97 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal

III.-Captulo 2
Hibridacin somtica
Polci, Pablo; Friedrich, Pablo
1 Introduccin
La mejora gentica de las plantas cultiva-
das en procura de incrementar la produccin
viene siendo practicada por el ser humano
desde hace miles de aos, seguramente des-
de el inicio mismo de la agricultura. Para ello,
el hombre ha empleado los cruzamientos con
el fin de incrementar la variabilidad gentica,
paso inicial en el proceso de mejoramiento.
De esta manera la hibridacin entre especies
diferentes permiti aumentar de modo sig-
nificativo la productividad de diversos culti-
vos, como por ejemplo los cereales. Sin em-
bargo, en otros cultivos esta estrategia no
result exitosa a causa de esterilidad sexual
o incompatibilidad gentica.
La hibridacin somtica, es decir, la ob-
tencin de plantas hbridas a partir de la fu-
sin de clulas o de protoplastos derivados
de clulas somticas, surgi hace unos 30 aos
como una herramienta muy promisoria para
sortear problemas de incompatibilidad
precigtica.
Esta tcnica, si bien presenta algunas li-
mitaciones, como una elevada esterilidad o
imposibilidad de regenerar plantas en algu-
nos casos, demostr ser til en la mejora
gentica de plantas, principalmente por per-
mitir la introgresin limitada de genes de es-
pecies silvestres en los cultivos. Se utiliza, por
ejemplo, cuando se quiere transferir resisten-
cia a enfermedades o tolerancia a estreses.
Tambin permite la obtencin de citoplasmas
hbridos (cbridos). La hibridacin asimtrica
y cibridizacin sirve como puente para la
transferencia de genes individuales
La tcnica de fusin de protoplastos se
desarroll en la dcada de 1950-60, a partir
de la observacin de que ciertos virus pue-
den inducir la fusin de clulas animales. Sin
embargo, recin en la dcada de 1980-90 tuvo
un mayor auge debido a la aparicin de m-
todos qumicos y elctricos ms apropiados
para la fusin de clulas vegetales. La pared
presente en estas clulas representa una
barrera que normalmente impide la fusin
entre ellas. Por ello, la obtencin de plantas
hbridas somticas requiere del previo aisla-
miento de protoplastos mediante la diges-
tin enzimtica de las paredes celulares, para
luego proceder a la fusin de protoplastos
de distintos tipos parentales (distintos
genotipos) y posterior regeneracin de plan-
tas a partir de los productos de fusin. La
hibridacin somtica en plantas comenz a
desarrollarse a principios de 1970 con la apli-
cacin de mtodos qumicos de fusin, y se
extendi en los 80 con el empleo de mto-
dos de electrofusin.
Es relevante destacar que, a los fines del
mejoramiento gentico, el sistema de
protoplastos no slo se emplea para la ob-
tencin de hbridos somticos, sino que tam-
bin constituye un material apropiado para
la incorporacin de ADN exgeno. Asimismo,
la fusin de protoplastos tiene un uso mu-
cho ms amplio que el estrictamente de in-
ters agronmico; en tal sentido, es de gran
utilidad en estudios de biologa celular as
como para otras aplicaciones biotecnolgicas,
por ejemplo, la produccin de anticuerpos
monoclonales.
2 Hibridacin somtica vs. hibridacin
sexual
Con relacin a su potencialidad para pro-
ducir hbridos, existen diferencias importan-
tes entre la fusin de protoplastos somticos
y el cruzamiento sexual:
La hibridacin sexual entre organismos
de diferentes especies est limitada por ba-
rreras de incompatibilidad. En algunos casos
estas barreras son precigticas, es decir, no
permiten que se produzca la fecundacin. Tal
limitacin no existe en la fusin de
protoplastos, dado que este proceso es no-
especfico, permitiendo la fusin de clulas de
orgenes muy diversos, incluso de organismos
muy distanciados filogenticamente (por
ejemplo, clulas animales y vegetales). Ello no
significa que pueda regenerarse un organis-
mo viable y frtil a partir de cualquier tipo de
combinacin entre clulas. De hecho, la bs-
queda de hbridos de inters agronmico ha
demostrado que el principal aporte de esta
metodologa es la introgresin, en los culti-
vos, de genes provenientes de plantas silves-
tres emparentadas.
98
POLCI, Pablo; FRIEDRICH, Pablo
La hibridacin sexual ocurre normal-
mente por fusin de clulas haploides (n +
n), mientras que en la hibridacin somtica
se fusionan dos protoplastos con sus
genomas completos (2n +2n) o con uno de
ellos conteniendo slo parte de su genoma.
Otra diferencia est dada por la heren-
cia de los genes extranucleares, esto es,
plastdicos y mitocondriales. Mientras que en
la reproduccin sexual el genoma
citoplasmtico es aportado casi exclusiva-
mente por la gameta femenina, en la hibri-
dacin somtica se combinan organelas de
ambos progenitores, produciendo nuevas
combinaciones de genes citoplasmticos.
3 Hibridacin somtica vs.
transformacin gentica
La preponderancia que han tomado las
tcnicas de transformacin gentica ha rele-
gado a la hibridacin somtica a un papel de
menor significacin como herramienta
biotecnolgica aplicada al mejoramiento de
los cultivos. Comparando ambas metodolo-
gas, podemos destacar las siguientes diferen-
cias:
En la transformacin gentica se incor-
poran uno o pocos genes exgenos en una
planta, mientras que en la hibridacin
somtica el nmero de genes introducidos
es mayor dado que se transfieren
cromosomas de una especie a
otra o se combinan dos
genomas completos.
La hibridacin somtica
permite transferir caracteres sin
necesidad de contar con un co-
nocimiento detallado de los me-
canismos moleculares que deter-
minan la expresin de dichos ca-
racteres. Por el contrario, la trans-
formacin gentica requiere la
previa identificacin y aislamien-
to de los genes que determinan
la expresin del carcter de inte-
rs.
Caracteres tales como pro-
ductividad, tolerancia a ciertos ti-
pos de estrs, resistencia hori-
zontal a enfermedades y otros
son polignicos, por lo que su
transferencia es factible por hi-
bridacin somtica pero no por transforma-
cin gentica. Sin embargo, en la actualidad,
con las nuevas herramientas aportadas por
la genmica se est avanzando en el conoci-
miento de todos los genes involucrados en
diversas vas metablicas. Estos podran ser
transferidos en conjunto va transgnesis.
4 Tipos de hbridos somticos
Cuando se realiza la fusin de protoplas-
tos se obtienen clulas con el aporte de
cromosomas de dos o ms ncleos (Fig.1.) Si
los protoplastos involucrados en la fusin
proceden de distintos tipos parentales se
originan heterocariones, y si proceden del
mismo tipo parental se originan homoca-
riones. Cuando en el heterocarin ocurre
la fusin de los ncleos (cariogamia), se for-
ma una clula hbrida.
A partir de una clula hbrida, que contie-
ne dos genomas completos, se puede rege-
nerar una planta que, segn cual haya sido
el destino del material gentico nuclear du-
rante las divisiones celulares que siguen a la
fusin, puede ser de tres tipos:
1.Hbrido simtrico, que tiene el
genoma nuclear completo de cada tipo
parental.
2. Hbrido asimtrico, que tiene el
genoma nuclear completo de uno de los
parentales y slo una parte del genoma nu-
clear del otro parental.
Fig. 1. Destino del material gentico nuclear y extranuclear en la fusin
de protoplastos.
99 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal
3.Cbrido, que contiene el genoma nu-
clear completo de uno de los parentales, re-
teniendo slo material gentico extranuclear
del otro parental.
Es usual que en el proceso de regenera-
cin de plantas hbridas ocurra una elimina-
cin gradual de cromosomas de uno de los
tipos parentales, producindose de este
modo hbridos asimtricos o cbridos. La prc-
tica de la hibridacin somtica en plantas
demostr que, en general, los hbridos
asimtricos y cbridos son ms valiosos que
los simtricos producidos entre plantas ale-
jadas filogenticamente. Por esta razn se
han desarrollado mtodos para inducir la hi-
bridacin asimtrica o cibridacin, alterando
el genoma de uno de los protoplastos
parentales. En este caso se dice que se trans-
fiere parte del genoma de un protoplasto
donante a uno receptor. Por lo tanto, tenien-
do en cuenta el material de partida emplea-
do para la fusin, pueden producirse tres ti-
pos de clulas hbridas:
1.Clulas hbridas simtricas, por fusin
de dos protoplastos con sus genomas com-
pletos.
2.Clula hbrida asimtrica, por fusin
de un protoplasto conteniendo su genoma
completo con otro conteniendo su ncleo
inviable o slo una parte de su genoma nu-
clear. Los protoplastos donantes son irradia-
dos con rayos X o Gamma, lo que provoca la
fragmentacin de los cromosomas. Una vez
producida la fusin, dichos fragmentos tien-
den a eliminarse en las sucesivas mitosis, pero
algunos de ellos pueden integrarse con el
genoma del receptor produciendo un hbri-
do asimtrico. El tratamiento de irradiacin
parece no tener efectos deletreos o
mutagnicos sobre los genomas de
organelas, probablemente debido a que
cada clula posee varias copias de ellas. Tam-
bin puede producirse una clula hbrida
asimtrica fusionando protoplastos recepto-
res con microprotoplastos, conteniendo uno
o pocos cromosomas. Los microprotoplastos
se obtienen induciendo la formacin de
microncleos por tratamientos con agentes
antimicrotbulos.
3.Cbridos, por fusin de un protoplasto
conteniendo su genoma nuclear completo
con un protoplasto enucleado o con su n-
cleo inviable. Los protoplastos enucleados o
citoplastos pueden obtenerse centrifugando
los mismos a alta velocidad en un gradiente
de densidad isosmtico. Asimismo, el mto-
do de irradiacin con rayos X o Gamma pue-
de generar cbridos en casos en que se pro-
duzca la eliminacin total de los fragmentos
cromosmicos. Los protoplastos que poseen
su genoma nuclear completo (receptores),
pueden ser tratados previamente con
inhibidores metablicos. En este caso slo
pueden sobrevivir, por complementacin
metablica, los heterocariones conteniendo
el ncleo del receptor y el citoplasma del do-
nante enucleado.
La segregacin de los plstidos y
mitocondrias de los dos tipos parentales tam-
bin constituye una fuente importante de
variabilidad en la regeneracin de plantas
hbridas. Es frecuente que ocurran
recombinaciones de los genomas mitocon-
driales de ambos tipos parentales, pero ello
es poco comn entre plstidos. Dado que las
organelas segregan independientemente
unas de otras, la regla es que al cabo de po-
cas divisiones mitticas las clulas formadas
contengan plstidos provenientes de uno u
otro tipo parental. As, una clula hbrida ori-
gina una colonia de clulas que exhiben dife-
rentes combinaciones de genes citoplasm-
ticos, pero con una mayor frecuencia de clu-
las que poseen mitocondrias recombinantes
y plstidos de uno u otro tipo parental. El
destino que sufre el material gentico nuclear
y extranuclear durante las divisiones celula-
res determina que, a partir de una poblacin
de clulas hbridas similares, se puedan rege-
nerar plantas con diferentes combinaciones
de genes nucleares, plastdicos y mitocon-
driales.
La Figura 2 muestra un esquema de las
etapas involucradas en la hibridacin
somtica, las cuales son tratadas a continua-
cin.
5 Aislamiento de protoplastos
El desarrollo de mtodos enzimticos de
aislamiento a partir de 1960 brind la posibi-
lidad de obtener grandes cantidades de
protoplastos vegetales. Ello tuvo gran influen-
100
POLCI, Pablo; FRIEDRICH, Pablo
cia en diferentes reas de la biologa y la
biotecnologa de plantas, dada la utilidad de
los protoplastos como sistema experimental
para estudios fisiolgicos, bioqumicos y
moleculares, as como para su aplicacin al
mejoramiento gentico.
Los protocolos de aislamiento emplean
enzimas fngicas con actividad celulasa y
pectinasa, siendo necesario en algunos casos
el agregado de hemicelulasas. Las celulasas y
hemicelulasas degradan la pared celular, en
tanto que las pectinasas digieren la matriz
de pectina que mantiene adheridas a las c-
lulas. El uso de enzimas disponibles comer-
cialmente posibilit el aislamiento de
protoplastos de prcticamente cualquier te-
jido vegetal, siempre que el mismo no est
lignificado. Se ha podido aislar protoplastos
de una gran cantidad de especies vegetales
y regenerar plantas a partir de los mismos,
permitiendo el uso de este sistema para la
propagacin clonal y la modificacin gentica
de plantas.
El nmero de protoplastos aislados, su
viabilidad y la pureza de la suspensin obte-
nida dependen de varios factores, debiendo
establecerse en forma emprica las
condiciones ptimas para un sistema
determinado. Las etapas del aisla-
miento y los factores a considerar en
cada una de ellas se describen a con-
tinuacin:
1. Seleccin del material de
partida. Influye en el resultado del
aislamiento as como en el proceso
de regeneracin posterior. General-
mente se emplean hojas y clulas en
cultivo lquido o slido. Cuando se
emplean hojas, la edad y las condi-
ciones de cultivo de la planta afectan
el rendimiento. Se obtienen mejores
resultados con hojas jvenes total-
mente expandidas que con hojas vie-
jas. (Fig. 3A.). Para facilitar el contac-
to de las enzimas con las clulas, las
hojas suelen cortarse en trozos pe-
queos, muy finos en el caso de las
monocotiledneas. Algunas veces se
extrae la epidermis inferior antes de
colocar la hoja en la solucin
enzimtica, como sucede con las
dicotiledoneas. Cuando se emplean
clulas en suspensin, se obtienen mejores
resultados si se encuentran en la fase
exponencial de crecimiento.
2.Tratamiento enzimtico. La concentra-
cin de la enzima y el tiempo de incubacin
requeridos para lograr la liberacin de los
protoplastos dependen del producto comer-
cial utilizado. El pH generalmente se ajusta
en un rango de 4,7 a 6, y la temperatura en-
tre 25 y 30 C. La duracin del tratamiento
enzimtico y la relacin volumen de solucin/
cantidad de tejido influyen en el rendimien-
to. Durante el aislamiento se produce la lisis
de algunas clulas, que liberan enzimas
hidrolticas y compuestos oxidantes que pue-
den daar los protoplastos, por lo que se
suelen agregar inhibidores de proteasas y
antioxidantes tales como el Polivinilpirroli-
dona-10. El agregado de un estabilizador
osmtico a la solucin enzimtica es esencial
para evitar la ruptura de los protoplastos a
medida que son liberados, siendo ms esta-
bles si la solucin es ligeramente hipertnica.
Para ello se utilizan solutos osmticamente
activos, comnmente manitol o sorbitol, en
concentraciones que varan entre 0,3 a 0,8
Figura 2: Materiales y procesos involucrados en la hibridacin
somtica.
101 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal
M segn el tipo de protoplasto. La solucin
enzimtica es por lo general suplementada
con sales, comnmente CaCl
2
, que incremen-
tan la estabilidad de la membrana (Fig. 3B).
3. Limpieza y purificacin de los
protoplastos. Una vez lograda la liberacin
de los protoplastos, se procede a la remo-
cin de las enzimas y de los restos de tejido
y de clulas rotas. La suspensin se pasa por
un filtro de nylon o metlico con un dime-
tro de poro (30-100 mm) que permita el paso
de los protoplastos y retenga los restos de
tejido y grupos de clulas no digeridas. Pos-
teriormente, se efectan 3 4 lavados
centrifugando la suspensin por 5 minutos a
baja velocidad (50-100 g). Finalmente, los
protoplastos sedimentados se resuspenden
en una solucin salina que contenga un es-
tabilizador osmtico. De este modo se elimi-
nan las enzimas y restos celulares. Para lo-
grar una mayor pureza de la suspensin es
conveniente centrifugarla en un gradiente de
densidad (Fig. 3C). Para el recuento de
protoplastos se emplea un hemocitmetro.
La viabilidad se determina generalmente
empleando colorantes que son incorporados
(rojo neutro, diacetato de fluorescena) o
excluidos (azul de Vean) por las clulas via-
bles; tambin pueden evaluarse la actividad
fotosinttica (emisin de fluorescencia) y la
respiratoria (consumo de O
2
).
6 Mtodos de fusin
6.1 Mtodos qumicos
Los primeros casos informados de fusin
controlada y reproducible de protoplastos
vegetales y de regeneracin de hbridos
somticos se produjeron a principios de la
dcada de 1970, empleando nitrato de sodio
como agente fusgeno. La frecuencia de for-
macin de heterocariones en tales casos era
muy baja. Posteriormente, se lograron me-
jores resultados fusionando protoplastos de
clulas del mesfilo de Nicotiana en un me-
dio conteniendo alta concentracin de Ca
++
(50 mM) y pH elevado (10,5). Sin embargo,
el fusgeno que alcanz mayor aceptacin
es el polietilenglicol (PEG) debido a que, en
comparacin con los otros agentes qumicos,
produce mayor proporcin de heteroca-
riones y, para muchos tipos celulares, resulta
menos txico. Adems, el tratamiento con
PEG genera una mayor proporcin de
heterocariones binucleados, con menor ocu-
rrencia de fusiones entre ms de dos
protoplastos.
El procedimiento de fusin con PEG ms
ampliamente utilizada es, en lo esencial, una
combinacin del mtodo original del PEG y
el de CA
++
y pH elevados. Los protoplastos
de dos tipos parentales se mezclan en una
solucin conteniendo 15 a 45 % de PEG (peso
molecular de 1500 a 6000), durante 15 a 30
minutos. La temperatura de incubacin p-
tima para inducir la fusin es de 35 a 37 C
pero, en la prctica, suele ajustarse a 24 C.
La densidad de protoplastos adecuada para
la formacin de heterocariones es de 4 a 5 %
(volumen de protoplastos/volumen de sus-
pensin). La remocin del PEG se lleva a cabo
en forma gradual, siendo esto fundamental
para asegurar una elevada frecuencia de
heterocariones. Para ello, la suspensin se
somete a sucesivos lavados con una solucin
alcalina (pH 9-11) de CaCl
2
10-50 mM, dismi-
nuyendo progresivamente la concentracin
de PEG con cada lavado.
En la fusin de los protoplastos ocurren,
en forma sucesiva, los siguientes eventos: (1)
las membranas plasmticas de protoplastos
adyacentes entran en ntimo contacto, (2)
se producen alteraciones en sitios localizados
Figura 3: Aislamiento de protoplastos de tabaco. A.
Eliminacin de las nervaduras centrales y seccionado de
la hoja en trozos pequeos. B. Digestin enzimtica de
las paredes celulares. C. Centrifugacin y obtencin de
protoplastos libres de restos de tejidos vegetales.
102
POLCI, Pablo; FRIEDRICH, Pablo
de las mismas, formndose puentes
citoplasmticos entre protoplastos vecinos,
y (3) las interconexiones citoplasmticas se
expanden, provocando la fusin. La carga
negativa neta de la superficie de las mem-
branas produce la repulsin entre ellas; el tra-
tamiento con Ca
++
y pH elevados neutraliza
las cargas superficiales, favoreciendo el con-
tacto entre protoplastos. El PEG actuara
como un puente molecular causando altera-
ciones en las membranas plasmticas que
promueven la adhesin y formacin de puen-
tes citoplasmticos entre protoplastos veci-
nos, producindose finalmente la fusin.
6.2 Electrofusin
En 1973 se descubri que pulsos de ele-
vado potencial elctrico en un rango muy
estrecho de intensidad y duracin conducen
a un incremento reversible, experimental-
mente controlable, de la permeabilidad de
la membrana celular. Este efecto se denomi-
n ruptura elctrica reversible para enfatizar
la habilidad de la membrana para reparar
tales perturbaciones. El voltaje mnimo para
un protoplasto (umbral) con el cual se pro-
duce la formacin de poros disminuye a ma-
yor duracin del pulso elctrico. Este fen-
meno de ruptura reversible tambin es apli-
cado en la tcnica de electroporacin, con la
que se pueden introducir en las clulas cons-
trucciones de ADN y otras molculas de alto
peso molecular.
El mtodo de electrofusin en esencia
involucra dos pasos:
1.Los protoplastos, colocados en un me-
dio de baja conductividad entre dos electro-
dos, se ponen en contacto al aplicar corrien-
te alterna de alta frecuencia (0,5 a 1,5 MHz)
en un campo elctrico no uniforme. Las car-
gas se separan dentro de las clulas forman-
do un dipolo y generando, por lo tanto, un
potencial de membrana. La fuerza del cam-
po a ambos lados de una clula es diferente
(campo no uniforme), dando origen a una
fuerza neta que la empuja a una regin de
mayor intensidad de campo (hacia uno de
los electrodos). Este proceso se denomina
dielectroforesis. La polaridad de la clula
incrementa el campo local no uniforme, atra-
yendo a las clulas vecinas. Luego, los
protoplastos se aproximan unos a otros y
forman cadenas paralelas a las lneas de cam-
po aplicadas (Fig. 4A).
La fuerza ejercida sobre la clula bajo con-
diciones dielectroforticas depende (1) de la
intensidad de campo elctrico, (2) del
gradiente del campo, (3) del volumen del
protoplasto y (4) de la diferencia entre las
constantes dielctricas de la clula y su am-
biente (as como la correspondiente diferen-
cia entre sus conductividades).
2. El segundo paso consiste en la aplica-
cin de uno o ms pulsos cortos de corriente
directa de 15 a 100 seg., con una intensi-
dad de campo elevada (1 a 3 Kv/cm), sufi-
ciente para causar la ruptura reversible de la
membrana. Para que esto ocurra es necesa-
rio que el voltaje crtico de membrana sea
alcanzado en cuestin de nanosegundos a
microsegundos. Ocurre entonces la fusin de
las dos clulas cuyas membranas estn en
estrecho contacto (1 a 2 nanmetros de dis-
tancia). El proceso de resellado es principal-
mente atribuido a las molculas lipdicas de-
bido a que su coeficiente de difusin es dos
rdenes de magnitud mayor que el de las
protenas. Durante este proceso pueden for-
marse puentes lipdicos entre las membranas
de las dos clulas. En otras palabras, las mem-
branas no se vuelven a sellar separadamen-
te en la zona de contacto. Los puentes for-
mados de esta manera, con continuidad
citoplasmtica entre las dos clulas, condu-
cen a un radio de curvatura muy pequeo y
a altas tensiones superficiales. Como conse-
cuencia se forma una nueva clula esfrica,
ya que el proceso es favorecido energti-
camente (Fig. 3B y C). La ruptura es reversi-
ble si el nmero y el tamao de los poros
son pequeos en relacin con el total de la
superficie de la membrana. Fuerzas de cam-
po supra crticas, as como tambin largos
perodos de exposicin, rompen reas ma-
yores de membrana y pueden producir la
destruccin total de la clula
La frecuencia de fusin depende de va-
rios factores:
El genotipo.
La procedencia de los protoplastos
dentro del mismo genotipo. Diferentes po-
blaciones de protoplastos exhiben frecuen-
103 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal
cias de fusin diferentes, aun cuando proven-
gan del mismo genotipo. En general, los
protoplastos obtenidos a partir de hojas se
fusionan ms fcilmente que los provenien-
tes de raz o de cultivos celulares.
El tamao de los protoplastos. Los
ms grandes se fusionan ms fcilmente.
La densidad de los protoplastos.
El nmero, la duracin y la fuerza de
los pulsos de corriente directa. La duracin
del pulso elctrico es de 15 a 50 seg. El tiem-
po requerido para la fusin que sigue a la
aplicacin de un pulso vara desde pocos se-
gundos a varios minutos. Esto probablemen-
te est relacionado a la diferencia de fluidez
de la membrana en los distintos tipos celula-
res y a las propiedades del citoesqueleto den-
tro de la clula.
El medio de fusin. Un factor de limi-
tacin en la agregacin dielectrofortica de
las clulas es la conductividad elctrica del me-
dio; si sta es muy alta, hay mucho flujo de
corriente en la solucin y se producen
calentamientos y turbulencias que impiden
la formacin de cadenas.
El potencial osmtico del medio de fu-
sin. La inclusin de iones en el medio pue-
de incrementar el porcentaje de fusin. Sin
embargo, existe la limitacin de que la
dielectroforesis debe realizarse en un medio
de baja conductividad; el medio de fusin
usualmente consiste en manitol (cuya con-
centracin se ajusta segn los protoplastos
empleados) y CaCl
2
1 mM. Valores bajos de
presin osmtica en el medio de suspensin
de los protoplastos pueden favorecer el pro-
ceso de fusin.
La longitud de las cadenas de
protoplastos formadas durante la dielec-
troforesis, que adems depende de factores
como la densidad de protoplastos, fuerza del
campo elctrico y tiempo durante el cual es
aplicado. Cadenas ms largas darn mayor
frecuencia de fusin que las cadenas cortas.
Pulsos de corriente ms largos y de mayor
voltaje producen un aumento de los even-
tos de fusin mltiple; obviamente, pulsos
muy largos y voltajes muy elevados pueden
matar a los protoplastos.
La composicin y propiedades de la
membrana plasmtica pueden ser afectadas
por la actividad metablica de los
protoplastos y por el tipo de enzimas em-
pleadas en el proceso de aislamiento, influ-
yendo en consecuencia en el proceso de fu-
sin.
Las condiciones experimentales deben
ajustarse de modo de obtener la mayor fre-
cuencia de fusin posible (nmero de
protoplastos fusionados sobre el total de
protoplastos), intentando maximizar la pro-
porcin de heterocariones (productos de la
fusin de protoplastos diferentes) formados
por sobre la de homocariones (productos de
la fusin de protoplastos del mismo tipo
parental), y minimizando la ocurrencia de
eventos de fusin mltiple (fusin de ms de
dos protoplastos). La proporcin de cada uno
de los dos tipos de protoplastos en la sus-
pensin puede fijarse a fin de incrementar la
formacin de heterocariones por sobre la de
homocariones. El tipo de protoplasto con
mayor tendencia a fusionar se mezcla con el
de menor tendencia a fusionar en una rela-
cin de 1:5 a 1:10. As, durante la formacin
de cadenas, los protoplastos ms fusionables
estarn mayoritariamente en contacto con
los menos fusionables, y stos a su vez esta-
Figura 4: Electrofusin de protoplastos de mesfilo de
pasto llorn. A. Dielectroforesis de clulas. Las diferencias
en intensidad de campo elctrico hacen que las clulas
se muevan hacia la zona cercana al electrodo. B.
Aplicacin de pulsos cortos de corriente directa, que
inducen la formacin de poros en la membrana,
generando puentes entre las membranas de las clulas
adyacentes. C. Los puentes con continuidad
citoplasmtica poseen un radio de curvatura muy
pequeo. Las altas tensiones superficiales generadas en
ese sector conducen a la formacin de una nueva clula
esfrica.
104
POLCI, Pablo; FRIEDRICH, Pablo
rn ligados entre ellos mismos. Seleccionan-
do las condiciones duracin y voltaje de los
pulsos que promuevan slo la fusin de los
protoplastos ms fusionables, los productos
sern mayormente heterocariones.
Sin embargo, aun cuando las condiciones
de fusin puedan fijarse de modo de incre-
mentar la frecuencia de fusin y la propor-
cin de heterocariones formados, la fusin
de protoplastos a gran escala (macrofusin),
tanto por mtodos qumicos como elctricos,
resultar en una mezcla de protoplastos
parentales, homocariones y heterocariones.
Esto conlleva la necesidad de emplear mto-
dos de seleccin de los hbridos somticos
obtenidos. Una tcnica alternativa que ofre-
ce la ventaja de no requerir una posterior
seleccin de heterocariones, aunque deman-
da mayor manipulacin, es la microfusin o
electrofusin de pares de protoplastos. Esta
tcnica se basa en los mismos principios que
la electrofusin a gran escala pero est dise-
ada para inducir la fusin en pares seleccio-
nados de protoplastos. Este sistema emplea
microelectrodos de platino fijados a un so-
porte montado debajo del condensador de
un microscopio invertido. Los pares de
protoplastos seleccionados se colocan en
microgotas de medio de fusin sobre un so-
porte, recubiertas por aceite mineral. En cada
evento de fusin, los microelectrodos se
posicionan a cada lado de una microgota
conteniendo un par de protoplastos, y se
aplican los pulsos elctricos. Despus de la
fusin, los heterocariones resultantes son
transferidos a gotas con medio de cultivo
para la posterior regeneracin de plantas
hbridas. La tasa de fusin es de aproxima-
damente 30 pares de protoplastos fusiona-
dos y transferidos a medio de cultivo por
hora, pudiendo alcanzarse frecuencias de fu-
sin cercanas al 50 %.
Ventajas de la electrofusin:
1.El proceso entero puede ser seguido
bajo microscopio por lo que los hbridos pue-
den ser fcilmente identificados y transferi-
dos a un medio nutritivo o selectivo.
2.Puede preseleccionarse el nmero de
clulas a ser fusionadas. Las formaciones de
dos clulas son favorecidas por bajas densi-
dades en la acanaladura entre los electrodos.
Para obtener productos de multifusin de-
ben emplearse elevadas densidades.
3.El proceso de fusin es sincrnico, ya
que el pulso provoca la fusin de todas las
clulas expuestas al campo.
4.Se obtienen elevadas plasmogamia (80
- 100 %) y cariogamia.
5.La viabilidad de las clulas fusionadas
es muy buena.
6.Este mtodo ofrece ventajas sobre otros
como el del PEG, que: -requiere condiciones
no fisiolgicas -las frecuencias de formacin de
heterocariones binucleados son bajas y varia-
bles -resultan txicos para diversos tipos celu-
lares- el fusgeno debe ser removido antes
del cultivo de los protoplastos y tiene bajo
rendimiento de clulas fusionadas.
7 Seleccin de heterocariones
La fusin de protoplastos a gran escala
produce una mezcla de tipos parentales y
productos de fusin. Si no se efecta una
previa seleccin de las clulas hbridas, la re-
generacin de plantas y la posterior identifi-
cacin de los hbridos demandar mucho tra-
bajo y recursos. Dicha seleccin es particular-
mente necesaria cuando se emplean mto-
dos qumicos, que producen una baja pro-
porcin (<10%) de clulas hbridas. Por el con-
trario, los mtodos elctricos no requieren
necesariamente del posterior proceso de se-
leccin dado que normalmente producen fre-
cuencias de fusin muy elevadas o porque,
en el caso de la microfusin, no se generan
mezclas heterogneas de protoplastos de-
bido a que se fusionan dos clulas por vez.
Cualquiera que sea el caso, la condicin de
hbrido debe verificarse en la planta regene-
rada mediante diferentes anlisis que se ex-
plican ms adelante.
La seleccin de clulas hbridas puede lle-
varse a cabo empleando los siguientes m-
todos:
Seleccin sobre la base de caracteres
morfofisiolgicos. En ciertos casos es posi-
ble diferenciar los callos hbridos de los
parentales. Por ejemplo, en algunos cruza-
mientos, los callos hbridos poseen un color
intermedio al de los parentales.
Cuando se produce un cruzamiento en-
tre un parental con capacidad para regene-
105 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal
rar planta con uno recalcitrante, los hbridos
somticos normalmente regeneran plantas,
ya que este carcter se comporta como do-
minante. Si los protoplastos del genotipo
respondedor son tratados con inhibidores
metablicos irreversibles (iodoacetamida,
dietilpirocarbamato, etc.) no sobrevivirn, y
solamente podrn regenerarse los hbridos.
Seleccin por complementacin. La se-
leccin se produce porque el medio de culti-
vo resulta restrictivo para el crecimiento de
los parentales, pero no para el de los hbridos.
La complementacin puede lograrse por las
siguientes vas:
a) Empleando dos parentales con defec-
tos metablicos o genticos no allicos. Si
dichos caracteres son recesivos, la fusin pro-
duce una clula hbrida en la que los defec-
tos se anulan por complementacin. Por
ejemplo, la fusin de dos variedades albinas
no allicas (nucleares) de tabaco, permiti
obtener plantas verdes.
AAbb (albina) x aaBB (albina)

AAaaBBbb (verde)
Asimismo, a partir de dos lneas mutantes
no allicas de tabaco deficientes en nitrato
reductasa, se obtuvieron colonias capaces de
crecer en un medio conteniendo nitrato
como nica fuente de nitrgeno.
b) Fusionando parentales que expresan
caracteres dominantes tales como resisten-
cia a antibiticos o herbicidas. Para ello se
emplea una lnea resistente a cierta droga, y
otra resistente a una segunda droga, efec-
tundose la seleccin de las clulas hbridas
en un medio conteniendo ambas drogas a
concentraciones que resultan letales para las
lneas parentales.
c) Una lnea que presente una mutacin
autotrfica (por ejemplo: albinismo, deficien-
cia a nitrato reductasa) y un carcter domi-
nante (por ejemplo, resistencia a antibiticos
o herbicidas) es de gran utilidad para la se-
leccin. Los hbridos producidos por el cruza-
miento de estos parentales con cualquier
genotipo silvestre pueden ser seleccionados
en medio mnimo suplementado con el anti-
bitico o herbicida, que no permite el creci-
miento de los parentales.
Seleccin por aislamiento de los
heterocariones o clulas hbridas. Es el sis-
tema ms confiable y de ms amplio espec-
tro de aplicacin. El aislamiento puede reali-
zarse de dos maneras:
a) Seleccin mecnica directa utilizando
tcnicas de micromanipulacin con micro-
pipeta. Puede realizarse cuando los proto-
plastos parentales presentan rasgos que los
distinguen al microscopio, permitiendo reco-
nocer las clulas hbridas. Por ejemplo, al fu-
sionar protoplastos del mesfilo (verdes) con
protoplastos de suspensiones celulares (inco-
loros). Tambin pueden colorearse las clu-
las de ambos progenitores con diferentes
colorantes vitales, como el rojo neutro y azul
brillante de cresilo.
b) Citometra de flujo. Los protoplastos
parentales se marcan con diferentes coloran-
tes fluorescentes; por ejemplo, rodamina
(rojo) y fluorescena (verde amarillento). El
aislamiento de los heterocariones marcados
con ambos colorantes se realiza utilizando un
citmetro de flujo (FACS, fluorescence-
activated cell sorter), que es preciso y muy
rpido. El equipo posee fotoclulas que de-
tectan fluorescencia, pudiendo separar los
protoplastos marcados con un solo fluoro-
cromo (parentales) de aqullos doblemente
marcados (hbridos).
8 Cultivo de protoplastos
La habilidad para regenerar plantas a
partir de clulas y tejidos en cultivo es un com-
ponente esencial en la biotecnologa para la
manipulacin gentica y el mejoramiento
vegetal. Esto resulta relativamente fcil para
las dicotiledneas herbceas, pero ha sido
bastante difcil para las monocotiledneas,
particularmente las gramneas.
Los protoplastos se cultivan en cajas de
Petri en medio lquido o semislido, rico en
compuestos orgnicos e inorgnicos, suple-
mentado con reguladores del crecimiento, y
en presencia de un estabilizador osmtico.
Suelen ser cultivados en cajas de Petri con me-
dio agarificado, donde se mezcla la solucin
de protoplastos con un medio de cultivo l-
quido a 40C conteniendo 1,2% de agar,
perferen-temente agarosa (Fig. 5AyB). Los
protoplastos quedan, as, atrapados en el
medio semislido y, luego de varios das, se
ven las colonias formadas (Fig. 5C). Sin em-
106
POLCI, Pablo; FRIEDRICH, Pablo
bargo, el medio lquido da mejores resulta-
dos por varias razones: (a) los protoplastos
de varias especies slo pueden dividirse en
medio lquido, (b) la presin osmtica del
medio puede ser fcilmente reducida a los
pocos das en cultivo, (c) la densidad celular
puede ser modificada agregando medio de
cultivo o las clulas con especial inters pue-
den ser aisladas y cultivadas a alta densidad,
(d) la degradacin de algunos componentes
del medio por la poblacin de protoplastos
puede producir algunas sustancias citotxicas,
cuya concentracin alrededor de las clulas
ser menor en el medio lquido. Una tcnica
muy eficiente que combina medio slido y
lquido es la de cultivo en perlas de agarosa,
donde los bloquecitos con los protoplastos
inmovi-lizados en agarosa son cortados en
cuatro mitades y colocados en medio lqui-
do, donde se cultivan en continua agitacin.
Los protoplastos regeneran la pared ce-
lular luego de uno a cuatro das en cultivo. La
presencia de pared es esencial para lograr una
divisin regular. Luego de dos a tres sema-
nas, producto de mitosis sucesivas, se forman
microcolonias derivadas cada una de una c-
lula, que dos semanas despus se pueden ver
a simple vista. Estos callos son transferidos a
un medio de cultivo y a condiciones apropia-
das para regenerar plantas (Fig. 5).
Los principales factores a tener en cuen-
ta para el cultivo de protoplastos son:
Los requerimientos nutricionales: se han
utilizado en muchos casos los mismos medios
de cultivo que se utilizan en el cultivo de clu-
las y tejidos, pero en general son enriqueci-
dos con vitaminas, azcares, aminocidos,
reguladores de crecimiento y tambin con
aditivos inespecficos como leche de coco,
hidrolizado de casena, extracto de levadu-
ra, etctera.
El potencial osmtico del medio de cul-
tivo: los protoplastos requieren de protec-
cin osmtica antes de regenerar la pared
celular. Normalmente se ajusta con el agre-
gado al medio de cultivo de manitol o
sorbitol.
La densidad celular: la densidad inicial
de protoplastos vara de 10
4
10
5
proto-
plastos/ml de medio de cultivo. Los cultivos
con altas densidades producirn, a partir de
cada protoplasto, colonias que debern se-
pararse tempranamente para evitar quime-
ras. Si deseamos colonias bien separadas para
asegurar que provengan de un solo
protoplasto, la densidad inicial debe ser baja,
de 100 500 protoplastos/ml. Hay proto-
plastos de varias especies y tipos que no lo-
gran dividirse a bajas densidades de cultivo.
Para estos casos se desarroll la tcnica de
cultivo con clulas nodrizas o alimentadoras.
Esta tcnica consiste en exponer una suspen-
sin de 10
6
protoplastos/ml a rayos X a do-
sis que inhiben la divisin celular, pero que
quedan metablicamente activas. Estas c-
lulas se plaquean en un medio agarificado, y
luego se colocan por sobre stas los
protoplastos sin irradiar, de los cuales se for-
marn las colonias. Tambin suele utilizarse
papel de filtro para separarlas de las clulas
nodrizas. Otra tcnica utilizada es el cultivo
en microgota, donde se puede cultivar hasta
un solo protoplasto. Cada microgota
contiene entre 0,25 - 25 l de medio
de cultivo, logrando densidades de 2
4 x 10
3
proto-plastos/ml. Con ayuda de
un micromani-pulador se coloca la clu-
la y se la cubre con aceite mineral para
evitar la deshidratacin del medio.
Los tratamientos fsicos: trata-
mientos de choque elctrico y trmico
estimulan la divisin de los protoplas-
tos.
Las condiciones de cultivo: en ge-
neral los protoplastos son sensibles a
la luz, por lo cual durante el cultivo se
los mantiene en oscuridad o bajo luz
muy tenue.
El origen de los protoplastos: el
Figura 5: Cultivo de protoplastos de tabaco. A. Protoplastos de
mesfilo. B y D. Cultivo de los protoplastos en perlas de agarosa
suspendidas en medio lquido. C. Detalle de la formacin de
callo a partir de protoplastos. E. Callo en medio de regeneracin.
F. Desarrollo de plantas a partir de callos de protoplastos. G.
Planta regenerada.
107 Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal
estado fisiolgico del tejido del cual provie-
nen y la calidad de los protoplastos son muy
importantes para obtener una elevada efi-
ciencia en la respuesta al cultivo.
9 Identificacin de las plantas hbridas
La condicin de hbrido debe verificarse
en la planta regenerada aun cuando se haya
efectuado algn tipo de seleccin para el cul-
tivo de las clulas hbridas. A tal fin es conve-
niente efectuar diferentes evaluaciones, lo
que permite una mejor caracterizacin del
hbrido. Comnmente se llevan a cabo los
siguientes estudios:
1.Morfolgicos. Los hbridos somticos
pueden presentar rasgos morfolgicos carac-
tersticos. Los mismos pueden ser interme-
dios a los de los parentales, la suma de ellos,
u otros completamente nuevos.
2.Citolgicos. El anlisis del complemen-
to cromosmico permite revelar si el hbrido
posee el total de cromosomas de cada
parental, si se han fusionado ms de dos
protoplastos, el grado de aneuploida y posi-
bles translocaciones intergenmicas. Median-
te hibridacin in situ empleando sondas de
ADN repetitivo especfico de especie puede
evaluarse con ms profundidad la contribu-
cin de los genomas parentales y reestructu-
raciones cromosmicas en el hbrido.
3.Isoenzimticos. El patrn de bandas
isoenzimticas del hbrido debe mostrar ban-
das de ambos parentales, pudiendo haber
otras bandas que resultan de nuevas combi-
naciones de las subunidades enzimticas.
Habitualmente se analizan los patrones de
glucosa-6-fosfato deshidrogenasas, fosfoglu-
coisomerasas, glutamato oxalacetato
transaminasas, esterasas, peroxidasas y
fosfatasas cidas. Las isoenzimas son extre-
madamente variables entre tejidos vegeta-
les, por lo que para el anlisis se deben em-
plear los mismos tejidos u rganos, y en el
mismo estado fenolgico.
4.En el mbito del ADN. La demostra-
cin de la presencia de ADN de ambos
parentales es la prueba ms directa de la hi-
bridacin. El anlisis de ADN es independien-
te del tejido empleado y de la edad de la
planta. Puede llevarse a cabo por RFLP
(polimorfismos en la longitud de los fragmen-
tos de restriccin), RAPD (polimorfismos en
el ADN amplificado al azar) o Southern blot,
empleando sondas de ADN repetitivo espe-
cfico de especie o de genes de ARN
ribosomal.
10 Logros y tendencias de la hibridacin
somtica
La hibridacin somtica ha permitido pro-
ducir hbridos que no se haban podido ob-
tener por cruzamientos sexuales, incremen-
tando as el flujo de genes en los cultivos. La
tabla 1 muestra algunos ejemplos de hbridos
somticos que presentan algunas ventajas
agronmicas.
En sus inicios, algunos esperaban que la
hibridacin somtica permitiera producir nue-
vas especies que expresaran las caractersti-
cas deseadas de ambos progenitores. Por
ejemplo, por hibridacin entre tomate y
papa, se busc producir plantas que desarro-
llaran tomates en la parte area y tubrculos
en la raz (pomato). La experiencia mostr
que difcilmente puedan lograrse estos
hbridos espectaculares, debindose ms bien
dirigir la tcnica hacia la introgresin de po-
cos genes silvestres en las especies cultivadas
mediante hibridacin asimtrica o cibridacin,
manteniendo las caractersticas generales del
cultivo.
Uno de los factores que dificulta la ob-
tencin de hbridos simtricos es la progresi-
va prdida de cromosomas de uno de los
parentales, que normalmente ocurre duran-
te la regeneracin. Si bien la fusin de
protoplastos permite sortear las barreras
precigticas, siguen existiendo barreras
genmicas que resultan en la eliminacin es-
pontnea de cromosomas durante las divi-
siones celulares. El mecanismo que determi-
na la eliminacin de cromosomas no est
bien comprendido, pero generalmente se
retienen los cromosomas del parental que
tiene el ciclo celular ms corto. Uno de los
factores que puede producir incompatibilidad
genmica es el estado de diferenciacin de
los tipos celulares involucrados en la fusin.
Por ejemplo, cuando se fusionan clulas en
fase de crecimiento activo con clulas del
mesfilo, que no se dividen, generalmente
se pierden los cromosomas de estas ltimas.
Los hbridos somticos o sexuales entre
especies silvestres y cultivadas contienen
108
POLCI, Pablo; FRIEDRICH, Pablo
muchas caractersticas no deseadas de la pri-
mera, adems de aqullas deseadas. El
retrocruzamiento con la especie cultivada es
requerido para remover los genes no desea-
dos del parental silvestre, pero ello no siem-
pre es posible debido a que los hbridos sue-
len ser estriles. La hibridacin asimtrica y la
cibridacin tienen la ventaja de incorporar
slo uno o pocos caracteres provenientes del
parental silvestre en la especie cultivada, y pro-
ducir plantas con mayor fertilidad.
Algunos caracteres deseables estn codi-
ficados por el genoma extranuclear, tales
como la androesterilidad citoplasmtica y
ciertos tipos de resistencia a enfermedades
y a herbicidas. Para estos casos es de particu-
lar utilidad la cibridacin, dado que es un
mtodo simple para transferir estos genes.
11 Algunos ejemplos
Se han obtenido hbridos intergenricos
de Panicum maximum (+) Pennisetum
americanum (Ozias-Atkins et al., 1986),
Saccharum officinalis (+) Pennisteum
americanum, Oriza sativa (+) Echinochloa
oryzicola, Triticum
monococcum (+)
Pennisetum ameri-
canum, Festuca
arundinacea (+)
Lolium multif lo-
rum. El primer caso
de regeneracin de
plantas maduras de
hbridos interge-
nricos (simtricos y
asimtricos) en gra-
mneas fue el Festu-
lolium.
A pesar de los
esfuerzos realizados,
la aplicacin de esta
estrategia no ha
conducido a la ob-
tencin de nuevos
hbridos de especies
importantes, funda-
mentalmente debi-
do a problemas de
baja o nula fertili-
dad. Los mtodos
actuales de transfe-
rencia de genes ais-
lados han desplazado el inters en la hibri-
dacin somtica. Sin embargo son una exce-
lente herramienta para estudiar las interac-
ciones ncleo-citoplasmticas entre genomas.
12 Lecturas recomendadas
BHOJWANI, S.S.; RAZDAN, M.K. 1996. Protoplast isolation
and culture. Somatic hybridization and cybridization. En:
Plant Tissue Culture: Theory and Practice, Capitulos 12 y
13. S.S. Bhojwani y M.K. Razdan (eds.) Elsevier,
Amsterdam. pp. 337-406.
LINDSEY Y JONES, 1992. Biologa celular de la ingeniera
gentica. En: Biotecnologa vegetal agrcola, Captulo 6.
Editorial ACRIBIA, S.A., Zaragoza. pp.105-142.
MATSUMOTO, K. 2001. Hbridos somticos. Biotecno-
loga Ciencia & Desenvolvimiento, 20,mayo / junio: pp.
26-28.
ZIMMERMANN, U. 1983. Electrofusion of cells: principles
and industrial potential. Trends in Biotechnology, 1,5:
pp. 149-156.
Tabla 1: Ejemplos de hbridos somticos que exhiben
algn carcter de inters agronmico