co. 2 embriogénesis somática directa. 3, regenera-
intercambio gaseoso la humedad interna pue-
ción directa de raíces. 4, callo organogénico.
de descender a niveles cercanos al 50 %. Este
importante descenso de la HR puede promover
una pérdida veloz de agua del medio de cultivo
variando la concentración de sus compuestos Lecturas recomendadas
hasta llegar a niveles tóxicos (Debergh, comuni-
cación personal). Buddendorf-Joosten J.M.C. and Woltering E.J.
4.3.3.- La luz suministrada a los cultivos debe 1994. Components of the gaseous environment
ser evaluada en cuanto a la calidad, intensidad and their effects on plant growth and develop-
y período de suministro. La respuesta morfogé- ment in vitro. Plant Growth Regulation 15: 1-16.
nica de un explante puede variar según si se le De Klerk G.J., Arnholdt-Schmitt B., Lieberei R. and
Neumann K.H. 1997. Regeneration of roots,
proporciona luz o no. Para estimular la formación
shoots and embryos: physiological, biochemical
de callo, es común que se prefiera la oscuridad. and molecular aspects. Biologia Plantarum 39
El suministro de luz favorece la diferenciación de (1): 53-66.
órganos. George E. 1993. Plant propagation by tissue culture
Part 1 The technology. Butler and Tanner Ltd
4.4.- Tal como ya se señaló anteriormente, los (ed). Gran Bretaña. 1361pp.
proceso morfogénicos dependen del genotipo, Hicks G.S. 1980. Patterns of organ development in
pero a esto debe sumarse el efecto del explante plant tissue culture and the problem of organ de-
seleccionado. El tratamiento de la planta madre, termination. Bot. Rev. 46: 1-23.
las condiciones físicas y fisiológicas en las que Williams E.G. and Maheswaran G. 1986. Somatic
embryogenic factors influencing coordinated be-
ésta se encuentre y el sector del cual se tome
havior of cells as an embryogenic group. Ann.
el explante determinarán a su vez la respuesta Bot. 57: 443-597.
morfogénica en condiciones in vitro. Un ejemplo
muy interesante es la diferente respuesta morfo-
génica observada en hojas de Camellia japonica

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 33

II CAPÍTULO 2 ello, la obtención de plantas híbridas somáticas
requiere del previo aislamiento de protoplastos
mediante la digestión enzimática de las pare-
Hibridación Somática
des celulares, para luego proceder a la fusión
de protoplastos de distintos tipos parentales
Pablo Polci y Pablo Friedrich
(distintos genotipos) y posterior regeneración
de plantas a partir de los productos de fusión.
1 Introducción
La hibridación somática en plantas comenzó a
La mejora genética de las plantas cultivadas
desarrollarse a principios de 1970 con la apli-
en procura de incrementar la producción vie-
cación de métodos químicos de fusión, y se ex-
ne siendo practicada por el ser humano desde
tendió en los ´80 con el empleo de métodos de
hace miles de años, seguramente desde el ini-
electrofusión.
cio mismo de la agricultura. Para ello, el hom-
Es relevante destacar que, a los fines del
bre ha empleado los cruzamientos con el fin
mejoramiento genético, el sistema de proto-
de incrementar la variabilidad genética, paso
plastos no sólo se emplea para la obtención de
inicial en el proceso de mejoramiento. De esta
híbridos somáticos, sino que también constitu-
manera la hibridación entre especies diferentes
ye un material apropiado para la incorporación
permitió aumentar de modo significativo la pro-
de ADN exógeno. Asimismo, la fusión de proto-
ductividad de diversos cultivos, como por ejem-
plastos tiene un uso mucho más amplio que
plo los cereales. Sin embargo, en otros cultivos
el estrictamente de interés agronómico; en tal
esta estrategia no resultó exitosa a causa de
sentido, es de gran utilidad en estudios de bio-
esterilidad sexual o incompatibilidad genética.
logía celular así como para otras aplicaciones
La hibridación somática, es decir, la obten-
biotecnológicas, por ejemplo, la producción de
ción de plantas híbridas a partir de la fusión de
anticuerpos monoclonales.
células o de protoplastos derivados de células
somáticas, surgió hace unos 30 años como
2 Hibridación somática vs. hibridación
una herramienta muy promisoria para sortear
sexual
problemas de incompatibilidad precigótica..
En relación a su potencialidad para producir
Esta técnica, si bien presenta algunas limita-
híbridos, existen diferencias importantes entre
ciones, como una elevada esterilidad o impo-
la fusión de protoplastos somáticos y el cruza-
sibilidad de regenerar plantas en algunos ca-
miento sexual:
sos, demostró ser útil en la mejora genética de
plantas, principalmente por permitir la introgre-
• La hibridación sexual entre organismos
sión limitada de genes de especies silvestres
de diferentes especies está limitada por
en los cultivos. Se utiliza, por ejemplo, cuando
barreras de incompatibilidad. En algunos
se quiere transferir resistencia a enfermeda-
casos estas barreras son precigóticas,
des o tolerancia a estreses. También permite
es decir, no permiten que se produzca
la obtención de citoplasmas híbridos (cíbridos).
la fecundación. Tal limitante no existe en
La hibridación asimétrica y cibridización sirve
la fusión de protoplastos, dado que este
como puente para la transferencia de genes
proceso es no-específico, permitiendo la
individuales
fusión de células de orígenes muy diver-
La técnica de fusión de protoplastos se de-
sos, incluso de organismos muy distan-
sarrolló en la década de 1950-60, a partir de
ciados filogenéticamente (por ejemplo,
la observación de que ciertos virus pueden
células animales y vegetales). Ello no
inducir la fusión de células animales. Sin em-
significa que pueda regenerarse un or-
bargo, recién en la década de 1980-90 tuvo un
ganismo viable y fértil a partir de cual-
mayor auge debido a la aparición de métodos
quier tipo de combinación entre células.
químicos y eléctricos más apropiados para la
De hecho, la búsqueda de híbridos de in-
fusión de células vegetales. La pared presen-
terés agronómico ha demostrado que el
te en estas células representa una barrera que
principal aporte de esta metodología es
normalmente impide la fusión entre ellas. Por

Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 197

 la introgresión, en los cultivos, de genes
provenientes de plantas silvestres empa-
rentadas.
• La hibridación sexual ocurre normalmen-
te por fusión de células haploides (n + n),
mientras que en la hibridación somática
se fusionan dos protoplastos con sus ge-
nomas completos (2n + 2n) o con uno de
ellos conteniendo sólo parte de su geno-
ma.
• Otra diferencia está dada por la heren-
cia de los genes extranucleares, esto es,
plastídicos y mitocondriales. Mientras
que en la reproducción sexual el genoma
citoplasmático es aportado casi exclusi-
vamente por la gameta femenina, en la
hibridación somática se combinan orga-
nelas de ambos progenitores, producien-
do nuevas combinaciones de genes cito-
plasmáticos.
3 Hibridación somática vs. transforma-
ción genética
La preponderancia que han tomado las téc-
nicas de transformación genética ha relegado
a la hibridación somática a un papel de menor
significación como herramienta biotecnológica
aplicada al mejoramiento de los cultivos. Com-
parando ambas metodologías, podemos des-
tacar las siguientes diferencias:
• En la transformación genética se incor-
poran uno o pocos genes exógenos en
una planta, mientras que en la hibrida-
ción somática el número de genes intro-
ducidos es mayor dado que se transfie-
ren cromosomas de una especie a otra
o se combinan dos genomas completos.
• La hibridación somática permite trans-
ferir caracteres sin necesidad de contar
con un conocimiento detallado de los
mecanismos moleculares que determi-
nan la expresión de dichos caracteres.
Por el contrario, la transformación gené-
tica requiere la previa identificación y ais-
lamiento de los genes que determinan la
expresión del carácter de interés.
• Caracteres tales como productividad, to-
lerancia a ciertos tipos de estrés, resis-
198 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
tencia horizontal a enfermedades y otros
son poligénicos, por lo que su transfe-
rencia es factible por hibridación somáti-
ca pero no por transformación genética.
Sin embargo, en la actualidad, con las
nuevas herramientas aportadas por la
genómica se está avanzando en el co-
nocimiento de todos los genes involucra-
dos en diversas vías metabólicas. Estos
podrían ser transferidos en conjunto vía
transgénesis.
4 Tipos de híbridos somáticos
Cuando se realiza la fusión de protoplastos
se obtienen células con el aporte de cromoso-
mas de dos o más núcleos. Si los protoplastos
involucrados en la fusión proceden de distin-
tos tipos parentales se originan “heterocario-
nes”, y si proceden del mismo tipo parental se
originan “homocariones”. Cuando en el hete-
rocarión ocurre la fusión de los núcleos (cario-
gamia), se forma una “célula híbrida”.
A partir de una célula híbrida, que contiene
dos genomas completos, se puede regenerar
una planta que, según cual haya sido el destino
del material genético nuclear durante las divi-
siones celulares que siguen a la fusión, puede
ser de tres tipos:
1. Híbrido simétrico, que tiene el genoma
nuclear completo de cada tipo parental.
2. Híbrido asimétrico, que tiene el genoma
nuclear completo de uno de los parenta-
les y sólo una parte del genoma nuclear
del otro parental.
3. Cíbrido, que contiene el genoma nuclear
completo de uno de los parentales, re-
teniendo sólo material genético extranu-
clear del otro parental.
Es usual que en el proceso de regeneración
de plantas híbridas ocurra una eliminación gra-
dual de cromosomas de uno de los tipos pa-
rentales, produciéndose de este modo híbridos
asimétricos o cíbridos. La práctica de la hibri-
dación somática en plantas demostró que, en
general, los híbridos asimétricos y cíbridos son
más valiosos que los simétricos producidos
entre plantas alejadas filogenéticamente. Por
esta razón se han desarrollado métodos para
inducir la hibridación asimétrica o cibridación,
alterando el genoma de uno de los protoplas-
tos parentales. En este caso se dice que se
transfiere parte del genoma de un protoplasto
donante a uno receptor. Por lo tanto, teniendo
en cuenta el material de partida empleado para
la fusión, pueden producirse tres tipos de célu-
las híbridas:
1. Células híbridas simétricas, por fusión
de dos protoplastos con sus genomas
completos.
2. Célula híbrida asimétrica, por fusión de
un protoplasto conteniendo su genoma
completo con otro conteniendo su núcleo
inviable o sólo una parte de su genoma
nuclear. Los protoplastos donantes son
irradiados con rayos X o Gamma, lo que
provoca la fragmentación de los cro-
mosomas. Una vez producida la fusión,
dichos fragmentos tienden a eliminarse
en las sucesivas mitosis, pero algunos
de ellos pueden integrarse con el geno-
ma del receptor produciendo un híbrido
asimétrico. El tratamiento de irradiación
parece no tener efectos deletéreos o
mutagénicos sobre los genomas de or-
ganelas, probablemente debido a que
cada célula posee varias copias de ellas.
También puede producirse una célula hí-
brida asimétrica fusionando protoplastos
receptores con microprotoplastos, con-
teniendo uno o pocos cromosomas. Los
microprotoplastos se obtienen inducien-
do la formación de micronúcleos por tra-
tamientos con agentes antimicrotúbulos.
3. Cíbridos, por fusión de un protoplasto
conteniendo su genoma nuclear com-
pleto con un protoplasto enucleado o
con su núcleo inviable. Los protoplastos
enucleados o citoplastos pueden obte-
nerse centrifugando los mismos a alta
velocidad en un gradiente de densidad
isosmótico. Asimismo, el método de
irradiación con rayos X o Gamma pue-
de generar cíbridos en casos en que se
produzca la eliminación total de los frag-
mentos cromosómicos. Los protoplastos
que poseen su genoma nuclear comple-
to (receptores), pueden ser tratados pre-
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 199
viamente con inhibidores metabólicos.
En este caso sólo pueden sobrevivir, por
complementación metabólica, los hete-
rocariones conteniendo el núcleo del re-
ceptor y el citoplasma del donante enu-
cleado.
La segregación de los plástidos y mitocon-
drias de los dos tipos parentales también consti-
tuye una fuente importante de variabilidad en la
regeneración de plantas híbridas. Es frecuente
que ocurran recombinaciones de los genomas
mitocondriales de ambos tipos parentales, pero
ello es poco común entre plástidos. Dado que
las organelas segregan independientemente
unas de otras, la regla es que al cabo de pocas
divisiones mitóticas las células formadas con-
tengan plástidos provenientes de uno u otro
tipo parental. Así, una célula híbrida origina
una colonia de células que exhiben diferentes
combinaciones de genes citoplasmáticos, pero
con una mayor frecuencia de células que po-
seen mitocondrias recombinantes y plástidos
de uno u otro tipo parental. El destino que su-
fre el material genético nuclear y extranuclear
durante las divisiones celulares determina que,
a partir de una población de células híbridas
similares, se puedan regenerar plantas con di-
ferentes combinaciones de genes nucleares,
plastídicos y mitocondriales.
La Figura 1 muestra un esquema de las eta-
pas involucradas en la hibridación somática,
las cuales son tratadas a continuación.
5 Aislamiento de protoplastos
El desarrollo de métodos enzimáticos de ais-
lamiento a partir de 1960 brindó la posibilidad
de obtener grandes cantidades de protoplas-
tos vegetales. Ello tuvo gran influencia en di-
ferentes áreas de la biología y la biotecnología
de plantas, dada la utilidad de los protoplastos
como sistema experimental para estudios fisio-
lógicos, bioquímicos y moleculares, así como
para su aplicación al mejoramiento genético.
Los protocolos de aislamiento emplean en-
zimas fúngicas con actividad celulasa y pec-
tinasa, siendo necesario en algunos casos el
agregado de hemicelulasas. Las celulasas y
hemicelulasas degradan la pared celular, en