Caracterización de la savia concentrada de agave y efectos del

almacenamiento sobre el pardeamiento, la capacidad antioxidante y el

contenido de aminoácidos
El agave (Agave spp.) es un género de plantas monocotiledóneas,
monocárpicas, distribuidas por todo el continente americano (Ortiz Basurto et
al., 2008) y de las 293 especies, el 75% se pueden encontrar en México (Good-
Avila et al. , 2006). Esta planta puede ser utilizada como materia prima para la
elaboración de bebidas tradicionales, como el tequila y el mezcal (Narva´ez-
Zapata y Sa´nchez-Teyer, 2009). También se considera como fuente de
ingredientes alimentarios funcionales, como los fructanos prebióticos, y como
planta medicinal. Las hojas y tallos de agave contienen metabolitos bioactivos
que confieren una diversidad de efectos sobre la salud, como anticancerígenos,
antiinflamatorios e inmunomoduladores (Santos-Zea et al., 2012). Las
saponinas, en particular, han sido previamente reportadas en la savia fresca de
agave (Leal-Dı´az et al., 2015), y estos compuestos han mostrado propiedades
farmacológicas, como efectos antiinflamatorios y ulceroprotectores (Mina et al.,
2014) .
La savia de la planta, denominada “aguamiel” en México, es un líquido
compuesto principalmente por azúcares, incluidos los fructooligosacáridos
(Ortiz-Basurto et al., 2008). Este fluido se cosecha exclusivamente de ciertas
especies de agave conocidas como “agaves pulqueros”, incluyendo Agave
americana, A. atrovirens, A. ferox, A. mapisaga y A. salmiana (Escalante et al.,
2008). Cuando la planta alcanza la madurez (8-12 años), se hace una cavidad
en el centro cortando el tallo floral, donde se recolecta manualmente la savia
dos veces al día (Gutiérrez-Uribe y Serna Salvdivar, 2013). Puede consumirse
directamente como bebida, pero debido a su composición y la presencia de
microorganismos endófitos, no es adecuado para el almacenamiento a largo
plazo. De hecho, se han aislado más de 300 cepas de bacterias endófitas de la
base de la hoja de Agave tequilana (Martı´nez-Rodrı´guez et al., 2015). La
savia de agave también se fermenta tradicionalmente para producir una bebida
etanólica suave denominada ''pulque'' (Narva´ez-Zapata y Sa´nchez-Teyer,
2009) o se somete a un proceso térmico para obtener un producto denominado
savia de agave concentrada (CAS). (Gutiérrez-Uribe y Serna Salvdívar, 2013).
La producción de CAS es un proceso artesanal y consideramos que la
información incluida en este manuscrito sería de gran ayuda para entender la
importancia de establecer puntos de ajuste de tiempo y temperatura y estudiar
las características de la savia del agave que debe ser analizada para su uso
como materia prima.
Al igual que en otros alimentos con alta concentración de azúcares y
fitoquímicos, entre ellos la miel, el concentrado de savia de agave puede
presentar cambios en la concentración o transformación de antioxidantes y
otros fitoquímicos con efectos beneficiosos para la salud. Además, se ha
demostrado una relación entre la capacidad antioxidante y una diversidad de
compuestos generados o liberados durante el almacenamiento de la miel
(Brudzynski y Miotto, 2011). En la miel se ha observado oscurecimiento debido
a la formación de compuestos de Maillard, reacciones de deterioro y formación
de complejos de polifenoles con aminoácidos y proteínas. Las propiedades
fisicoquímicas y organolépticas de la miel de cítricos cambiaron durante un año
de almacenamiento debido a la pérdida de compuestos volátiles y azúcares y la
formación de derivados de Maillard (Castro-Vázquez et al., 2008). Se sabe que
la reacción de Maillard ocurre durante el almacenamiento en productos que
contienen azúcar y aminoácidos libres, como miel, jugos concentrados y
mermeladas (Aslanova et al., 2010; Bulut y Kilic, 2009; Selen Burdurlu y
Karadeniz, 2003). Algunos de los marcadores utilizados para analizar este
complejo sistema de reacciones en productos alimenticios incluyen furosina,
carboximetillisina e hidroximetilfurfural (Bastos y Gugliucci, 2015).
El presente estudio se realizó para determinar el efecto del almacenamiento
sobre las principales características de la savia de agave concentrada.
Los parámetros fisicoquímicos (actividad del agua, materia seca, pH, sólidos
solubles, pardeamiento) y la composición química (contenido de azúcares,
proteínas, aminoácidos, saponinas, ácidos fenólicos, productos de la reacción
de Maillard y capacidad antioxidante) se evaluaron durante 20 semanas de
almacenamiento. . Se establecieron correlaciones entre los parámetros
analizados.
2. Materiales y métodos
2.1. Preparación de savia de agave concentrada y condiciones de
almacenamiento
Se obtuvieron de un proveedor comercial (AGMEL, Monterrey, México) tres
lotes diferentes de savia de agave concentrada (CAS), elaborada de manera
artesanal. Cada lote se produjo de la siguiente manera: la savia de agave
(aguamiel) se recolectó de agaves maduros (mayores de 7 años) de la especie
Agave salmiana por medios tradicionales. Luego se mezcló y se concentró a
casi el 10 % de su volumen original calentándolo en una estufa hasta alcanzar
el punto de ebullición (Gutiérrez-Uribe y Serna-Salvdivar, 2013).
El jarabe de color marrón obtenido por este proceso se almacenó en
recipientes de plástico hasta su envío al laboratorio. El primer lote (B1) se
produjo en el estado de Hidalgo, México en julio de 2011. El segundo (B2) y el
tercer lote (B3) se adquirieron en la misma región en noviembre y diciembre de
2013, respectivamente.
El estudio de almacenamiento comenzó 14 días después de que se produjo el
CAS. Cada lote se separó en alícuotas de 50 ml y se almacenó a 25 ± 8 °C y
85 % de humedad relativa en la oscuridad. Cada dos semanas se recolectó
una alícuota hasta completar las 20 semanas. Las alícuotas se almacenaron a
20 8C hasta el análisis.
2.2. Pruebas fisicoquímicas
La materia seca se determinó por medios gravimétricos (AOAC 425.45)
secando a 60 8C en vacío. La muestra líquida (2 g) se mezcló con 0,5 g de
dióxido de silicio seco (Celite 545, Desarrollo de Especialidades Químicas,
Monterrey, México) y se dejó secar durante 24 h.
Se registró el peso antes y después del secado para obtener el porcentaje de
materia seca. La actividad del agua se midió con el instrumento Aqualab con
sensor de punto de rocío (4TEV, Decagon Devices, Pullman, WA, EE. ) con un
refractómetro manual en escala 58–90 8Brix (ATAGO, Tokio, Japón). El índice
de pardeamiento se determinó de acuerdo con un procedimiento utilizado para
evaluar el color del tequila “miel de cocción” (Waleckx et al., 2008), con algunas
modificaciones. La savia de agave concentrada se diluyó 50 veces (p/v) con
agua destilada, se agitó y se sembraron 200 ml en microplacas de 96 pocillos.
La densidad óptica a 490 nm (OD490) se registró en un lector de microplacas
(Synergy HT, Bio-Tek, Winooski, VT, EE. UU.). Los resultados se informaron
como OD490 por gramo de peso fresco CAS (OD490/g fw). El contenido de
proteína se determinó de acuerdo con el método estandarizado AOAC 978.02
micro Kjeldahl y los resultados se informaron como % de peso seco (% dw),
utilizando el factor de conversión N 6.25.
2.3. Determinación de azúcares y aminoácidos libres
Para cuantificar azúcares y aminoácidos, se diluyó CAS 10 veces (7 8Brix) con
agua destilada y se centrifugó a 13.800 g para eliminar la materia en
suspensión (Centrifuge 5804 R, Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Luego, el
sobrenadante se filtró a través de membranas de nailon de 0,22 mm (VWR
International LLC, Radnor, PA, EE. UU.) y se mantuvo a 20 °C hasta que se
llevó a cabo la determinación. Las concentraciones de azúcar se cuantificaron
mediante cromatografía líquida con detección por dispersión de luz evaporativa
(HPLC-ELSD) (Agilent Technologies, 1200 Series, Santa Clara, CA, EE. UU.)
según la aplicación XBridge Amide WA64101 (Waters Corporation, Milford, MA,
EE. UU.). La separación se llevó a cabo en una columna XBridge Amide,
tamaño de partícula 3,5 mm, 250 mm 4,6 mm d.i. (Waters Corporation, Milford,
MA, EE. UU.) con fase móvil A: 80 % de acetonitrilo (ACN) (BDH, Poole, Reino
Unido) y 20 % de agua (BDH, Poole, Reino Unido) con 0,2 % de trietilamina
(Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) (v/v/v) y B: ACN al 30 % y agua al 70
% con trietilamina al 0,2 % (v/v/v) a un caudal de 1 mL/min, usando el siguiente
gradiente: 0 16 minutos, 10 70% B; 16!17 minutos, 70!10% B; 17!30 min,
elución isocrática al 10% B. Las condiciones para ELSD fueron: ganancia 2,
presión 2 bar, temperatura 50 8C, filtro: 0,5 s y tiempo de muestreo 100–10 Hz.
Se usaron D-Glucosa (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.), D-fructosa
(Merck KgaA, Darmstadt, Alemania) y sacarosa (Fluka, St. Louis, MO, EE. UU.)
como estándares, en un rango de 0,5 a 10 mg/mL para cada azúcar. Antes de
la inyección (10 ml), las muestras se diluyeron aún más con agua de grado
HPLC a 1,8 Brix. Los resultados se informaron como % dw.
La concentración de aminoácidos libres se evaluó utilizando el paquete de
química Waters AccQ*Tag (Waters Corporation, Milford, MA, EE. UU.)
mediante cromatografía líquida de alta resolución acoplada a un detector de
fluorescencia (HPLC-FLD). La separación se llevó a cabo en una columna de
análisis de aminoácidos Nova-Pak AccQ*Tag (Waters Corporation, Milford, MA,
EE. UU.) a 37 °C. La fase móvil A constaba de AccQ*Tag Eluent A (Waters
Corporation, Milford, MA, EE. UU.), diluida en una proporción de 1:10 en agua
de grado HPLC y la fase B contenía 60 % de ACN y 40 % de agua (v/v). La
elución se llevó a cabo con el siguiente gradiente: 0,0,5 min, 0,2% B; 0,5 x 15
min, 2 x 7% B; 15!19 minutos, 7!10% B; 19,32 minutos, 10,33% B; 32!34
minutos, 33!100% B; 34!37 min, 100% de elución isocrática; 37!38 min, 100!0%
B; 38!45 min, elución isocrática al 0% B. El flujo fue constante a 1,0 ml/min y el
volumen de inyección fue de 10 ml. Los parámetros del detector se
establecieron en lex/em 250/395 nm. Este método no detectó triptófano,
mientras que el ácido aspártico y la asparagina (ASX, Rt = 13,5 min) y el ácido
glutámico y la glutamina (GLX, Rt = 16,1) se cuantificaron como mezclas en los
tiempos de retención especificados. La calibración se llevó a cabo con una
mezcla de estándares de aminoácidos (12,5–150 pM).
Los resultados se informaron como miligramos por gramo de peso seco de
CAS (mg/g dw).
2.4. Análisis de fenoles totales, capacidad antioxidante y 5-
hidroximetilfurfural
Para la evaluación de los fenoles totales (TP) y la capacidad antioxidante
(AOXC), se produjo un extracto acetónico (ACE) de CAS para minimizar la
interferencia de los azúcares reductores. En experimentos preliminares, se
usaron acetona y metanol para extraer antioxidantes de 17 muestras de CAS,
lo que demostró que la acetona era un mejor solvente para la extracción de
antioxidantes (datos no mostrados). La extracción se realizó utilizando 5 g de
CAS y 10 mL de una solución de acetona destilada al 80% (Desarrollo de
Especialidades Químicas, Monterrey, México) y agua destilada al 20% (v/v) en
una incubadora con agitación (Innova 4000, New Brunswick Scientific). ,
Edison, NJ, USA) a 250 rpm y 30 8C durante 20 min. Es importante señalar
que, con base en experimentos preliminares, estas condiciones de extracción
permitieron la recuperación de 50 a 70% de TP, dependiendo de la
concentración de CAS TP. Pero con fines de comparación, se seleccionaron
estas condiciones para averiguar si TP y AOXC se vieron afectados durante el
almacenamiento de CAS. Se tomó una alícuota de 1 mL para TP y AOXC. El
ACE restante (9 ml) se evaporó hasta sequedad al vacío a 50 °C (Rocket
Evaporator, Genevac Ltd, Ipswich, Inglaterra) y se usó para la extracción con 5-
hidroximetilfurfural (HMF).
Los fenoles totales se evaluaron mediante el método de Folin-Ciocalteau como
se informó anteriormente (Zheng y Wang, 2001). La absorbancia se registró a
765 nm en un lector de microplacas (Epoch, Biotek, Winooski, VT, EE. UU.). Se
utilizó ácido gálico (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) como estándar
(25–150 mg/mL) y los resultados se expresaron como mg equivalentes de
ácido gálico por gramo de peso seco CAS (GAE mg/g dw CAS).
La capacidad antioxidante se determinó de acuerdo con el ensayo de
capacidad de absorción de radicales de oxígeno hidrofílico (ORAC) como se
informó anteriormente (Huang et al., 2002). La fluorescencia se registró a
lex/em = 485/530 nm en un lector de microplacas (Synergy HT, Biotek,
Winooski, VT, EE. UU.). Se usó como estándar ácido ( )-6-hidroxi-2,5,7,8
tetrametil cromano-2-carboxílico (Trolox) comprado en Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO, EE. UU. (25-100 mM), y los resultados se expresaron como Trolox
equivalente mmol por gramo de peso seco CAS (TE mmol/g dw). El 5-
hidroximetilfurfural (HMF) se extrajo de ACE (9 mL), siguiendo un
procedimiento modificado establecido por Mancilla Margalli y Lo´pez (2002). La
ACE seca se disolvió en 5 ml de agua destilada y se repartió con 5 ml de
diclorometano de grado HPLC (Honeywell Burdick and Jackson, Muskegon, MI,
EE. UU.). La fase orgánica se recogió y la fase acuosa se repartió dos veces
más con disolvente fresco. Se utilizó sulfato de sodio (Desarrollo de
Especialidades Químicas, Monterrey, México) para eliminar el agua de la fase
orgánica. El extracto de diclorometano agrupado para cada muestra se secó
bajo un flujo de gas nitrógeno y se almacenó a 20 8C hasta el análisis.
La cuantificación de HMF se determinó mediante cromatografía de gases
acoplada a detector de espectroscopia de masas (GC-MS), modificando un
método informado por Mancilla-Margalli y López (2002). Los extractos secos se
diluyeron en 200–1000 mL de diclorometano y se inyectó 1 mL en modo
dividido 1:5 en un cromatógrafo de gases (Modelo 6890N, Agilent
Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) acoplado a un detector de
espectroscopia de masas (5973N, Agilent Technologies , Santa Clara, CA, EE.
UU.). La separación se llevó a cabo en una columna FFAP de 25 m, 0,32 mm
de d.i., 0,5 mm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) con helio
(AOC, Saltillo, México) como gas portador a un caudal de 1 ml/min. El aumento
de temperatura se inició a 50 8C durante 2 min, seguido de un aumento a 100
8C a una velocidad de 20 8C/min, se mantuvo 1 min a 100 8C y se alcanzó un
aumento a 230 8C a 7 8C/min y se mantuvo durante 30 min . Las temperaturas
del inyector y del detector fueron 250 8C y 150 8C, respectivamente.
La ionización se realizó mediante una fuente de impacto electrónico (EI) a 70
eV. Se utilizó una curva estándar de HMF (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, EE.
UU.) (10–250 mg/mL) para la cuantificación y los resultados se informaron
como HMF mg/g dw CAS. El pico correspondiente a HMF se identificó
mediante el tiempo de retención estándar y se confirmó mediante la biblioteca
de espectros de masas.
2.5. Cuantificación de saponina
La extracción de saponina se modificó de Leal-Dı´az et al. (2015) utilizando 2.5
g de CAS y extrayendo con 50 mL de n-butanol al 50% (Desarrollo de
Especialidades Químicas, Monterrey, México) y agua al 50% (v/v), bajo
agitación a 750 rpm durante 25 min en un incubadora de agitación
(VorTemp1550 Labnet, Edison, NJ, EE. UU.). El extracto se centrifugó (SL16R
Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE. UU.) a 3000 rpm, 4 8C durante
5 min y se recolectó la fase superior. El proceso se llevó a cabo dos veces y los
extractos se agruparon y se concentraron al vacío a 40 °C (Rocket Evaporator,
Genevac Ltd, Ipswich, Inglaterra). El extracto seco se resuspendió en 2 ml de
metanol al 50 % (BDH, Poole, Reino Unido) y agua al 50 % (v/v) y se filtró a
través de membranas GHP de 0,45 mm (Pall Life Sciences, Port Washington,
NY, EE. UU.).
La cuantificación se realizó por HPLC-ELSD (Agilent Technologies, 1200
Series, Santa Clara, CA, EE. UU.). Las condiciones cromatográficas fueron las
mismas reportadas previamente (Leal-Dı´az et al., 2015). La separación se
realizó a 25 °C mediante cromatografía de fase inversa en una columna Zorbax
Eclipse XDB-C18 de 150 mm, 4,6 mm de d.i., 5 mm con una columna de 12,5
mm, 4,6 mm de d.i. precolumna del mismo material (Agilent Technologies,
Santa Clara, CA, EE. UU.), utilizando A: agua con ácido fórmico al 0,1 %
(Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) y B: ACN con ácido fórmico al 0,1 %.
La elución se realizó como sigue: 0,8 min, elución isocrática al 28% de B; 8!28
min, 28!55% B; 28!31 minutos, 55!100% B; 31,38 min, isocrático al 100% B,
38,40 min, 100,28% B; 40!45 min, isocrático al 28% B. La detección se llevó a
cabo utilizando gas nitrógeno; presión, 3,4 bares; temperatura 40 8C; ganancia,
9; tiempo de muestreo, 33 Hz. Los cromatogramas se obtuvieron con
Chemstation para LC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). Se
utilizó hecogenina (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, EE. UU.)
como estándar de cuantificación (10–250 ppm) para sapogeninas y
protodioscina (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) (10–250 ppm) para
saponinas. Los resultados se informaron como mg equivalentes de hecogenina
y protodioscina por gramo de peso seco de CAS (HE mg/g dw CAS y PE mg/g
dw CAS). La metodología utilizada para la identificación de saponinas se puede
encontrar en la información complementaria S3.
2.6. Determinación de los productos de la reacción de Maillard
La determinación de los productos de reacción de Maillard se llevó a cabo
mediante HPLC-DAD (Agilent Technologies, 1260 Series, Santa Clara, CA, EE.
UU.) en CAS diluido 500 veces en metanol al 50 % y agua al 50 % (v/v) y
filtrado a través de GHP de 0,45 mm. membranas (Pall Life Sciences, Port
Washington, NY, EE. UU.). La separación se llevó a cabo en una columna Luna
C18 de 250 mm, 4,6 mm de d.i., 5 mm (Phenomenex Inc., Torrance CA, EE.
UU.), utilizando como fase móvil A: agua pH 2,4 ajustada con ácido
ortofosfórico (Desarrollo de Especialidades Quımi cas, Monterrey, México) y B:
60% metanol y 40% agua (v/v) pH 2.4 ajustado con ácido ortofosfórico. Según
un método para ácidos fenólicos, se obtuvieron cromatogramas a 280 nm y se
registraron espectros de absorción UV-visible (Torres Contreras et al., 2014).
Se utilizó una mezcla de ácidos vanílico, gálico, clorogénico, pcumárico y
ferúlico (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) para identificar por tiempo de
retención. La identificación de los compuestos se llevó a cabo mediante HPLC
acoplada a un detector de tiempo de vuelo de espectroscopia de masas
(HPLC-MS-TOF) (Modelo G1969A Agilent 1100 Santa Clara, CA, EE. UU.). Se
obtuvieron espectros de masas para picos desconocidos para caracterizar la
huella dactilar CAS. Para comparar los tres lotes y los cambios durante el
almacenamiento, se realizó una cuantificación relativa basada en el área bajo
la curva (AUC) de cada pico obtenido a 280 nm de acuerdo con la siguiente
fórmula: AUC factor de dilución=mg CAS dw Se realizó espectroscopía de
masas con el mismo método de elución usando una fuente de electrospray en
modo positivo (ESI+) bajo las siguientes condiciones: rango m/z, 120–600; gas
nitrógeno, 8 L/min; temperatura, 300 8C; presión del nebulizador, 20 psi; voltaje
capilar; 4000 V; voltaje de fragmento, 70 V; y skimmer, 40 V. Los
cromatogramas de iones extraídos se obtuvieron utilizando el software Analyst
QS 1.1 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE. UU.).
2.7. análisis estadístico
Las mediciones se realizaron por triplicado y los resultados se expresaron
como la desviación estándar media. El análisis estadístico se realizó mediante
ANOVA de una vía y las diferencias entre las medias se calcularon mediante la
prueba de Tukey. Se realizó el análisis de correlación de Spearman para
determinar la relación entre las variables. Se utilizó un nivel de significación de
0,05 en todas las pruebas, utilizando el software JMP1 Versión 12 (SAS
Institute Inc., Cary, NC, EE. UU.).
Resultados y discusión
3.1. Caracterización de savia concentrada de agave
Este trabajo reporta por primera vez los cambios ocurridos en la savia
concentrada de agave (CAS) durante el almacenamiento. Hubo diferencias
importantes entre los tres lotes probados. En particular, el primer lote presentó
la menor actividad de agua y materia seca, y lógicamente la mayor
concentración de sólidos solubles (Cuadro 1).
Estos resultados demuestran que el lote 1 (B1) tuvo una mayor exposición al
proceso térmico ya que el único indicador utilizado para detener la
concentración artesanal es cuando el líquido comienza a hervir. El concentrado
de savia de agave del lote 2 (B2) y el lote 3 (B3) fueron similares en términos
de aw y contenido de materia seca, pero los sólidos solubles fueron más altos
para B2. De acuerdo con estos resultados, la aw en CAS fue mayor que en el
jarabe de agave producido a partir de la hidrólisis de fructanos de Agave
tequilana (aw = 0.699), mientras que los SST (70 8Brix) y el contenido de
materia seca (70%) fueron similares (Montan˜ez-Soto et al. ., 2011). Los lotes 1
y 3 tenían un pH similar, mientras que B2 era diferente (pH = 5,0). En todos los
casos los valores de pH fueron inferiores al pH reportado para la savia fresca
de agave o ‘‘aguamiel’’ (pH = 6.0) (Escalante et al., 2008). El pH de CAS fue
muy similar al del jarabe de alta fructosa obtenido de cocer cabezas de agave
para la producción de tequila (pH = 4.5–5.0) (Mancilla-Margalli y Lo´pez, 2002)
y estuvo dentro del rango (pH = 4.1–5.5) reportado en néctar de agave
comercial (Mellado-Mojica y Lo´pez, 2015). También se ha reportado que los
jarabes de A. salmiana tienen un contenido de humedad que oscila entre 20 y
30 %, SST de 70 a 80 8Brix y pH de 3.5 a 5.2 (Mellado-Mojica y Lo´ pez, 2015).
Otra diferencia importante entre lotes se observó en el índice de pardeamiento,
presentando B1 valores 2,4 veces mayores que B2 y B3. Se ha informado que
el jarabe de agave, así como el líquido azucarado que se usa para la
producción de tequila, es de color marrón oscuro debido a la formación de
compuestos de Maillard (Montan˜ez-Soto et al., 2011; Waleckx et al., 2008).
La fructosa (1) y la glucosa (2) fueron más abundantes que la sacarosa (3) solo
en B1 (Fig. 1). En los tres lotes analizados el contenido de fructosa fue inferior
al 20,7% (Cuadro 1) de acuerdo con reportes previos que mostraban que los
jarabes de A. salmiana tenían un contenido de sacarosa de hasta 32% en
contraste con los obtenidos a partir de los jarabes de A. tequilana que tenía
más del 60% de fructosa (Mellado-Mojica y Lo´pez, 2015). La concentración de
sacarosa en B2 y B3 fue mayor que la observada para B1 (Cuadro 1), lo que
indica una posible hidrólisis durante el calentamiento prolongado que también
produjo una savia de agave concentrada más oscura.
El contenido de proteína fue mayor en B2 que en B1 o B3 (Cuadro 1). B1 tenía
el contenido de aminoácidos libres más bajo (Tabla 1). El perfil de aminoácidos
fue diferente para los tres lotes estudiados (Tabla complementaria S1), pero la
cisteína no estuvo presente de manera consistente en ninguno de ellos,
comparable a los resultados informados para la savia de agave no concentrada
(Ortiz-Basurto et al., 2008). La prolina fue el aminoácido libre más abundante
en B1 y el ácido aspártico en B2 y B3 (Tabla complementaria S1). El contenido
de fenoles totales (FT) y la capacidad antioxidante (AOXC) de ACE fueron dos
veces mayores para B1 que para B2 y B3 (Tabla 1). La concentración de PT en
B1 fue similar a la reportada para extractos de hojas de Agave atrovirens
(1.072–1.338 mg GAE/g dw (Olvera-Garcia et al., 2015).
3.2 Cambios observados durante el almacenamiento de savia concentrada de
agave
La actividad del agua, la materia seca, los sólidos solubles totales y el pH no
mostraron cambios significativos durante el almacenamiento (Fig. S2
complementaria).
El pardeamiento aumentó linealmente de 57 a 88 OD490/g fw después de 20
semanas de almacenamiento de B1 (Fig. 2a). Para B2 y B3, incluso después
de 20 semanas de almacenamiento, el pardeamiento no alcanzó el valor inicial
observado para B1. Un fenómeno similar se observó en un estudio de miel
almacenada durante 90 días a 37 °C, en el que los autores concluyeron que el
color inicial se correlacionó con el grado de pardeamiento que se produjo
durante el almacenamiento (Gonzales et al., 1999).
Adicionalmente, se ha observado una relación entre el contenido de humedad y
los cambios de color en la miel, demostrando que un contenido de humedad
más bajo acelera las reacciones de oscurecimiento (Bulut y Kilic, 2009), y es de
destacar que B1 tuvo una actividad de agua y humedad más baja que B2 y B3.
El aumento del pardeamiento también se ha observado en productos con un
contenido de SST similar (70 8 Brix), como los concentrados de jugo de
manzana (Selen Burdurlu y Karadeniz, 2003), así como diversas mermeladas
de frutas (Aslanova et al., 2010; Rababah et al. ., 2014). Curiosamente, la
AOXC de B1 aumentó de 18 a 23 TEmmol/g dw CAS después de 20 semanas
(Fig. 2b), un cambio que no se observó para B2 y B3. Contrariamente a estos
resultados, la capacidad antioxidante de la miel disminuyó después de 6 meses
de almacenamiento incluso si el contenido fenólico total se mantuvo estable
(Wang et al., 2004). El TP no cambió significativamente durante el
almacenamiento de 20 semanas en ninguno de los tres lotes analizados en
este estudio (Fig. S2 complementaria).
Se ha informado de 5-hidroximetil-furfural (HMF) en productos de agave que se
someten a hidrólisis térmica de inulina y fructooligosacáridos para producir
jarabes azucarados. Este compuesto se encontró en concentraciones
superiores a los 82.6 mg/g alcanzados en el presente estudio (Fig. 2c) en jugo
de Agave tequilana hidrolizado térmicamente (Mancilla-Margalli y Lo´pez, 2002;
Waleckx et al., 2008).
A lo largo del almacenamiento, HMF en B1 disminuyó durante las primeras 8
semanas, luego aumentó significativamente de las semanas 10 a 14 y se
redujo hacia la semana 20. Se produjo una tendencia general decreciente de la
concentración de HMF en relación con el tiempo para B2. Por el contrario, HMF
en B3 disminuyó durante las primeras 10 semanas y aumentó hacia el final del
estudio a niveles similares al valor inicial. Curiosamente, se ha observado un
comportamiento similar para los compuestos relacionados con la reacción de
Maillard producidos durante la hidrólisis de inulina de los exudados de Agave
tequilana para la producción de tequila (Mancilla-Margalli y López, 2002).
Los cambios en la concentración de azúcar durante el almacenamiento fueron
diferentes entre lotes. B2 no tuvo cambios significativos en ninguno de los tres
azúcares analizados (Fig. 2d), como se informó anteriormente para la miel
nigeriana almacenada durante 24 meses a temperatura ambiente (Fasasi,
2012). Para B1, la concentración de azúcares aumentó de 53 a 65%, lo que
indica una posible hidrólisis de fructanos, aunque se requiere un estudio
adicional para validar esta hipótesis. En B3 solo la concentración de glucosa
cambió significativamente (Fig. 2d).
Correlaciones negativas significativas (valor p < 0,0001) (r definido como el
coeficiente de correlación de Spearman) entre el índice de pardeamiento y los
aminoácidos serina (SER, r = 0,91), fenilalanina (PHE, r = 0,89) y lisina (LYS, r
= 0,88) se observaron para B1. Estos tres aminoácidos disminuyeron
notablemente durante 20 semanas, alcanzando una concentración inicial de
29,4%, 50% y 30% (Fig. 3a). Esta disminución no se observó en B2 y B3 (Fig.
3b y c). Otros aminoácidos, como el ácido glutámico/glutamina, treonina,
metionina, histidina, tirosina, glicina y leucina (Tabla complementaria S1)
también tuvieron una correlación con el pardeamiento observado en B1 (valor p
<0,001).
Se ha detectado pérdida de aminoácidos libres durante el almacenamiento en
la miel (Iglesias et al., 2006), posiblemente debido a su conversión a derivados
de pardeamiento no enzimático (Sanz et al., 2003).
3.3. Determinación del contenido de saponina
Según los espectros de masas obtenidos (Información complementaria S3), se
detectaron dos kammogenina (4, 5), tres manogenina (6, 7, 8) y una
hecogenina (9) glucósidos en diferentes concentraciones entre los lotes de
CAS (Fig. 4 ). El compuesto 4 correspondió al magueyoside A y el 6 al
magueyoside B, ambos aislados de flores de agave (Perez et al., 2013) y
encontrados en savia fresca de agave (Leal-Dı´az et al., 2015). El compuesto 9,
agavoside C0, se identificó en las hojas de varias especies de agave (Bodeiko
y Kintya, 1975; Chen et al., 2011), y también se encontró en flores (Perez et al.,
2013) y savia fresca de agave ( Leal-Dı´az et al., 2015).
Los glucósidos más abundantes en B2 y B3 fueron el 5 y el 6, cuantificados
como la suma de ambos picos y representando la mitad de la cantidad total de
saponinas (Tabla 2). Por otro lado, B1 mostró un perfil diferente, con 4 como el
compuesto más abundante para este lote, 40% de la suma de saponinas
(Cuadro 2). De las sapogeninas, solo se encontró kammogenina (espectro de
masas en la información complementaria S3) en forma libre en los tres lotes, y
se encontraron cantidades mayores en B2 y B3 que en B1 (Tabla 2). Mientras
tanto, la manogenina solo se cuantificó en B2 (8 HE mg/g dw).
La concentración de saponina fue diferente entre los lotes, con B2 (>400 mg de
PE/g de peso seco) que contenía la mayor cantidad, seguido de B3 (330 mg/g
de peso seco) y B1 (>200 mg/g de peso seco) (Tabla 2). El contenido de
saponina no se alteró significativamente debido al almacenamiento después de
20 semanas en todos los lotes estudiados. CAS contenía de 3,5 a 7,5 veces la
cantidad de saponinas en comparación con la savia fresca de Agave salmiana
inmadura (Leal-Dı´az et al., 2015). En este estudio, la concentración de
saponina se correlacionó positivamente con la actividad del agua (valor p =
0,02, r = 0,73) y negativamente con el pardeamiento (valor p = 0,03, r = 0,71).
3.4. Análisis de los productos de la reacción de Maillard
El cromatograma a 280 nm (Fig. 5a) mostró picos predominantes en los
primeros 15 min de análisis. Los más abundantes en los tres lotes fueron los
que eluyeron a los 4,1 (10), 9,2 (11) y 10,1 min (12). Los tiempos de retención y
los espectros de absorción UV no se correspondieron con los estándares de
ácido fenólico utilizados para la comparación, ni con los derivados del ácido
cinámico y del ácido benzoico reportados previamente en productos de agave
(Almaraz-Abarca et al., 2013).
Por lo tanto, los compuestos medidos a través del método de Folin-Ciocalteau
(Cuadro 1) no necesariamente corresponden a compuestos fenólicos, sino a
otros compuestos reductores. Informes en la literatura han indicado que los
productos de la reacción de Maillard pueden causar una sobreestimación de los
fenoles totales por Folin-Ciocalteau (Ghedolf et al., 2002).
El compuesto 10 (Fig. 5b) tuvo una absorción máxima a 224 y 288 nm y un ion
pseudomolecular m/z 381,10 [M+H]+. Aunque no se obtuvo una identidad
exacta, los espectros de absorción UV-visible fueron similares a los observados
para los productos de reacción de Maillard obtenidos en sistemas modelo de
azúcar-aminoácido (Yu et al., 2012). El compuesto 11 (Fig. 5c) presentó un
máximo UV a 296 nm y un ion molecular m/z 144,07 [M]+ y, por lo tanto, se
identificó como 2,3-dihidro-3,5-dihidroxi 6-metil-4H- pirano 4-uno (DDMP).
Según informes en la literatura, DDMP tiene un máximo de UV a 296 nm y un
ion molecular característico m/z 144. Además, este compuesto también se
detectó en el extracto de diclorometano analizado por GC-MS, donde se
observaron los iones característicos m/z 144, 115, 72, 55 y 43 (Yu et al., 2013).
Los espectros de absorción del compuesto 12 (Fig. 5d) tenían dos máximos a
228 y 284 nm y un ion pseudomolecular m/z 255.1 [M+H]+, correspondiente al
producto de Amadori conocido como furosina (Baptista y Carvalho, 2004). La
furosina ha sido reportada en la miel como indicador de calidad (Sanz et al.,
2003).
Los tres picos se encontraron en B1, B2 y B3 y se observaron cambios con el
tiempo de almacenamiento. El compuesto 10 solo aumentó con respecto al
tiempo en B1, alcanzando su máximo en las semanas 16 y 18 (Fig. 5e). La
concentración de DDMP disminuyó notablemente durante el almacenamiento
de los tres lotes analizados (Fig. 5f). En el caso de B1, la furosina duplicó su
concentración durante 20 semanas de almacenamiento, pero en B2 se
encontró en concentraciones más bajas y disminuyó durante el
almacenamiento (Fig. 5g).
La misma tendencia decreciente se observó para B3, pero con una
concentración inicial superior a la observada para B1 o B2, llegando casi a la
mitad de su valor inicial. La furosina se ha detectado como uno de los primeros
productos de la reacción de Maillard en alimentos sometidos a procesamiento
térmico (Silvan et al., 2006), y se correlacionó con la capacidad antioxidante en
un sistema modelo generado a partir de proteínas de cereales hidrolizadas y
glucosa (Zilic´ et al., 2012).
En este estudio, AOXC se correlacionó positivamente con la concentración de
furosina en B1 (r = 0,60, valor de p = 0,0014), pero no fue el caso para B2 o B3
ya que no se observó un aumento significativo en AOXC o furosina. En general,
una de las diferencias más importantes entre los lotes fue la concentración de
saponina. Cuando CAS tuvo un mayor contenido de saponina, el índice de
pardeamiento fue menor. El índice de pardeamiento aumentó más rápidamente
durante las 20 semanas de almacenamiento para B1. Este lote tuvo el índice
de pardeamiento inicial más alto en comparación con B2 y B3.
El pardeamiento se correlacionó positivamente con la capacidad antioxidante y
negativamente con la concentración de aminoácidos, particularmente con LYS,
PHE y SER. No se detectaron compuestos fenólicos en este estudio, pero la
concentración de furosina en B1 se correlacionó positivamente con la
capacidad antioxidante y el índice de pardeamiento.