Articulo #1 en Ingles-Carbohidratos

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En t. J. Mol. ciencia 2012, 13, 83988429; doi:10.3390/ijms13078398
ACCESO ABIERTO
Revista Internacional de
Ciencias Moleculares
ISSN 14220067
www.mdpi.com/journal/ijms
Revisar
Función y estructura 3D de los Nglicanos en glicoproteínas
Masamichi Nagae y Yoshiki Yamaguchi *
Equipo de Glicobiología Estructural, RIKEN, Instituto de Ciencias Avanzadas, 21 Hirosawa, WakoCity, Saitama
3510198, Japón; Correo electrónico: mnagae@riken.jp
* Autor a quien debe dirigirse la correspondencia; Correo electrónico: yyoshiki@riken.jp;
Tel.: +81484679619; Fax: +81484679620.
Recibido: 31 de mayo de 2012; en forma revisada: 18 de junio de 2012 / Aceptado: 28 de junio de 2012 /
Publicado: 6 de julio de 2012
Resumen: La glicosilación es una de las modificaciones postraduccionales más comunes en las células eucariotas
y juega un papel importante en muchos procesos biológicos, como la respuesta inmune y los sistemas de control
de calidad de las proteínas. Ha sido notoriamente difícil estudiar las glicoproteínas mediante cristalografía de rayos
X, ya que los restos de glucano suelen tener una estructura y conformación química heterogénea y, a menudo, son
móviles. No obstante, los avances técnicos recientes en la cristalografía de glicoproteínas han acelerado la
acumulación de información estructural 3D. El análisis estadístico de "instantáneas" de glicoproteínas puede
proporcionar pistas para comprender sus aspectos estructurales y dinámicos. En esta revisión, proporcionamos
una descripción general de los análisis cristalográficos de glicoproteínas, en los que se observa claramente la
densidad de electrones del resto de glicano. Estas estructuras bien definidas de Nglicanos se atribuyen en la
mayoría de los casos a interacciones carbohidratoproteína y/o carbohidratocarbohidrato y pueden funcionar como
"pegamento molecular" para ayudar a estabilizar las interacciones intermoleculares e intramoleculares. Sin embargo,
los Nglucanos más móviles en los receptores de la superficie celular, cuya densidad de electrones suele faltar en
la cristalografía de rayos X, parecen guiar al ligando asociado a su sitio de unión y previenen la agregación irregular
de proteínas al cubrir los sitios de oligomerización lejos del ligando. sitio de unión.
Palabras clave: glicoproteína; glicoforma; Nglicano; cristalografía de proteínas
Abreviaturas: GlcNAc, NacetilDglucosamina; Hombre, Dmanosa; Gal, Dgalactosa; Sia, ácido siálico; Glc, D
glucosa; Fuc, Lfucosa; GnT, Nacetilglucosaminiltransferasa; cho,
ovario de hámster chino; HEK, riñón embrionario humano; IgG, inmunoglobulina G; f.c.,
En t. J. Mol. ciencia 2012, 13 8399
fragmento cristalizable; ADCC, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos; FcRn, neonatal
receptores Fc; NA, neuraminidasa; APA, espinas de arilforina de Antheraea ; Trβgal,
Trichoderma reesei βgalactosidasa; TLR, receptor tipo Toll; ICAM, molécula de adhesión intracelular
1. Introducción
La glicosilación es una modificación común y muy diversa de las proteínas y ocurre durante o después de la síntesis
de proteínas [1]. Más del 50% de las proteínas eucariotas están glicosiladas [2]. La glicosilación altera profundamente
el comportamiento de las proteínas, haciéndolas más solubles, protegiéndolas de la proteólisis, cubriendo los sitios
antigénicos y alterando la orientación de las proteínas en las superficies celulares. La importancia de la glicosilación de
proteínas se está reconociendo ampliamente a través de estudios sobre la localización y el tráfico de proteínas, la vida
media biológica y las investigaciones de las interacciones célulacélula.
En casi todas las glicoproteínas, las unidades de carbohidratos están unidas al esqueleto de la proteína por enlaces N
u Oglucosídicos o ambos. Los Nglucanos se unen covalentemente a las proteínas en la amida de los residuos de
asparagina (Asn), formando un enlace Nglucosídico. La secuencia de consenso para la Nglicosilación, llamada sequon,
es AsnXSer/Thr, donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. En la Oglicosilación, el glucano se une a
las cadenas laterales de los residuos de serina o treonina. A diferencia de la glicosilación ligada a N, no se ha informado
ninguna secuencia de consenso que defina un sitio de glicosilación ligada a O.
Figura 1. (a) Estructuras químicas representativas de Nglicanos con alto contenido de manosa y de tipo
complejo. (b) Vías de procesamiento de Nglicanos en células de mamíferos. Se muestran las enzimas y
estructuras de los Nglicanos intermedios . Glc I, αglucosidasa I; Glc II, αglucosidasa II; ER Man, ER α
manosidasa; αManI, αmanosidasa I; GnT I, βNacetilglucosaminiltransferasa I; αManII, αmanosidasa
II; GnT II, βNacetilglucosaminiltransferasa II; β4GalT, β1,4galactosiltransferasa; SiaT, sialiltransferasa;
GnT III, βNacetilglucosaminiltransferasa III; GnT V, βNacetilglucosaminiltransferasa V; y α1,6
fucosiltransferasa, Fut8.
Figura 1. Continuación.
El Nglicano humano se compone típicamente de NacetilDglucosamina (GlcNAc), Dmanosa (Man), Dgalactosa
(Gal), ácido siálico (nombre general del ácido Nacetilneuramínico, que puede abreviarse como Sia o Neu5Ac), residuos
de Dglucosa (Glc) y Lfucosa (Fuc). El Nglicano se clasifica en tres grupos: tipo alto en manosa, tipo híbrido y tipo
complejo. Las estructuras químicas representativas de los glicanos con alto contenido de manosa (Man9GlcNAc2) y de
tipo complejo biantenario (Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2) se muestran en la Figura 1a. Ambos tipos contienen estructuras
centrales Man3GlcNAc2 . En el glicano de tipo alto en manosa, las cadenas Manα12Manα12Man, Manα12Manα13Man
y Manα12Manα16Man se designan como brazos D1, D2 y D3, respectivamente. En el glucano de tipo complejo
biantenario, las cadenas de oligosacáridos ramificados α13 y α16 (Galβ14GlcNAcβ12Man) se denominan brazos
α13 y α16, respectivamente.
El precursor de N glucano (Glc3Man9GlcNAc2) se ensambla en un transportador de lípidos, doliquipirofosfato (DolPP),
y se transfiere a una cadena polipeptídica mediante la oligosacariltransferasa (OST) en el lumen del retículo
endoplásmico (RE) (Figura 1b). El Nglicano adjunto es procesado secuencialmente por varias glicosilhidrolasas y
transferasas. Tres residuos de glucosa y uno de manosa se eliminan inmediatamente mediante glucosidasa I, II y ER
αmanosidasa. La eliminación de los residuos de glucosa está estrechamente relacionada con el plegamiento de las
glicoproteínas. El procesamiento adicional de los Nglucanos se produce a lo largo de la vía secretora a medida que la
glicoproteína correctamente plegada se mueve a través del aparato de Golgi hasta su destino final. La etapa inicial de
la ruta consta de varios pasos de recorte por parte de la αmanosidasa I que generan un intermediario clave,
Man5GlcNAc2. En el aparato de Golgi, la conversión de glucano de tipo alto en manosa a glucano de tipo híbrido se
inicia por la acción de la Nacetilglucosaminil transferasa I (GnT I), que transfiere GlcNAc, en un enlace β12, al brazo
α13. residuo de manosa del sustrato Man5GlcNAc2 . El glicano de tipo híbrido se remodela aún más mediante una
serie de enzimas para producir Nglicanos de tipo complejo. Existen varias vías que aumentan la heterogeneidad de los
Nglucanos, incluidas la Nacetilglucosaminiltransferasa III (GnT III), V (GnT V) y α1,6fucosiltransferasa (Fut8)
(Figura 1b). GnT III cataliza la adición de GlcNAc a través de un enlace β14 al βMan del núcleo de manosilo de N
glicanos. Esta GlcNAc se designa como "GlcNAc de bisección" y está involucrada en la supresión de la metástasis del
cáncer [3]. GnT V cataliza la adición de una unidad GlcNAc unida por β16 a Man unida por α16 del núcleo de
trimanosilo de los glicanos unidos por N para formar ramas triantenarias o tetraantenarias [4].
Fut8 introduce un residuo de fucosa en la GlcNAc más interna del tipo complejo biantenario unido a N
oligosacáridos a través de un enlace α16 [5] (Figura 1b). Esta reacción se denomina "fucosilación del núcleo" y el
residuo de Fuc se denomina "fucosa del núcleo". Cada glicosiltransferasa tiene una especificidad de sustrato única que
determina la estructura del Nglucano. Por ejemplo, la acción de GnT V y Fut8 se inhibe por la presencia de un residuo
GlcNAc bisectriz. A través de estas modificaciones, el glicano de tipo complejo a menudo se ramifica y contiene un
núcleo de trimanosilo, varios residuos de GlcNAc, Gal, ácido siálico y Fuc, lo que resulta en un alto nivel de complejidad
(Figura 1b).
La información estructural en 3D sobre las glicoproteínas ayuda a comprender la función de los Nglucanos.
Sin embargo, la flexibilidad inherente del glicano dificulta el análisis cristalográfico de rayos X. En realidad, los cristales
de glicoproteínas con calidad de difracción normalmente solo se obtienen después de la abolición del sitio de glicosilación
mediante mutagénesis dirigida al sitio o tratamiento de desglucosilación enzimática [68]. El número de glicoproteínas
resueltas por rayos X o RMN representa menos del 3% del número total de estructuras 3D reportadas en el Protein Data
Bank (PDB) [9]. Sin embargo, las mejoras significativas en los métodos experimentales han llevado a un aumento en el
número de estructuras de glicoproteínas resueltas con residuos de carbohidratos bien definidos. Se han desarrollado
diversas metodologías que utilizan sistemas de expresión de mamíferos para la producción de grandes cantidades de
glicoproteínas homogéneas. Las células de ovario de hámster chino (CHO)lec 3.2.8.1 [10] y las células deficientes en
GnT I 293S de riñón embrionario humano (HEK) [11] son adecuadas para producir glicoproteínas para la cristalización.
Dado que ambas líneas celulares carecen de actividad GnT I, se puede producir una glicoproteína uniforme con el
oligosacárido unido a N truncado, Man5GlcNAc2 (Figura 1b). Además, el cultivo conjunto de células de mamíferos con
un inhibidor de la Nglicosilación, kifunensina o swainsonina, reduce la heterogeneidad química de la glicoforma del
producto y se puede desglicosilar fácilmente con endoglicosidasa (Figura 1b, [12]). Otros sistemas de expresión
eucarióticos, como células de levadura e insectos, también están disponibles para producir proteínas homogéneas para
cristalografía. Sin embargo, en los sistemas de expresión de hongos e insectos, el glicano ligado a N maduro es
generalmente del tipo heterogéneo alto en manosa, mientras que los Nglicanos humanos son principalmente tipos
híbridos o complejos. Dado que la estructura del glicano depende del tipo de célula de expresión, la relación entre la
glicoforma y su función fisiológica necesita una inspección cuidadosa.
Los análisis estadísticos previos de los datos de difracción de rayos X disponibles sobre los oligosacáridos [9,13,14]
identificaron las conformaciones energéticamente favorables para los enlaces de azúcar individuales.
El portal web GLYCOSCIENCES.de [15] y el Glycoconjugate Data Bank [16] ofrecen formas convenientes de buscar
estructuras de carbohidratos en el PDB. En esta revisión, presentamos varios ejemplos en los que los glicanos afectan
las interacciones intramoleculares e intermoleculares. Los glicanos a menudo se estabilizan para asumir estructuras
altamente ordenadas a través de extensas interacciones proteínacarbohidrato o carbohidratocarbohidrato. También
presentamos varias estructuras de glicoproteínas de superficie celular donde los glucanos parecen ayudar en el
reconocimiento adecuado de ligandos y prevenir la agregación de proteínas, aunque muchos de estos glucanos tienen
estructuras desordenadas.
2. Los glucanos conservados median las interacciones entre subunidades de las proteínas (fragmento Fc y
neuraminidasa de la gripe)
2.1. El Nglicano en el fragmento Fc afecta las interacciones intra e intermoleculares
2.1.1. Descripción general de NGlycan of Fc Fragment
Las inmunoglobulinas son glicoproteínas en forma de Y que participan en el componente adaptativo del sistema inmunitario
que se dirige contra los patógenos extracelulares. La diversidad estructural de sus sitios de unión a antígeno les permite unirse
específicamente a millones de moléculas estructuralmente únicas.
La inmunoglobulina G (IgG) consta de dos cadenas ligeras y dos pesadas y comprende tres partes independientes conectadas
a través de un enlace flexible o bisagra (Figura 2a). Dos de estos, los fragmentos Fab, son idénticos en estructura, cada uno
con un sitio de unión específico de antígeno. El tercero, el fragmento Fc, tiene una estructura muy conservada incluso entre
diferentes isotipos [1720]. Tiene funciones efectoras de anticuerpos como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos
(ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) a través de su interacción con los receptores de linfocitos
(receptores Fc, FcγRs) en células efectoras como las células asesinas naturales o con el componente C1q de complementar.
El fragmento Fc es un dímero y muestra una disposición en forma de herradura de dos dominios sándwich β antiparalelos,
denominados CH2 y CH3, conectados por un conector corto y flexible (Figura 2a). La interacción entre las subunidades se
produce principalmente a través del par de dominios CH3 . Estos dos dominios forman un dímero no covalente compacto con
un área superficial enterrada de ~1000 Å2. Un glucano de tipo complejo biantenario se une a cada Asn297 en los dominios
. disialilación,
CH2 [17]. Las características
de la Nglicosilación
de Fdc
poca bisección incluyen
e uuna
GlcNAc, baaja
na lta incidencia de m onosialilación,
central y haeterogeneidad
fucosa usencia de de
residuos de galactosa [21]. La glicoforma particular del fragmento Fc impacta en su función fisiológica.
Se sabe que la eliminación de fucosa mejora la actividad de ADCC tanto in vitro [22] como in vivo [23]. Además, el contenido
de galactosa de la IgGFc humana se correlaciona inversamente con la progresión de la enfermedad en la artritis reumatoide
y otras enfermedades autoinmunes [24]. La actividad antiinflamatoria de la Ig intravenosa (IVIG) se puede recapitular con una
preparación completamente recombinante de fragmentos IgG Fc apropiadamente sialilados [25]. Por lo tanto, la manipulación
de las estructuras de glicanos de Asn297 ha surgido como una estrategia para modular las funciones efectoras de los
anticuerpos terapéuticos [26,27].
Los estudios cristalográficos de rayos X pioneros del dominio Fc de IgG1 humana aislada [17] y la IgG de conejo [28] han
demostrado que las dos cadenas conservadas de Nglucano de Fc están bien definidas, con el oligosacárido unido a las
superficies de los dominios CH2 . Desde entonces, nuestro conocimiento estructural de los fragmentos Fc y sus glicanos ha
crecido sustancialmente. A partir de marzo de 2012, hay más de 30 entradas de PDB. Las estructuras que contienen
fragmentos Fc glicosilados se resumen en la Tabla 1. En la Figura 2b se muestra una estructura representativa de IgG1 Fc
humana y su Nglicano. El brazo α16 del Nglicano de Asn297 contacta con dos residuos hidrofóbicos, Phe241 y Phe243, y
forma varios enlaces de hidrógeno con Lys246, Asp265 y Arg301 (Figura 2b). Un núcleo Fuc se encuentra en las cercanías de
Tyr296 y afecta indirectamente el modo de hidratación de Tyr296 [29]. Por el contrario, Tyr313, que corresponde a Tyr296 en
la IgG1 humana, forma enlaces de hidrógeno directos con un residuo central de Fuc en la estructura de la IgG2a del ratón [19].
Figura 2. (a) La estructura general de la inmunoglobulina G (código PDB; 1igt) se muestra en un modelo de cinta.
Una cadena ligera y dos cadenas pesadas se muestran en beige, azul y cian, respectivamente.
Los residuos de carbohidratos unidos a la región Fc se muestran en modelos de esfera. ( b ) Vista de primer
plano del glicano unido a Asn297 de IgG1 Fc humano (código PDB; 2dts). El resto de carbohidratos y los
residuos de aminoácidos que interactúan con el Nglicano se muestran en el modelo de varillas.
Los enlaces de hidrógeno entre proteínas y carbohidratos se muestran como líneas de puntos rojos.
Tabla 1. Resumen de estructuras de fragmentos Fc.
ID de PDB Estructura de glicanos * Referencia de resolución
Fragmento Fc de IgG1 humana producido por célula HEK293T + kifunensina
M7GN2 (cadenaA) 2.51 [30]
2 wah

M1GN2 (cadenaB)
Fragmento Fc de IgG1 humana por tratamiento enzimático 1h3t
M1GN2F 2.4 [31]
1h3u M3GN2F 2.4 enzimático
1h3x GN2M3GN2F 2.44 tratamiento
1h3v G2GN2M3GN2F 3.1 [32])
1h3s G2GN2M3GN2F 2.82
G2GN2M3GN2F 4.1
1h3y
IgG1 Fc humana producida por células CHO o Fut8/ CHO 3ave (2dtq)
GN2M3GN2F 2.0 [29]
2.2
GN1M3GN2 (cadenaA)
2dts

GN2M3GN2 (cadenaB)
Fragmento Fc de IgG1 humana triple mutante (M252Y/S254T/T256E) 3fjt
GN2M3GN2F 2.5 [33]
Fragmento Fc de IgG1 humana triple mutante (L234F/L235E/P331S) 3c2s
G1GN2M3GN2F 2.3 [34]
La proteína es producida por las células HEK293.
Tabla 1. Continuación
ID de PDB Estructura de glicanos * Referencia de resolución
Fragmento Fc de IgG1 humana triple mutante (S239D/A330L/I332E) 2ql1
G1GN2M3GN2F 2.5 [35]
Fragmento Fc de IgG1 humana + péptido de 13 residuos
G1GN1M3GN2F (cadenaA) 2.7 [36]
1dn2

G1GN2M3GN2F (cadenaB)
IgG1 humana (Rituxan) Fragmento Fc + Staphylococcus aureus Proteína A dominio B 116x
G2GN2M3GN2F 1,65 [37]
Fragmento 3do3 de IgG1 Fc
humana G1GN2M3GN2F 2.5 [38]
IgG1 humana
G2GN2M3GN2F (cadenaH) 2.7 [39]
1hz

G1GN2M3GN2F (cadenaK)
IgG2a de ratón
1igt G1GN2M3GN2F Fragmento Fc de IgG1 humana + dendrímero peptídico 2.8 [19]
mimético de proteína A. 3d6g Ratón IgG2b Fc fragmento 2rgs Conejo IgG Fc
fragmento 2vuo GN2M3GN2F 2.30 [40]
GN2M3GN2F 2.1 [41]
G1GN2M3GN2 1,95 [42]

Fragmento Fc de IgG1 humana + proteína A minimizada 1oqo
GN2M3GN2F 2.3 [43]
M3GN2F 2.6
1oqx
Fragmento 1fc1 de IgG humana
Fc G1GN2M3GN2F 2.9 [17]
Fragmento 1i1c de IgG2a Fc
de rata GN2M3GN2F 2.7 [18]
Fragmento Fc de IgG1 humana + receptor Fc humano (FcγRIIIb)
G1GN1M3GN2F (cadenaA) 3.0 [44]
1t83 (1its)
GN2M3GN2F (cadenaB)
3.5
G1GN1M3GN2F (cadenaA)
1t89 (1iix)
GN2M3GN2F (cadenaB)
Fragmento Fc de IgG1 humana + receptor Fc humano (FcγRIIIb) 1e4k
G1GN2M3GN2F 3.2 [45]
Fragmento Fc de IgG1 humana + receptor Fc humano (FcγRIIIa) 3sgj
GN2M3GN2F 2.2 [46]
3sgk GN3M3GN2 2.4
Fragmento Fc de IgG1 humana + receptor Fc humano (FcγRIIIa) 3ay4
G1GN2M3GN2 2.2 [47]
Fc heterodimérico humano + FcR neonatal humano (FnRn) 1i1a
GN2M3GN2F 2.8 [18]
* Se muestran las estructuras de glicanos depositadas en cada archivo de coordenadas PDB. G: Dgalactosa, GN: NacetilD
glucosamina, M: Dmanosa, F: Lfucosa.
El análisis conformacional comparativo anterior ha demostrado que las cadenas laterales de Asn glicosiladas y no
glicosiladas exhiben ángulos de torsión χ1 (NCαCβCγ) de −60°, 60°, 180°, correspondientes a los confórmeros g−, g+
y t , respectivamente. El ángulo de torsión χ2 (CαCβCγNδ) muestra un amplio rango centrado en aproximadamente
0°, pero sin embargo está limitado por la glicosilación. En el caso de las cadenas laterales de Asn glicosilada, el
confórmero g es el más preferido y el confórmero g+ es el más raro en los residuos de Asn glicosilados y no glicosilados
[9,48]. La conformación de 56 Nglicanos Fc se analiza estadísticamente en la Figura 3, a partir de las 29 estructuras Fc
diferentes enumeradas en la Tabla 1. Los ángulos de torsión de la cadena lateral, χ1 y χ2, de Asn297 se representan en
la Figura 3a. En el caso de las estructuras Fc, el ángulo de torsión χ1 de Asn297 exhibe una marcada preferencia por
~60°, correspondiente al confórmero g+ .
Los ángulos de torsión Fi
y ψ para todos los enlaces glucosídicos se representan en la Figura 3b. Todos los ángulos
diédricos de los enlaces glucosídicos están dentro de una región aceptable en comparación con otras glicoproteínas
[48]. La distribución del ángulo diedro de los brazos α16 parece ser más restringida que la de los brazos α13 (Man4
Man3, Man4'Man3, GlcNAc5Man4 y GlcNAc5'Man4' en la Figura 3b). Esta diferencia se deriva del hecho de que
los brazos α16 del glicano interactúan con las dos primeras hebras de los dominios CH2 . Los análisis de RMN en
solución de la Fc indican que el brazo α16 está completamente inmovilizado a través de interacciones con la superficie
de la proteína, mientras que el extremo α13 manosa es más dinámico [49,50]. Por otro lado, los estudios de RMN de
relajación de espín indican que el glicano Fc podría exhibir un estado conformacional dinámico, así como el estado fijo
como se ve en la estructura cristalina [51].
Figura 3. (a) Las torsiones de la cadena lateral de Asn297 del fragmento Fc. Los ángulos de torsión de la
cadena lateral Asn297 se miden mediante MolProbity [52]. Excluimos Fc con glicanos de tipo alto en
manosa (código PDB 2wah) de esta inspección, ya que esta estructura contiene glicanos de tipo alto en
manosa. ( b ) Comparación de torsiones glicosídicas de Nglicano unido a Asn297 del fragmento Fc. Los
ángulos diedros de cada enlace se calculan con CARP [15].
Los ejes vertical y horizontal indican y ángulos, respectivamente.
Fi Los residuos con errores se excluyen
cuidadosamente de este análisis. En muchos casos, se utiliza erróneamente un enlace β16 entre el
núcleo Fuc y GlcNAc en lugar de un enlace α16 [53]. Se trazan ocho entradas en FucGlcNAc1 (código
PDB; 1h3w, 3ave, 3d6g, 2rgs, cadenaA en 1e4k y cadenaB en 3sgj).
(b)
2.1.2. Glycoform afecta los ángulos entre dominios relativos del fragmento Fc
La estructura de los glicanos puede afectar potencialmente a la estructura general de una glicoproteína. La influencia
de la glicoforma en la conformación del fragmento Fc ha sido ampliamente investigada. Dos artículos informan sobre la
relación entre la glicoforma y los ángulos entre dominios de los dominios CH2CH3 .
En el primer informe, la influencia de la glicoforma en la estructura y función de IgG Fc se evaluó mediante un
tratamiento secuencial con exoglucosidasa [31]. Krapp et al. resolvió las estructuras cristalinas de IgG1 Fc humana de
cuatro glicoformas que contienen oligosacáridos truncados consecutivamente (código PDB; 1h3t, 1h3u, 1h3x, 1h3v y
1h3w). La eliminación de la GlcNAc terminal así como de los residuos de manosa provoca el mayor cambio
conformacional tanto en el oligosacárido como en el bucle polipeptídico que contiene el sitio de Nglicosilación. El
cambio conformacional en el dominio CH2 afecta la interfaz entre los fragmentos IgGFc y los FcγR. Además, la
eliminación de los residuos de azúcar permite el acercamiento mutuo de los dominios CH2 y la generación de una
conformación cerrada. Esto contrasta con la conformación abierta de IgG Fc completamente galactosilada, que puede
ser óptima para la unión de FcγR. El análisis de RMN en solución de una serie de glicoformas Fc también indica que los
restos de carbohidratos son necesarios para mantener la integridad estructural del sitio de unión de FcγR [54].
En el segundo informe, Crispin y sus colaboradores resolvieron la estructura cristalina de un fragmento Fc de IgG1
humano recombinante diseñado para poseer glicano de tipo alto en manosa en Asn297 [30]. La Fc recombinante se
expresó transitoriamente usando células HEK 293T en presencia del inhibidor de αmanosidasa I, kifunensina (Figura
1b). Se confirmó que la estructura del glucano era Man9GlcNAc2 mediante MALDITOFMS y se resolvió la estructura
cristalina de la glicoforma. El mapa de densidad de electrones del glicano con alto contenido de manosa es bastante
asimétrico. Se observa una densidad ramificada extensa en la cadena A, asignada como Man7GlcNAc2. Por otro lado,
se encuentra una pobre densidad de electrones en la cadena B correspondiente a tres residuos sacáridos terminales
reductores (Man1GlcNAc2). La estructura general del glicano con alto contenido de manosa es similar a la de un tipo
complejo. En la Figura 4a, hay una comparación estructural entre los glicanos de tipo alto en manosa (cadena A de
2wah) y los de tipo complejo (código PDB; 2dts). Los ángulos χ1 y χ2 de la cadena lateral de Asn297 son esencialmente
idénticos a los de otros fragmentos Fc que poseen glicanos de tipo complejo. Además, los ángulos diédricos de los
enlaces glucosídicos en un núcleo de pentasacárido Man3GlcNAc2 de ambos glicanos también son similares (Figura
4a). Sin embargo, las ramas α16 (brazos D2 y D3) del tipo alto en manosa ocupan posiciones diferentes en comparación
con los glucanos de tipo complejo.
Esto se debe a la diferencia entre los enlaces glucosídicos α16 y β12. La superposición estructural de dos fragmentos
Fc revela que la unión de Nglucanos de tipo alto en manosa abre la cavidad entre dominios entre los dominios CH2
(Figura 4b). Esta diferencia estructural entre las dos glicoformas podría explicar la evidencia de que el anticuerpo
monoclonal recombinante con glucanos de tipo oligomanosa humana muestra una ADCC mejorada, junto con una
activación del complemento reducida a través de la unión a C1q [55]. Cabe señalar que la construcción de expresión del
fragmento Fc recombinante carece de los residuos de cisteína que forman un enlace disulfuro en la región bisagra. Se
necesitan más estudios para revelar completamente la relación entre la glicoforma y la estructura.
Figura 4. (a) Comparación estructural entre el glicano con alto contenido de manosa (código PDB; 2wah,
verde) y el glicano de tipo complejo (código PDB; 2dts, cian). ( b ) Superposición estructural entre el
fragmento Fc de tipo alto en manosa (verde) y el fragmento Fc de tipo complejo (cian).
Las moléculas de proteína y las cadenas de carbohidratos se muestran en modelos de alambre y de barra, respectivamente.
Las posiciones de Asn297 se indican con asteriscos rojos. La superposición estructural de estructuras
cristalinas se realizó mediante el programa SUPERPOSE [56].
2.1.3. Interacción intramolecular de carbohidratoscarbohidratos
La interacción directa CH2CH2 se logra principalmente a través del par de Nglicanos en Asn297. Para analizar los
modos de interacción carbohidratocarbohidrato intramolecular del fragmento Fc, comparamos 10 estructuras de
fragmentos Fc no complejados de la Tabla 1; IgG1 Fc humana de tipo salvaje (código PDB; 1fc1, 1h3v, 1h3y, 2dts, 3ave
y 3do3), IgG1 Fc humana mutada (código PDB; 3fjt), IgG2a Fc de rata (código PDB; 1i1c), IgG2b Fc de ratón (código
PDB ; 2rgs), y conejo IgG Fc (código PDB; 2vuo). Estructural
la superposición entre estas 10 estructuras Fc revela que los ángulos entre dominios de los dominios CH2CH3 son
muy variables (Figura 5a). Los ángulos de dominio altamente móviles dan como resultado una variedad de modos de
interacción carbohidratocarbohidrato como se describe a continuación. Los modos se clasifican en seis tipos (i~vi), y en
la Figura 5b se muestra una representación esquemática. (i) En cuatro de los 10 fragmentos Fc (código PDB; 2dts, 3fjt,
3ave y 3do3), solo se encuentra un enlace de hidrógeno entre el grupo hidroxilo OH4 de cada residuo de Man unido a
α13 (Man4) (Figura 5c ). (ii) En la primera estructura del fragmento Fc de IgG1 humana notificada (código PDB; 1fc1),
el modo de interacción carbohidratocarbohidrato es ligeramente diferente. El grupo hidroxilo OH4 del hombre con
enlace α13 (Man4) interactúa asimétricamente con OH3 y OH4 del homólogo con enlace α13 Man (Man4) (Figura
5d). (iii) En dos estructuras del fragmento Fc de IgG1 humana (código PDB; 1h3v y 2vuo), las distancias entre los dos
grupos hidroxilo OH4 de los dos residuos Man (Man4) unidos a α13 son bastante largas para un enlace de hidrógeno
directo. (Figura 5e). En (i) ~ (iii), las estructuras Fc se superponen bien, mientras que las tres estructuras Fc restantes
(código PDB; 1h3y, 1i1c y 2rgs) son únicas. (iv) La estructura del fragmento Fc de IgG1 humana (código PDB; 1h3y) es
completamente diferente en comparación con otros fragmentos Fc de IgG1 humana de tipo salvaje (ver magenta en la
Figura 5a). En esta estructura se observa un enlace de hidrógeno débil entre el O7 de GlcNAc en el brazo α13
(GlcNAc5) y el grupo hidroxilo OH6 del Man unido a α16 (Man4') a una distancia de 3,2 Å (Figura 5f). El fragmento Fc
de IgG1 humana (1h3y) se cristalizó en una alta concentración de sal (NaCl 2,0 M) mientras que los otros fragmentos
Fc de IgG1 humana de tipo salvaje se cristalizaron en condiciones de fuerza iónica más bajas (1fc1; cloruro de sodio 30
mM, 1h3v y 2dts; agua destilada , 3ave; butanodiol al 20% y 3do3; cloruro de sodio 0,2 M y polietilenglicol al 20% 3.350).
El rango de condiciones de fuerza iónica puede contribuir a las diferencias conformacionales (v) El modo de interacción
observado en IgG2a Fc de rata (código PDB; 1i1c) es asimétrico. El brazo α13 de un lado contacta con el núcleo Fuc y
la quitobiosa del otro (Figura 5g). El O5 y el OH6 de GlcNAc en el brazo α13 (GlcNAc5) interactúan con el OH4 del
residuo Fuc, mientras que el OH4 del Man unido a α13 (Man4) forma enlaces de hidrógeno con los grupos hidroxilo de
la quitobiosa. (vi) En la estructura cristalina del fragmento Fc de IgG2b de ratón (código PDB; 2rgs, [40]), se encuentran
cuatro enlaces de hidrógeno simétricos entre las dos cadenas de oligosacáridos. El OH3 del Hombre enlazado α13
(Man4) forma puentes de hidrógeno con el OH2 de su homólogo βMan (Man3), y así mismo el OH4 con el OH6 (Figura
5h).
El ángulo entre dominios de los dominios CH2CH3 podría verse afectado por las condiciones de cristalización,
especialmente la fuerza iónica [31]. El análisis cristalográfico solo proporciona instantáneas estáticas y no brinda
información directa sobre la dinámica de un enlace glucosídico o de las fluctuaciones polipeptídicas. Por lo tanto, es
probable que la conformación de enlace estático simple observada en un cristal no refleje directamente la conformación
promedio de la solución. No obstante, es probable que la conformación promedio para un enlace dado dentro de un
gran conjunto de estructuras estáticas se corresponda bien con la conformación promedio de la solución, y la distribución
de estructuras estáticas dará una indicación de la flexibilidad del enlace, siempre que las fuerzas de empaquetamiento
del cristal no imponer cambios sistemáticos.
Figura 5. (a) Superposición estructural de 10 estructuras de fragmentos Fc (1fc1; verde, 1h3v; cian, 1h3y;
magenta, 1i1c; amarillo, 2dts; rosa, 1i1c; amarillo, 2rgs; trigo, 2vuo; pizarra, 3ave; naranja, 3do3; lima, 3fjt;
verde azulado profundo). Para cuatro entradas (código PDB; 1h3w, 3c2s, 2ql1 y 1l6x), las unidades
asimétricas de estos cristales contienen solo una cadena pesada. Por lo tanto, las cadenas pesadas
vecinas relacionadas con la simetría se compensaron en este análisis.
La superposición estructural se realizó mediante SUPERPOSE. (b) Representación esquemática de seis
tipos de modos de interacción carbohidratocarbohidrato. Los Nglicanos de dos cadenas se muestran en
azul y rosa. Los enlaces de hidrógeno se muestran como líneas rojas. ( c ) ( h ) Vistas de primer plano de
las interfaces de las interacciones carbohidratocarbohidrato. El resto de carbohidratos se muestra en el
modelo de barra. Los enlaces de hidrógeno entre los carbohidratos se muestran como líneas de puntos rojos.
La superposición estructural de cuatro estructuras que tienen solo una interacción carbohidratocarbohidrato
se muestra en (c). El fragmento Fc de IgG1 humana (código PDB; 1fc1) se muestra en (d). La superposición
de dos estructuras que no tienen interacción entre los glucanos se muestra en (e). La IgG1 Fc humana en
condiciones de alto contenido de sal (código PDB; 1h3y), la IgG2a de rata (código PDB; 1i1c) y el
fragmento Fc de IgG2b de ratón (código PDB; 2rgs) se muestran en (f), (g) y (h), respectivamente.
2.1.4. Interacción intermolecular asistida por carbohidratos (receptor Fc neonatal y receptor Fcγ IIIa)
Los carbohidratos unidos a las glicoproteínas a menudo se requieren para la unión estrecha a las proteínas asociadas.
En esta sección, se introducen dos temas en los que los carbohidratos ligados a N en los receptores contribuyen a la
actividad de unión completa de Fc.
El receptor Fc neonatal (FcRn) transporta inmunoglobulina G (IgG) materna a través del intestino neonatal en roedores
y a través de la placenta en humanos, confiriendo así inmunidad humoral al feto o al recién nacido contra los antígenos
encontrados por la madre. FcRn se une a IgG con afinidad nanomolar a pH ácido (≤6,5) en las vesículas de transporte
intracelular y libera IgG al encontrar el pH básico del torrente sanguíneo (7,4). FcRn es un heterodímero y está compuesto
por una microglobulina β2 de cadena ligera soluble y una cadena pesada unida a la membrana que incluye tres dominios
extracelulares (α1~3), un dominio transmembrana de un solo paso y un dominio citoplásmico corto. FcRn interactúa con la
interfaz de dominio CH2CH3 en cada cadena del homodímero Fc [57]. El modo de interacción 2:2 crea estructuras de
orden superior, llamadas "cintas oligoméricas", y prohíbe el crecimiento de cocristales bien ordenados. Para mejorar la
calidad del cristal, Martin y sus colaboradores diseñaron una versión heterodimérica de Fc que no puede crear un puente
entre las moléculas de FcRn, ya que contiene un único sitio de unión a FcRn [58], y resolvió la estructura cristalina de un
ectodominio de FcRn en complejo con el fragmento Fc heterodimérico con una resolución de 2,8 Å [18]. Los dominios de
cadena pesada (α2) y β2microglobulina de FcRn interactúan con la interfaz Fc CH2CH3 (Figura 6a). La interfaz de unión
entre FcRn y Fc abarca una gran superficie (superficie enterrada de hasta 1870 Å2 ) y es muy complementaria. El complejo
se estabiliza mediante amplias interacciones hidrofóbicas y electrostáticas. Curiosamente, el glicano unido a N de tipo
complejo unido a Asn128 de FcRn tiene una estructura altamente ordenada y contribuye con el 1015% del área de superficie
enterrada total en la interfaz. El residuo central de Fuc y GlcNAc del brazo α13 (GlcNAc5) interactúan estrechamente con
la superficie complementaria del compañero de unión (Figura 6b). Esto sugiere que se requiere glicano de tipo complejo,
pero no glicano de tipo alto en manosa, en FcRn para una afinidad máxima de unión a Fc. En realidad, la glicosilación
diferencial de FcRn de ratón podría afectar la estequiometría receptor/ligando en condiciones de no equilibrio [59].
La estructura cristalina del complejo FcFcRn revela cómo el Nglicano en FcRn afecta la afinidad de unión. Por el
contrario, el Nglucano de IgG Fc influye fuertemente en la interacción entre IgG Fc y FcγR, y los anticuerpos terapéuticos
pueden modularse seleccionando la glicoforma adecuada. Por ejemplo, la eliminación de la fucosa central de Fc aumenta
selectiva y significativamente la afinidad de unión a FcγRIII, lo que conduce a funciones efectoras inmunes celulares
mejoradas, como ADCC. Esto puede ser especialmente relevante con respecto a los anticuerpos anticancerígenos
terapéuticos [60,61], y ha sido el foco de la investigación durante la última década. Sondermann y colaboradores [45]
informaron por primera vez de una estructura cristalina del fragmento Fc de IgG1 humana glicosilada en complejo con el
dominio extracelular no glicosilado de FcγRIII. Un FcγRIII se une a las dos mitades del fragmento Fc y contacta con residuos
en los dominios CH2 y la región bisagra. La formación de complejos aumenta significativamente el ángulo entre los dos
dominios FcγRIII solubles y el fragmento Fc está asimétricamente abierto. Recientemente, dos grupos independientes
resolvieron estructuras cristalinas de Fc humano afucosilado en complejo con ectodominio de FcγRIIIa glicosilado (Figura
6c) [46,47]. Aunque ambos grupos produjeron el ectodominio FcγRIIIa glicosilado usando sistemas de expresión de
mamíferos, las estructuras de glicano unidas en Asn162 difieren. Ferrara y sus colegas informan que la estructura de N
glicano es de tipo alto en manosa, mientras que
Mizushima et al. encontrar el tipo complejo asialilado. El plegamiento global de los complejos FcFcγRIIIa en los que
ambas proteínas están glicosiladas es muy similar al de los complejos en los que sólo está glicosilada la proteína Fc.
Se obtuvo una densidad electrónica clara tanto para el glucano del receptor unido a Asn162 como para los glucanos
unidos al fragmento Fc. El carbohidrato unido a Asn162 comparte una gran superficie de interacción (aproximadamente
el 12 % del área de interfaz total —145 Å2 —en el caso del código PDB; 3ay4) con el Fc formado por varias interacciones
polares, de van der Waals y de enlaces de hidrógeno.
Las interacciones del receptor Asn162carbohidrato se centran en el núcleo Asn297carbohidrato de la cadena A Fc y
su vecindad inmediata (Figura 6d). En general, se observa una combinación de contactos carbohidratocarbohidrato y
carbohidratoproteína directos o mediados por agua como parte de la interacción recién formada entre Fc afucosilado y
el receptor glicosilado Asn162.
Ferrara y sus colegas también resolvieron la estructura cristalina de Fc fucosilado en complejo con el ectodominio
FcγRIIIa glicosilado. La fucosa central unida a Fc está orientada hacia la segunda GlcNAc (GlcNAc2) de la quitobiosa
conectada a Asn162 de FcγRIIIa y debe acomodarse en la interfaz entre las cadenas de glucano que interactúan. Este
reordenamiento estérico provoca el movimiento de todo el oligosacárido unido a Asn162 hasta una distancia máxima de
2,6 Å mientras que casi no se observa movimiento en el caso de Fc afucosilado. Este reordenamiento de la red de
interacción reduce la contribución de entalpía en el complejo Fc fucosilado. Es de destacar que incluso un desplazamiento
tan sutil de las cadenas de carbohidratos afecta la actividad fisiológica, como en ADCC [46].
Figura 6. (a) Estructura general del receptor Fc neonatal (FcRn) en complejo con Fc heterodimérico (hdFc)
(código PDB; 1i1a). La microglobulina β2 (β2m) de cadena pesada y de cadena ligera soluble de FcRn se
muestra en pizarra y cian, respectivamente. Los fragmentos Fc proximales y distales de hdFc se muestran
en rosa y blanco, respectivamente. La región delineada en líneas punteadas negras se amplía en (b). ( b )
Vista de primer plano del complejo FcRnhdFc. El Nglucano unido a Asn128 de FcRn se muestra en un
modelo de varilla y esfera semitransparente. ( c ) Estructura general del complejo del receptor IIIa de Fcγ
humano glicosilado con Fc humano (FcγRIIIa) (código PDB; 3sgk).
Dos cadenas del fragmento Fc y FcγRIIIa se muestran en verde, cian y amarillo, respectivamente. La
región delineada en líneas punteadas negras se amplía en (d). ( d ) Vista de primer plano de la interacción
carbohidratocarbohidrato en FcFcγRIIIa. Los enlaces de hidrógeno se muestran como líneas de puntos
rojos.
2.2. Glicano de tipo alto en manosa en la neuraminidasa del virus de la influenza del grupo 2
La infección por el virus de la influenza ha sido una gran amenaza para la salud pública en todo el mundo durante siglos.
Los tipos de influenza A y B son virus de ARN envueltos que llevan dos glicoproteínas en su superficie, hemaglutinina (HA)
y neuraminidasa (NA, acilneuraminil hidrolasa, EC 3.2.1.18). Influenza NA elimina los residuos de ácido siálico unidos a α23
o α26 terminales de los restos de carbohidrato en los glicoconjugados de la superficie celular y se cree que de ese modo
facilita la liberación del virus y la infección de otra célula.
La inhibición de la NA retrasa la liberación de la progenie de viriones de la superficie de las células infectadas [62],
suprimiendo la población viral y dando así tiempo al sistema inmunitario del huésped para eliminar el virus.
Las diferencias antigénicas se utilizan para clasificar los virus de influenza tipo A en nueve subtipos NA (N1N9) [63].
Filogenéticamente, hay dos grupos de NA: el grupo 1 contiene N1, N4, N5 y N8, y el grupo 2 contiene N2, N3, N6, N7 y N9
[64].
Tanto en la gripe A como en la B, el NA funcional es un tetrámero de subunidades idénticas con simetría rotacional
cuádruple. El tetrámero de NA forma una cabeza en forma de caja sobre un dominio de tallo largo y está anclado en la
membrana viral por una secuencia hidrofóbica cerca del extremo Nterminal [65,66]. La superficie de un virus de la influenza
generalmente tiene alrededor de 50 picos de NA tetraméricos [67]. NA ha sido objeto de programas de diseño de inhibidores
enzimáticos basados en la estructura que han resultado en la producción de dos fármacos, zanamivir (Relenza) [68] y
oseltamivir (Tamiflu) [69], que imitan el estado de transición de la reacción enzimática normal.
Figura 7. El glucano de tipo alto en manosa de la neuraminidasa de influenza ayuda a la formación de
tetrámeros. (a) Estructura general de la neuraminidasa N2 monomérica de la influenza (código PDB;
1nn2). Las proteínas, los carbohidratos y los iones de calcio se muestran en modelos de cinta, barra y
esfera, respectivamente. ( b ) Estructura tetramérica de la neuraminidasa N2 de influenza (código PDB;
1nn2). Los glicanos ligados a N en Asn200 se muestran en modelos de esfera. La región delineada en
líneas de puntos negros se amplía en (c). ( c ) Vista de primer plano de Nglicano en Asn200 y molécula
relacionada con la simetría. Los enlaces de hidrógeno se muestran en líneas de puntos rojos. (d)
Los ángulos de torsión de la cadena lateral de Asn200 de N2, Asn207 de N6 y Asn200 de N9 NA (Asn201
en código PDB; 2b8h). ( e ) Alineación de la secuencia de aminoácidos de la neuraminidasa de influenza
del grupo 1 y 2 alrededor de los sitios de glicosilación de Asn200. Los sitios de glicosilación ligados a N
putativos en el grupo 2 están resaltados.
El análisis cristalográfico de influenza NA tiene una historia de casi 30 años. La primera estructura cristalina de
influenza N2 NA se informó en 1983 [70], y la primera N9 en 1987 [71]. El monómero NA consta de una disposición
simétrica de hélice β de seis palas estabilizada en parte por iones de calcio unidos en el eje de simetría (Figura 7a). Hay
cinco sequons de Nglicosilación expuestos en la superficie de la proteína, a saber, Asn86, Asn146, Asn200, Asn234 y
Asn402, los primeros cuatro de los cuales están asignados en el modelo. Los dos Nglicanos en Asn146 y Asn200 están
muy ordenados. El glicano en Asn146 es del tipo complejo fucosilado con núcleo, mientras que el de Asn200 es del tipo
alto en manosa. El sitio catalítico activo está en el medio de la hélice β. En la enzima tetramérica, cada sitio activo está
dirigido
de lado en lugar de hacia arriba, una orientación consistente con la enzima que tiene que escindir el ácido siálico de las
proteínas de membrana cercanas para evitar la captura del virus (Figura 7b). El tetrámero tiene un tamaño de
aproximadamente 100 × 100 × 60 Å con un gran orificio debajo alrededor del eje de 4 pliegues. El glicano de tipo alto en
manosa en Asn200 está ubicado en el borde de la hoja 2 y une la subunidad vecina derecha, lo que contribuye a las
interacciones entre subunidades en el tetrámero (Figura 7b). En la Figura 7c se muestra una vista de cerca del Nglicano
unido a Asn200 y las moléculas vecinas. El Nglucano se encuentra sobre la cuchilla 5 de una molécula vecina. Un residuo
de βMan (Man3) de este glicano está enterrado en la molécula vecina. El área superficial accesible de este residuo se
calcula como ~19 Å2 por AREAIMOL [72]. Las estructuras cristalinas de N2, N6 y N9 NA en el grupo 2 se han determinado
y se resumen en la Tabla 2. El Nglucano unido a Asn200 en N2 corresponde a los de Asn207 en N6 y Asn200 en N9 y sus
estructuras están bien superpuestas en El uno al otro. La distribución de los ángulos de torsión de la cadena lateral de
Asn200 se muestra en la Figura 7d. Los ángulos de torsión χ1 asumen principalmente ~ 240 °, lo que normalmente es raro
en confórmeros de cadena lateral de Asn glicosilados y no glicosilados [48] (Figura 7d).
La fuerte interacción entre el Nglicano y la subunidad vecina puede estabilizar tal conformación de Asn200. El alineamiento
de la secuencia de aminoácidos revela que el secuón en este sitio se conserva entre los NA del grupo 2, excepto N3 (Figura
7e). La comparación estructural entre el grupo 2 y otras NA (N1, N4, N8 y NA tipo B) no revela ninguna característica
estructural común obvia [64,73]. Las proteínas virales son sintetizadas y secretadas por las células huésped. Por lo tanto,
los glucanos unidos a las proteínas virales también son procesados por glicosilhidrolasas y transferasas del huésped. Dado
que las estructuras de glucano de Asn200 son del tipo alto en manosa, el NA del grupo 2 probablemente forma una estructura
tetramérica antes del procesamiento de glucano.
Tabla 2. Resumen de la estructura de neuraminidasa de influenza del grupo 2.
ID de PDB Estructura de glicanos * Resolución Referencia
N2 (A/Tokio/3/1967) 1nn2
M4GN2 2.20 [74]
N2 (A/Tokio/3/1967) 1inw
M3GN2 2.40 [75]
1 pulgada M3GN2 2.40
N6 (A/porcina/KU/2/2001) 1v0z
M35GN2 1.84 [76]
1w1x M15GN2 2.00
1w20 M16GN2 2.08
1w21 M16GN2 2.08
2 cm M6GN2 2.15
N9 (A/Giro/Australia/G70C/75) 1 pulg.
M5GN2 2.40 [75]
N9 (A/Ttern/Australia/G70C/1975 (H11N9)) 1f8b
M5GN2 1.80 [77]
1f8c M5GN2 1.70
1f8d M5GN2 1.40
1f8e M5GN2 1.40

Tabla 2. Cont.
ID de PDB Estructura de glicanos * Resolución Referencia
N9 (A/Tern/Australia/G70C/1975) en complejo con fragmento Fv monocatenario 1a14 M5GN2
2,50 [78]
N9 (A/NWS/ballena/Maine/1/84) 2b8h
M78GN2 2.20 [79]
* Se muestran las estructuras de glicanos depositadas en cada archivo de coordenadas PDB. M: Dmanosa, GN: NacetilD
glucosamina.
3. Los glicanos inmaduros de tipo alto en manosa contribuyen a la intersubunidad y al interdominio
Interacciones
El procesamiento inicial de las glicoproteínas toma la forma de desglucosilación del glucano de tipo alto en manosa
en el RE, y se conserva entre todos los eucariotas [80]. En general, se considera que es el evento principal que señala
la finalización del plegamiento de proteínas. Los Nglucanos mono o diglucosilados rara vez se observan en
glicoproteínas maduras. Sin embargo, se han detectado Nglicanos glucosilados en varias proteínas secretadas.
Aquí, presentamos dos estructuras que poseen Nglicanos de tipo alto en manosa glucosilados inmaduros en sus
superficies. En ambos casos, el glucano inmaduro interactúa ampliamente con la superficie de la proteína.
La investigación de la coexistencia de glicanos procesados y sin procesar en un solo polipéptido puede ayudar a
desentrañar la relación entre el plegamiento de proteínas y la maduración de glicanos.
3.1. El glicano de tipo alto en manosa monoglucosilado estabiliza la formación de hexámeros de arilforina de Antheraea
pernyi
Nuestro primer ejemplo es la arilforina del gusano de seda del roble chino, Antheraea pernyi (abreviado como APA
en lo sucesivo), que es una proteína hexamérica de 688 residuos de aminoácidos por subunidad [81]. Es una
hexamerina, un grupo de proteínas perteneciente a una superfamilia que incluye la tirosinasa de artrópodos, la
hemocianina de artrópodos y el receptor de arilforina de dípteros [82]. Las hexamerinas muestran claras similitudes
estructurales con las hemocianinas, pero han perdido la capacidad de unir iones de cobre y transportar oxígeno.
Se sintetizan en el cuerpo graso de una amplia gama de larvas de lepidópteros y dípteros, entre otros órdenes de
insectos. Estas proteínas se acumulan en altas concentraciones en la hemolinfa. Las hexamerinas parecen servir como
una forma de almacenamiento de aminoácidos, un recurso necesario para el desarrollo completo del adulto, ya que las
pupas de los insectos no se alimentan durante la metamorfosis. Además de ser una proteína de almacenamiento, las
hexamerinas parecen desempeñar otras funciones importantes durante la vida útil de los insectos. Hay al menos dos
tipos de hexamerinas en lepidópteros: arilforina y una proteína de almacenamiento rica en metionina [83].
APA tiene dos Nglicanos unidos en Asn196 y Asn344, aunque APA posee cuatro posibles secuencias candidatas.
La glicosilación de Asn344 es crítica para el proceso de plegamiento, mientras que la glicosilación de Asn196 no lo es.
El análisis espectrométrico de masas reveló que el glucano N344 es un tipo con alto contenido de manosa recortado
(Man56GlcNAc2), mientras que el glucano N196 permanece en un estado de N glucano monoglucosilado
(Glc1Man9GlcNAc2) y es resistente al tratamiento con péptido Nglucosidasa F (PNGaseF) [84].
Aunque la proteína mutante N344Q recombinante no se secreta en el medio de cultivo, la proteína mutante Asn196Gln
se expresa como en el tipo salvaje y tiene la misma actividad de unión a ecdisona que en el tipo salvaje.
La estructura cristalina de APA se resolvió a una resolución de 2,42 Å. La estructura general de APA es similar
a la de la hemocianina de langosta y se compone de un pliegue helicoidal α Nterminal y un pliegue tipo
sándwich β Cterminal (Figura 8a). El Nglicano en Asn344 se expone al solvente y solo se asigna la porción
de quitobiosa. Por el contrario, el Nglicano en Asn196 tiene un mapa claro de densidad de electrones y se le
asigna una estructura monoglucosilada. La unidad asimétrica del cristal APA contiene seis monómeros (un
hexámero) como se muestra en la Figura 8b. Mientras que todas las cadenas de Nglicanos en Asn344 están
completamente expuestas al solvente en el hexámero, los Nglicanos en Asn196 están enterrados dentro del
hexámero y bien organizados en la hendidura profunda de la interfaz de la subunidad. Una comparación entre
APA monomérico y hexámero reveló que los brazos D1 de los Nglicanos están enterrados en el interior
durante la formación del hexámero. En realidad, las áreas de superficie accesibles de un brazo D1 en APA ,
monomérico y hexamérico son 370 y 195 Å2 respectivamente. El Nglicano forma alrededor de 20 enlaces de
f f mismas
hidrógeno directos mediados por agua con residuos de aminoácidos adyacentes, que se encuentran en
o las
diferentes subunidades. Los ángulos diedros y ψ típicos en Manα12Man son ~60° y ~150°,
respectivamente.
Por
el contrario, los
ángulos diedro y ψ en Manα12Man en el brazo D2 (ManD2ManA) son 279° y 130°, respectivamente. El
brazo D2 del glicano adopta una conformación única para adaptarse a la curvatura formada por las moléculas
azul y amarilla (Figura 8c). De hecho, la superficie accesible del área de α12 enlazado Man en el brazo D2
(ManD2) es dramáticamente diferente en estructuras APA monoméricas (217 Å2 ) y hexaméricas (86 Å2 ).
Además del enlace disulfuro entre subunidades entre Cys73 y Cys649, las extensas interacciones
intermoleculares entre Nglicano y APA también estabilizan la interacción trímerotrímero general al
mejorar la interacción entre cada dímero superior e inferior (Figura 8b). Los experimentos de
ultracentrifugación analítica y despliegue de cloruro de guanidinio revelaron que la presencia del
glucano N196 es importante para estabilizar el estado hexamérica y la estabilidad general de APA.
Figura 8. Nglicano monoglucosilado inmaduro en arilforina de Antheraea pernyi (código PDB; 3gwj)
(a) Estructura general de APA monomérico. Las proteínas y los carbohidratos se muestran en
modelos de cintas y varillas, respectivamente. (b) Estructura hexamérica de APA. Cada monómero
se muestra en el modelo de superficie. Los glucanos unidos a N unidos en Asn196 se muestran en
esferas. ( c ) Vista de primer plano de Nglicano unido a Asn196 en APA hexamérica.
3.2. El N glicano diglucosilado estabiliza la interacción entre dominios de la βdalactosidasa de
Trichoderma reesei
La βgalactosidasa es una enzima (EC 3.2.1.23) que cataliza la hidrólisis de residuos de Gal enlazados β13 o β14
en oligo y disacáridos, como lactosa, galactobiosa, aril y alquilβDgalactósidos.
Esta enzima también tiene la capacidad de catalizar la reacción inversa de la hidrólisis llamada transglicosilación. Las β
galactosidasas se han aislado de diversas fuentes, como animales, plantas, bacterias, levaduras y hongos. Tienen
muchas aplicaciones importantes en los campos industrial y biotecnológico. En la base de datos CAZy [85], las β
galactosidasas se encuentran en las subfamilias GH 1, 2, 35 y 42.
Trichoderma reesei βgalactosidasa (Trβgal) pertenece a la subfamilia GH 35. La secuencia y las propiedades
enzimáticas de esta enzima industrialmente útil se han informado previamente [86,87].
Las estructuras cristalinas de Trichoderma reesei βgalactosidasa (Trβgal) en complejos sin ligando y con ligando se
resolvieron a resoluciones de 1,2 ~ 1,75 Å (código PDB; 3og2, 3ogr, 3ogs y 3ogv [88]). La estructura general de Trβgal
consta de seis dominios (Figura 9a). El dominio Nterminal forma una estructura de barril α/β de ocho hebras y es
responsable de la reacción catalítica. Los cinco dominios subsiguientes forman estructuras de sándwich β antiparalelas.
Trβgal posee 11 sitios de glicosilación ligados a N putativos en la superficie de la proteína [87]. Diez de los 11 sitios
están expuestos (Asn810 está enterrado). Los mapas de densidad de electrones correspondientes a los restos de
carbohidrato de los Nglucanos se observan en cinco de las posiciones. Dos de estos (Asn627 y Asn930) contienen
cadenas de oligosacáridos que representan formas de glucanos con alto contenido de manosa. Una de estas posiciones
(Asn930) tiene glicano de tipo alto en manosa diglucosilado de la forma Glc2Man8GlcNAc2 (código PDB; 3og2). El
glicano en Asn930 está ubicado entre tres dominios diferentes (dominios primero, quinto y sexto) y forma varios enlaces
de hidrógeno con la superficie de la proteína, estabilizando la estructura de Trβgal (Figura 9b). El oxígeno del carbonilo
de Ile955 interactúa con el núcleo de quitobiosa. La cadena lateral de Asp776 une los residuos de βMan (Man3) y Glc.
El glucano en Asn930 también está conectado al dominio catalítico porque OD1 y OD2 de Asp265 interactúan
estrechamente con un hombre unido a α12 (ManC). Este glicano cubre varios residuos de aminoácidos hidrofóbicos y
aromáticos y puede proteger la estructura de la proteólisis. El βMan (Man3) es el residuo más enterrado y llega a la
cavidad de la proteína (área de superficie accesible solo ~36 Å2 ). Él
las unidades de glucosa de Trβgal llegan muy cerca del sitio catalítico. Por lo tanto, es plausible que la glicosilación afecte
las propiedades catalíticas de la enzima.
El Trβgal recombinante fue sobreexpresado por un sistema de expresión de Trichoderma reesei [89].
En los sistemas de expresión fúngica, se espera que las glucosidasas I (GLSI) y II (GLSII) recorten los residuos de Glc.
Sin embargo, el Nglucano unido a Asn930 en Trβgal está diglucosilado e interactúa con residuos muy separados en la
secuencia primaria. Sugiere que el plegamiento de la proteína de Trβgal podría terminar antes de que GLSII encuentre
los residuos Glc terminales en el glucano. La estrecha asociación entre el brazo D1 y la superficie de la proteína
probablemente impide el acceso de las unidades de glucosa al sitio catalítico de GLSII, lo que inhibe la desglucosilación y
la posterior conversión a glicanos de tipo complejo.
Figura 9. Nglicano diglucosilado inmaduro en βgalactosidasa de Trichoderma reesei (a) Estructura general
de Trβgal (código PDB; 3ogv). Los glicanos unidos a N en Asn627 y Asn930 se muestran en modelos de
esfera. La región delineada en líneas punteadas negras se amplía en (b). ( b ) Vista de primer plano del
glicano adjunto Asn930. Los enlaces de hidrógeno se muestran como líneas de puntos rojos.
4. ¿Cuál es la función de los Nglicanos móviles/desordenados?
Las proteínas de la membrana de la superficie celular, como los receptores de la superficie celular, a menudo están
glicosilados. Las estructuras cristalinas de estas glicoproteínas de la superficie celular revelaron que sus Nglucanos suelen
ser móviles y la mayoría de los azúcares están desordenados. Aunque los Nglicanos superficiales a veces son inmovilizados
por moléculas relacionadas con la simetría en el empaque del cristal, solo los primeros uno o dos residuos de GlcNAc
generalmente están lo suficientemente ordenados para ser rastreados en el mapa de densidad de electrones. La alteración
de la glicoforma está asociada con varios eventos fisiológicos y patológicos, incluida la invasión tumoral [90]. Por lo tanto,
se considera que estos glicanos desordenados o "faltantes" asumen ciertas funciones fisiológicas como los Nglicanos
altamente ordenados. En este capítulo, presentamos varias estructuras de glicoproteínas de la superficie celular que
desempeñan un papel en el sistema inmunitario y la adhesión célula a célula.
Las enfermedades infecciosas causadas por diversos patógenos representan alrededor de un tercio de todas las muertes humanas en
el mundo, más que todas las formas de cáncer combinadas [91]. Para luchar contra estos poderosos patógenos, los vertebrados utilizan dos
tipos de defensa inmunológica llevada a cabo por proteínas y células especializadas; la respuesta inmune innata y la respuesta inmune
adaptativa. La inmunidad innata se basa en un sistema antiguo y ubicuo de células y moléculas que defienden al huésped contra la infección.
Este sistema puede reconocer prácticamente todos los microbios utilizando un repertorio limitado de receptores codificados en la línea
germinal que reconocen componentes ampliamente conservados de paredes celulares bacterianas y fúngicas o material genético, como el
ARN viral de doble cadena (dsRNA) [92,93]. Los receptores tipo Toll (TLR) son los sensores más importantes del sistema inmunitario innato
[94]. Se han identificado diez TLR humanos (TLR1~10) que reconocen específicamente moléculas asociadas a patógenos. El TLR3 humano
es activado por dsRNA asociado con infección viral, mRNA celular endógeno y pequeños RNA de interferencia independientes de secuencia.
El ectodominio TLR3 humano es una gran estructura similar a un solenoide en forma de herradura ensamblada a partir de 23 repeticiones
ricas en leucina (código PDB; 1ziw, [95]). El ectodominio TLR3 humano posee 15 sitios potenciales de Nglicosilación. Debido a la baja
densidad de electrones de los restos de carbohidrato, solo se asignan uno o dos residuos de GlcNAc en ocho de los sitios de Nglicosilación.
Una supuesta estructura modelo completamente glicosilada revela que casi toda la superficie de la molécula TLR3 está cubierta por
carbohidratos, pero una cara está libre de glicosilación. La estructura del ectodominio TLR3 de ratón en complejo con dsRNA demuestra que
los contactos de dsRNA ocurren a través de residuos en la superficie libre de glicosilación (código PDB; 3ciy, [96]). Los sitios de glicosilación
de TLR3 humano y de ratón son casi idénticos.
En comparación con el TLR3 humano, la densidad electrónica de los carbohidratos se observa claramente en el TLR3 de ratón.
El Nglucano en Asn413, ubicado en la vecindad del dsRNA, se asigna como Man3GlcNAc2 y un residuo de Man unido a α16 interactúa con
el esqueleto de azúcarfosfato del dsRNA. Como en el caso de TLR3 humano, se cree que la ubicación de Nglicano es útil para restringir la
orientación preferencial del ligando (Figura 10a).
En cuanto a los sistemas inmunitarios adaptativos, la mayoría de los receptores de la superficie celular que están implicados en el
reconocimiento de antígenos por parte de las células T y en la orquestación de los eventos de señalización celular subsiguientes están glicosilados.
Rudd et al. postuló que los Nglucanos en la superficie de la proteína desempeñan una amplia gama de funciones, como controlar el
ensamblaje y la estabilización de los complejos proteicos en el sistema inmunitario adaptativo [97].
Los glucanos unidos a N unidos a los dominios proximales de la membrana de CD2 (código PDB; 1hnf, [98]) y CD48 (código PDB; 2dru, [99])
se distribuyen para proporcionar un andamio para orientar las caras de unión, lo que lleva a una mayor afinidad aparente (Figura 10b).
Además, los glicanos en los receptores de células T (TCR) se encuentran sobre la superficie de la proteína de tal manera que podrían evitar
la agregación no específica. Otro punto importante a destacar es que los Nglucanos limitan la geometría y el espaciado posibles de los
grupos de TCR/complejo principal de histocompatibilidad (MHC) que preceden a la señalización celular.
Las células producen, organizan y degradan la matriz extracelular. La matriz, a su vez, ejerce una poderosa influencia sobre las células,
principalmente a través de los “receptores de matriz”. Las integrinas son los principales receptores de la matriz en las células animales y
transmiten señales bidireccionales a través de la membrana plasmática, vinculando así el entorno extracelular con el citoesqueleto de actina
interno [100]. Todas las integrinas son moléculas heterodiméricas no unidas covalentemente que consisten en una subunidad α y una β, que
juntas crean un sitio de unión para ligandos extracelulares específicos en la parte de la proteína más alejada de la membrana. La integrina
α5β1 es un importante receptor celular para la proteína de la matriz extracelular fibronectina y juega un papel fundamental durante el
desarrollo de los mamíferos. La fibronectina es un componente principal de la
matriz extracelular y es una proteína modular compuesta por repeticiones homólogas de pequeños dominios con forma
alargada dispuestos como “cuentas en un hilo”. La integrina α5β1 interactúa con la fibronectina a través de secuencias
ArgGlyAsp (RGD) presentes en una región de bucle flexible en el medio de la proteína. Una estructura cristalina del
ectodominio de la integrina α5β1 muestra el bolsillo de unión a la fibronectina rodeado por cuatro Nglucanos (dos en
α5 y los otros dos en β1), formando una superficie expuesta similar a una zanja a lo largo de la interfaz de la subunidad.
Esta topografía y ubicación de los Nglicanos presumiblemente limita la elección de las orientaciones de acoplamiento
cuando la molécula de fibronectina alargada intenta hacer contacto cercano (modelo de acoplamiento basado en el
ectodominio de integrina α5β1 (código PDB; 3vi4) y fragmento de fibronectina (código PDB; 2mfn y 1fnf ), [101,102]
(Figura 10c).
Figura 10. Nglicanos altamente flexibles en receptores de superficie celular. Los Nglucanos de tipo
complejo (GlcNAc2Man3GlcNAc2Fuc) se superponen, en función de la posición de la quitobiosa o las
secuones mediante el uso de LSQKAB [103]. ( a ) Ectodominio del receptor tipo Toll3 (TLR3)
completamente glicosilado en complejo con dsRNA (código PDB; 3ciy). Las moléculas de proteína se
muestran como modelos de superficie verde y cian. dsRNA se muestra como una esfera gris. (b) Dominios
extracelulares de CD2 (código PDB; 1hnf) y CD48 (código PDB; 2dru). ( c ) Estructura cristalina del
ectodominio de integrina α5β1 (código PDB; 3vi4) y fragmento de fibronectina FN710 (código PDB; 1fnf).
En la estructura de la fibronectina, los residuos de aminoácidos que interactúan con la integrina α5β1 se
muestran en un modelo de barra roja. Las líneas discontinuas en la integrina α5β1 delinean el surco poco
profundo formado por los Nglucanos. ( d ) Molécula de adhesión celular intercelular (ICAM) 2 ectodominios
(código PDB; 1zxq).
Las moléculas de adhesión intercelular 1~3 (ICAM1~3) son miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas
(IgSF) y son ligandos conocidos para las integrinas en la superficie de las células. ICAM2, un ligando para la integrina
αLβ2, se compone de dos dominios Ig extracelulares Nterminales (que comparten un 35 % de homología de secuencia
con ICAM1), un dominio transmembrana y una cola citoplásmica corta. El dominio Ig, el
El bloque de construcción característico de IgSF consiste en dos láminas β antiparalelas empaquetadas estrechamente
una contra la otra y unidas por un enlace disulfuro. La estructura cristalina de los dos dominios Ig extracelulares de
ICAM2 (código PDB: 1zxq) muestra que adoptan una forma de palo de hockey. Seis Nglicanos se exponen al solvente
y se asignan como porciones de quitobiosa. Cuando uno mira hacia abajo el eje de los dos dominios de Ig, estos N
glicanos se ven distribuidos uniformemente alrededor del perímetro de los dominios [104]
(Figura 10d), y están bien ubicados para evitar la agregación de proteínas no específicas.
Estos ejemplos ilustran el importante papel del glucano para ayudar al acoplamiento de grandes ligandos, tanto
orientando el ligando como espaciando el receptor mediante la inhibición de la agregación. Se ha considerado que una
función principal del carbohidrato móvil unido a los receptores de la superficie celular es aumentar la estabilidad
conformacional de la proteína [105]. Por lo tanto, el análisis de solución de RNaseB reveló que el glucano tiene un
efecto estabilizador significativo en la estructura de la proteína al disminuir la flexibilidad de la columna vertebral de la
proteína tanto cerca como lejos del sitio de unión del glucano [106]. Estas funciones secundarias de los glucanos,
complementarias a las interacciones de unión reales, parecen ser fundamentales para el papel de los carbohidratos en
las glicoproteínas de la superficie celular.
5. Perspectiva de futuro
Las estructuras cristalinas disponibles proporcionan varios aspectos estructurales y funcionales de la glicosilación,
en términos de interacciones intra e intermoleculares. Un énfasis en la biología estructural orientada a las glicoproteínas
mejorará la comprensión de la función de los glicanos. El análisis cristalográfico de las glicoproteínas requerirá una
investigación más exhaustiva del sistema de expresión de las glicoproteínas y de la estructura de los glucanos. Aunque
las metodologías para la producción de glicoproteínas están avanzando [107,108], se requieren mejoras en la expresión
y selección de una glicoforma particular de una proteína diana. La secuencia de glicanos en cada sitio de glicosilación
se puede analizar de antemano mediante espectrometría de masas, junto con cromatografía líquida. Sin embargo,
incluso con esta información de secuencia, la densidad electrónica del glicano debe interpretarse con mucha precaución.
La flexibilidad de la columna vertebral dicta que la información estructural sobre el glicano falta en gran medida en los
datos de difracción de rayos X. Se necesitan otras técnicas, como la simulación dinámica molecular y la RMN, para
ayudar a unir las instantáneas discontinuas derivadas de los estudios de rayos X y para evaluar la contribución de los
restos de glicano a las fluctuaciones moleculares.
La glicoforma en un sitio particular de una proteína a menudo está estrechamente relacionada con la función
fisiológica y está estrechamente regulada [18,46,47,109]. Sin embargo, en muchos casos la relación estructural entre la
glicoforma y la función sigue sin estar clara. Los recientes avances técnicos en la síntesis química y enzimática de
glicoproteínas homogéneas van a hacer contribuciones valiosas adicionales al estudio de las relaciones glicoforma
función [110112]. Un estudio de los datos PDB actuales indica que las estructuras de glucano de las glicoproteínas
disponibles son principalmente del tipo alto en manosa y pueden estar sesgadas debido al sistema de expresión
utilizado. Por lo tanto, la relación entre la función de la glicoforma y su estructura 3D necesita una investigación
cuidadosa. La biología estructural centrada en funciones específicas de glicoformas es el desafío para el futuro cercano.
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