INDICE ndice 1. Datos Generales del Alumno Responsable 2. Datos Generales del Proyecto 3. Identificacin del Problema 4.

Formulacin del Problema 5. Justificacin 6. Alcance 7. Antecedentes 7.1. Antecedentes Generales 8. Objetivos 8.1. Objetivo General 8.2. Objetivos Especficos 9. Hiptesis 10. Marco Terico 11. Mtodos 12. Diagrama de Flujo de Actividades 13. Cronograma 14. Presupuesto 15. Docente Responsable a cargo Bibliografa 1 2 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 4 6 8 9 10 10 10

1. Datos Generales del Alumno Responsable Rivas Zegarra, Solange Marlene. Cdigo de Matrcula: 2007602312 2. Datos Generales del Proyecto

2.1. Ttulo del Proyecto Supresin del receptor IL-15R en ratas y su relacin en la resistencia, fatiga y caractersticas metablicas de los msculos esquelticos. 2.2. rea

General: Ciencias Bioqumicas y Biotecnolgicas Especficos: Ingeniera biotecnolgica Lnea: Biologa Molecular, Ingeniera Gentica, Fisiologa Asesor: Dr. Badhin Gmez Valdez

3. Identificacin del Problema Se observ que los ratones que carecan de IL-15 o IL-15R tienen fenotipos nicos del msculo, pero el papel fisiolgico en el msculo no se ha definido todava, por lo que se hace necesario hacer estudios y demostrar que la prdida de IL-15R induce un cambio en los msculos. 4. Formulacin del Problema Los receptores IL-15 (IL-15R) son componentes del receptor de la membrana plasmtica heterotrimerica de la citocina IL-15. Tanto el receptor como su ligando se expresan en una gran variedad de tejidos, pero es en el tejido muscular esqueltico donde dicha expresin es mayor, es por esta razn que tienen un rol importante en el fenotipo de los msculos y se los ha encontrado asociados con la resistencia muscular, sndromes metablicos e incluso con la obesidad.

5. Justificacin

5.1. IMPACTO TECNOLGICO. El avance haca la bsqueda de una sustancia que llevara a la accin de convertir a un atleta capaz de completar una maratn.

5.2. IMPACTO SOCIAL. Apoyo a ms estudios relacionados con el proyecto para la evolucin de nuevos desarrollos futuros.

5.3. IMPACTO ECONMICO. Con todos los resultados obtenidos se podr iniciar pruebas y/o ensayos en laboratorios, ahorrando, tiempo y reactivos.

6. Alcance El proyecto est destinado a implementar datos tericos a los estudios de Biologa Molecular, buscando mayores tcnicas de evolucin molecular, para aplicarlas en otras especies. 7. Antecedentes

7.1. Antecedentes Generales

La interleucina-15 (IL-15) es un factor de crecimiento descubierto recientemente que est altamente expresada en el msculo esqueltico.

La prdida de la IL-15R induce un cambio funcional oxidativo en los msculos rpidamente, incrementando sustancialmente la resistencia a la fatiga y la capacidad de ejercicio. Publicaciones y guas que se ha utilizado como antecedentes: La interleucina-15: una citocina novedosa anablica para el msculo esqueltico. La sobreexpresin de interleucina-15 induce la hipertrofia del msculo esqueltico in vitro: implicaciones para el tratamiento de los trastornos de desgaste muscular. La interleucina-15 respuestas al envejecimiento y la descarga inducida por la atrofia del msculo esqueltico 3

8. Objetivos

8.1. Objetivo General

Suprimir el receptor IL-15R en ratas y determinar su relacin en la resistencia, fatiga y caractersticas metablicas de los msculos esquelticos.

8.2. Objetivos Especficos

Crear los ratones knockout (KO) con delecciones de los genes IL-15 and IL-15R Disear una jaula de rueda para correr y cuantificar el nmero de revoluciones. Determinar la composicin corporal Realizar la histologa y morfologa del msculo de los ratones Realizar TaqMan qPCR.

9. Hiptesis Dado que IL-15R tiene un papel asociado con el fenotipo de los msculos esquelticos ms rpidos in vivo , es posible experimentar y observar los efectos que tienen este cambi fenotpico en los msculos del ratn. 10. Marco Terico IL-15 es una citocina, con funciones propuestas en los tejidos linfoides y no tanto linfoides. IL-15 se clasific como una interleuquina en funcin de su 4--helicoidal estructura secundaria y su capacidad para imitar las funciones de la IL-2 in vitro (1). El receptor de la membrana plasmtica de IL-15 se explic inicialmente como trimrica en su estructura, compuesta de IL-2 de la cadena de receptores (IL-2R), la cadena gamma comn (c), y uno especfico de IL-15R (2, 3). Las transcripciones de IL-15 e IL-15R una amplia distribucin tisular, y el tejido del msculo esqueltico contiene una gran cantidad de IL15 y IL15RA ARNm (1, 2) que responden a los estmulos atrfica (4), la contraccin muscular (5), y el envejecimiento (4, 6, 7). En experimentos in vitro en clulas miognicas inicialmente sugerido que la IL-15 fue un factor de anablicos para el msculo esqueltico, capaz de estimular la acumulacin de protenas contrctiles en miotubos

diferenciados (8-10). Sin embargo, este resultado no ha sido replicado en vivo, como el aumento de los niveles de IL-15 de tipo salvaje animales de experimentacin no se ha traducido en la hipertrofia muscular, lo que sugiere que la IL-15 e IL-15R interacciones in vivo puede ser ms compleja que una simple ligando- de unin al receptor (11-13). Recientemente, estudios han revelado diferentes actividades neurolgicos y del aparato locomotor cuando se comparan IL15R-KO, IL-15-KO, y la IL-2R-ratones KO (14, 15). Los datos demuestran que un papel nico de la IL-15R e IL-15 in vivo existen, ya que la interrupcin de la IL-15 por la eliminacin de sealizacin de IL-15 o IL-15R dado lugar a diferentes fenotipos de ratn. SNPs en los genes humanos y IL15 IL15RA se han asociado con los fenotipos de los msculos (16), las respuestas musculares al entrenamiento de resistencia (17), el sndrome metablico (16), y la obesidad (18-20), al establecer el fundamento adicional para apoyar el papel de estas molculas en el msculo.

IL-15 e IL-15R interacciones en la membrana celular puede llevar a la contratacin de IL-2R y c para formar el receptor heterotrimerica, a pesar de la sealizacin de IL-15 no puede ocurrir estrictamente como resultado de una citoquina secretada unin a un receptor de superficie celular . Interacciones intracelulares en el aparato de Golgi puede conducir a la formacin de un complejo entre la IL-15 e IL-15R, que puede ser secretada o anclado a la membrana celular de trans-presentacin a las clulas vecinas mostrando los receptores de IL-2R y c (21, 22). Adems, la IL-15R no es necesaria para la IL-15 de sealizacin, como la IL-15 tambin puede unirse a la baja afinidad de IL-2R y receptor c heterodimrica (23). Estos datos sugieren que la IL-15R por s sola no debe considerarse simplemente una subunidad de la IL-15 trimrica receptor, pero es probable que un socio integral vinculante que puede alterar la IL-15 la actividad biolgica. De hecho, la formacin de complejos IL-15/IL-15R conduce a un aumento en la actividad biolgica y la vida media de IL-15, y este complejo se ha planteado la hiptesis de que la forma predominante de la molcula (21, 24-26). Los ratones que carecen tanto de IL-15 o IL-15R han fenotipos nico (14, 15, 27, 28), y mltiples isoformas de la IL-15R existen que pueden potenciar o inhibir los efectos de IL-15 (29-33). Por lo tanto, las interacciones IL-15/IL-15R y sealizacin asociados son extremadamente complejas, y la IL-15R probablemente representa un mecanismo de control de la IL-15 la capacidad de sealizacin. Para la creacin de ratones knock-out (31, 32, 33) inicialmente se disea un vector que posee una copia modificada del gen que se desea inactivar, y genes reporteros que permitan confirmar el xito en el proceso de incorporacin del vector a la clula madre embrionaria (CME) y la 5

recombinacin homloga de este. Los genes reporteros ms utilizados son el gen de resistencia a la neomicina (neor) y el gen de la timidina quinasa del virus herpes simple (TkHSV). (33, 34) Con este vector se procede a realizar una transferencia gnica a un grupo de CME de ratn, generalmente de la cepa 129, las cuales previamente fueron aisladas de la capa ms interna del blastocisto conocida como blastocele.(35, 36, 37) En estas clulas, el establecimiento del knockout se logra por medio del fenmeno de recombinacin homloga, el cual consiste en el intercambio de secuencias similares entre cromtidas no hermanas de un par de cromosomas homlogos por la accin conjunta de un grupo de enzimas denominadas recombinasas. Por lo tanto, la eliminacin de las secuencias de inters depende de que las recombinasas faciliten la recombinacin homloga entre el vector y secuencias cromosmicas en las CME Con el propsito de confirmar la incorporacin del vector a las CME, estas son cultivadas en un medio que permite una primera seleccin (seleccin positiva), la cual ocurre gracias a la presencia en el vector de un gen de resistencia a un antibitico, por ejemplo a la neomicina, como se mencion antes. Posteriormente, para corroborar el xito de la recombinacin homloga, se realiza una segunda seleccin (seleccin negativa), mediante la adicin al medio de cultivo de un anlogo de nuclesido como el ganciclovir, que impide la replicacin del DNA en las clulas que han incorporado a su genoma el gen TkHSV por procesos de recombinacin no homloga o heterloga.(33, 37). TaqMan. Esta tecnica permite la cuantificacin especifica del cDNA de inters incluso en la presencia de amplificacion inespecifica (dimeros de primer, DNAg). El uso de SYBR Green implica un diseno muy cuidadoso de los primers con el fin de evitar dimeros de primer, y evitar la amplificacin de DNA genomico contaminante en la muestra de cDNA, para ello, deben disenarse los primers de forma que el amplicon contenga secuencias de diferentes exones. Debido a la accin diferencial aparente de IL-15 e IL-15R, y las observaciones que la IL-15R altera la accin de la IL-15, se opt por realizar estudios en mltiples cepas de ratones en los que la IL-15R e IL-15 fue la expresin gentica modulada con el fin de determinar el papel de estas molculas en las respuestas fisiolgicas del msculo in vivo. 11. Mtodos 11.1. Mtodos 11.1.1. Ratones 6

Se crearn ratones knockout (KO) con delecciones de los genes IL-15 and IL-15R (38) , luego de esto a las 8 semanas de edad estos animales sern alojados en la instalacin de barrera de control a 22 C bajo un ciclo de 12 horas claras/12-horas a oscuras y recibieran comida y agua. 11.1.2. Jaula de rueda para correr.

Para calcular

la actividad del ratn se conseguir una jaula de ruedas, con un programa

informtico especfico para cuantificar el nmero total de revoluciones de la rueda cada hora .Los datos se expresaran como las revoluciones de la rueda total durante el cada perodo realizado y la distancia cubierta por hora.

11.1.3. La composicin corporal.

La composicin corporal se determinar utilizando el mtodo de ecuaciones que se describe en (39)

11.1.4. Histologa y morfologa del msculo Se realizar disecciones de estos ratones. Las secciones congeladas (10 micras de espesor) sern cortadas a la mitad del abdomen del msculo y se fijarn en metanol helado durante 5 minutos. Los cortes fueron procesados para su estudio histolgico , como se describe (40). Las imgenes digitales sern tomadas utilizando una cmara digital. 11.1.5. TaqMan qPCR. ARN total se aislar de los msculos gemelos, el bazo y los riones de la IL-15R-ratones KO, utilizando el mtodo de ecuaciones que se describe (41)

12. Diagrama de Flujo de Actividades

Crear los ratones knockout (KO) con delecciones de los genes IL-15 and IL-15R

Disear una jaula de rueda para correr y cuantificar el nmero de revoluciones.

Determinar la composicin corporal

Realizar la histologa y morfologa del msculo de los ratones

Realizar TaqMan qPCR.

13. Cronograma

Semanas Actividades 1. Bsqueda bibliogrfica 2. Creacin de los ratones knockout (KO) 3. Diseo de una jaula de rueda para correr 4. Determinacin de la composicin corporal 5. Histologa y morfologa del msculo 6. TaqMan qPCR. 7. Analizar los resultados 8. Redaccin de informe

14. Presupuesto ITEM JAULA PRECIO $150

15. Docente Responsable a cargo Dr. Badhin Gmez Valdez Bibliografa 1. Wong T, Hildebrandt MA, Thrasher SM, Appleton JA, Ahima RS, Wu GD. Divergent metabolic adaptations to intestinal parasitic nematode infection in mice susceptible or resistant to obesity. Gastroenterology. 2007;133(6):19791988. 2. Grabstein KH, et al. Cloning of a T cell growth factor that interacts with the beta chain of the interleukin-2 receptor. Science. 1994;264(5161):965968. 3. Giri JG, et al. Identification and cloning of a novel IL-15 binding protein that is structurally related to the alpha chain of the IL-2 receptor. Embo J. 1995;14(15):36543663. 4. Giri JG, et al. Utilization of the beta and gamma chains of the IL-2 receptor by the novel cytokine IL-15. Embo J. 1994;13(12):28222830. 5. Pistilli EE, Siu PM, Alway SE. Interleukin-15 responses to aging and unloading-induced skeletal muscle atrophy. Am J Physiol Cell Physiol. 2007;292(4):C1298C1304. 6. Nielsen AR, et al. Expression of interleukin-15 in human skeletal muscle effect of exercise and muscle fibre type composition. J Physiol. 2007;584(pt 1):305312. 7. Marzetti E, et al. Changes in IL-15 expression and death-receptor apoptotic signaling in rat gastrocnemius muscle with aging and life-long calorie restriction. Mech Ageing Dev. 2009;130(4):272280. 8. Quinn LS, Anderson BG, Strait-Bodey L, Wolden-Hanson T. Serum and muscle interleukin15 levels decrease in aging mice: correlation with declines in soluble interleukin-15 receptor alpha expression. Exp Gerontol. 2010;45(2):106112. 9. Quinn LS, Haugk KL, Grabstein KH. Interleukin-15: a novel anabolic cytokine for skeletal muscle. Endocrinology. 1995;136(8):36693672. 10. Furmanczyk PS, Quinn LS. Interleukin-15 increases myosin accretion in human skeletal myogenic cultures. Cell Biol Int. 2003;27(10):845851. 10

11. Quinn LS, Anderson BG, Drivdahl RH, Alvarez B, Argiles JM. Overexpression of interleukin15 induces skeletal muscle hypertrophy in vitro: implications for treatment of muscle wasting disorders. Exp Cell Res. 2002;280(1):5563. 12. Pistilli EE, Alway SE. Systemic elevation of interleukin-15 in vivo promotes apoptosis in skeletal muscles of young adult and aged rats. Biochem Biophys Res Commun. 2008;373(1):2024. 13. Carbo N, et al. Interleukin-15 antagonizes muscle protein waste in tumour-bearing rats. Br J Cancer. 2000;83(4):526531. 14. Figueras M, et al. Interleukin-15 is able to suppress the increased DNA fragmentation associated with muscle wasting in tumour-bearing rats. FEBS Lett. 2004;569(13):201206. 15. He Y, et al. IL-15 receptor deletion results in circadian changes of locomotor and metabolic activity. J Mol Neurosci. 2010;41(2):315321. 16. Wu X, He Y, Hsuchou H, Kastin AJ, Rood JC, Pan W. Essential role of interleukin-15 receptor in normal anxiety behavior. Brain Behav Immun. 2010;24(8):13401346. 17. Pistilli EE, et al. Interleukin-15 and interleukin-15R alpha SNPs and associations with muscle, bone, and predictors of the metabolic syndrome. Cytokine. 2008;43(1):4553. 18. Riechman SE, Balasekaran G, Roth SM, Ferrell RE. Association of interleukin-15 protein and interleukin-15 receptor genetic variation with resistance exercise training responses. J Appl Physiol. 2004;97(6):22142219. 19. Di Renzo L, et al. Normal Weight Obese syndrome: role of single nucleotide polymorphism of IL-1 5Ralpha and MTHFR 677C-->T genes in the relationship between body composition and resting metabolic rate. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2006;10(5):235245. 20. Di Renzo L, et al. Role of interleukin-15 receptor alpha polymorphisms in normal weight obese syndrome. Int J Immunopathol Pharmacol. 2009;22(1):105113. 21. Nielsen AR, et al. Association between interleukin-15 and obesity: interleukin-15 as a potential regulator of fat mass. J Clin Endocrinol Metab. 2008;93(11):44864493. 22. Bergamaschi C, et al. Intracellular interaction of interleukin-15 with its receptor alpha during production leads to mutual stabilization and increased bioactivity. J Biol Chem. 2008;283(7):41894199. 23. Dubois S, Mariner J, Waldmann TA, Tagaya Y. IL-15Ralpha recycles and presents IL-15 In trans to neighboring cells. Immunity. 2002;17(5):537547.

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24. Budagian V, Bulanova E, Paus R, Bulfone-Paus S. IL-15/IL-15 receptor biology: a guided tour through an expanding universe. Cytokine Growth Factor Rev. 2006;17(4):259280. 25. Rubinstein MP, et al. Converting IL-15 to a superagonist by binding to soluble IL15R{alpha}. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103(24):91669171. 26. Dubois S, Patel HJ, Zhang M, Waldmann TA, Muller JR. Preassociation of IL-15 with IL-15R alpha-IgG1-Fc enhances its activity on proliferation of NK and CD8+/CD44high T cells and its antitumor action. J Immunol. 2008;180(4):20992106. 27. Stoklasek TA, Schluns KS, Lefrancois L. Combined IL-15/IL-15Ralpha immunotherapy maximizes IL-15 activity in vivo. J Immunol. 2006;177(9):60726080. 28. Lodolce JP, et al. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity. 1998;9(5):669676. 29. Kennedy MK, et al. Reversible defects in natural killer and memory CD8 T cell lineages in interleukin 15-deficient mice. J Exp Med. 2000;191(5):771780. 30. Budagian V, et al. Natural soluble interleukin-15Ralpha is generated by cleavage that involves the tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (TACE/ADAM17). J Biol Chem. 2004;279(39):4036840375. 31. Lodish H, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell J. Molecular cell biology. W. H.Freeman and Company; 1990;:2219-1230. 32. Strachan T, Read AP. Human molecular genetics. 2 ed. Bios Scientific Publishers Ltd; 1999. 12141219. 33. Griffiths AJF, Miller JH, Suzuki DT, Lewontin RC, Gelbart WM. An introduction to genetic analysis. 7 ed. W. H. Freeman; 2000. 2004;414569. 34. Watson JD, Gilman M, Witkowski J, Zoller M. Recombinant DNA. 2 ed. Scientific American Books; 1992. :314319. 35. Seong E, Saunders TL, Stewart CL, Burmeister M. To knockout in 129 or in C57BL/6: that is the question. Trends Genet 2004;20(2):59-62. 36. Capecchi MR. Targeted gene replacement. Sci Am 1994;270(3):52-9. 37. Wong GT. Speed congenics: applications for transgenic and knock-out mouse strains. Neuropeptides 2002;36(2-3):230-6. 38. Huang Z, Ha GK, Petitto JM.IL-15 and IL-15R alpha gene deletion: effects on T lymphocyte trafficking and the microglial and neuronal responses to facial nerve axotomy 2007 1;417(2):160-4.

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39. Wong T, Hildebrandt MA, Thrasher SM, Appleton JA, Ahima RS, Wu GD. Divergent metabolic adaptations to intestinal parasitic nematode infection in mice susceptible or resistant to obesity. Gastroenterology. 2007;133(6):19791988. 40. Degens H, Turek Z, Hoofd LJ, Vant Hof MA, Binkhorst RA. The relationship between capillarisation and fibre types during compensatory hypertrophy of the plantaris muscle in the rat. J Anat. 1992;180(pt 3):455463 41. Pistilli EE, Siu PM, Alway SE. Interleukin-15 responses to aging and unloading-induced skeletal muscle atrophy. Am J Physiol Cell Physiol. 2007;292(4):C1298C1304

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