Técnicas en inmunodiagnóstico

Grado Superior de Laboratorio Clínico y biomédico

josemiguel.avia@fpclaudiogaleno.es
Curso: 2021/2022
UT 2. Aplicación de técnicas basadas en reacciones de Antígeno-Anticuerpo secundarias I

TIPOS DE AG

AG PARTICULADO AG SOLUBLE

Presentes en el organismo inducen una

producción de Ac
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Reacción Ag-Ac
Reconocimiento y unión específica de un Ag-Ac formando un IC

Características
• Específica. Llave-cerradura
• Reversible. Unión débil. No covalentes
• Rápida. Milésimas de segundos
• Espontánea. No consume energía

• Se pueden disociar fácilmente IC

• Cambios de pH
• Concentraciones salinas altas
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Tipos de reacción Ag-Ac

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AGLUTINACIÓN PRECIPITACIÓN

Ag particulado + Ac =Inmunocomplejo Ag soluble + Ac =Inmunocomplejo

(complejo reticular) (insoluble de gran tamaño)
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Base de la mayor parte de técnicas de inmunodiagnóstico

Es una técnica muy sensible

Sensibilidad?
• La capacidad del test para detectar la
enfermedad.
• La probabilidad de que para un sujeto
enfermo se obtenga en la prueba un
resultado positivo
• Fracción de verdaderos positivos
Especificidad?
• La capacidad para detectar a los sanos
• La probabilidad de que para un sujeto
sano se obtenga un resultado negativo
• Fracción de verdaderos negativos
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Reacción de aglutinación

La unión del antígeno-anticuerpo es una unión no covalente

• Se usa para cuando el antígeno es particulado (bacteria)
• El antígeno unido al eritrocito (hemaglutinación)
• Algunos virus aglutinan eritrocitos (usado para identificarlos)

Aglutinógeno Aglutinina

Inertes Vitales
(látex) (hematíes)
Hemaglutinación
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Condiciones para la reacción

Aglutinógeno

1- Estar presente en la partícula de forma apreciable.

2- Estar situado en la superficie.
3- Poseer múltiples epítopos (multivalente).
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Aglutinina

Teóricamente todos los anticuerpos pueden aglutinar antígenos particulados.

Aglutinina completa Aglutinina incompleta

• Siempre aglutinan • No aglutinan en condiciones desfavorables
• Multivalencia y tamaño (antígeno en solución salina).
• IgM • Bivalentes
• IgG
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Factor determinante de la aglutinación

Cantidad de antígeno y anticuerpo

Aglutinina Aglutinina
Aglutinógeno Aglutinógeno
Prozona

Falso negativo

Diluir los sueros

Concentración equivalente
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Factor determinante de la aglutinación

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Factor determinante de la aglutinación

Temperatura
• Las reacciones se efectúan correctamente a 20º C. CRIOAGLUTININAS

• Los aglutinógenos bacterianos reaccionan mejor a 37º C.

• Algunas aglutininas reaccionan de forma óptima a 4º C.
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Tipos de aglutinación

DIRECTA
• Aglutinina reacciona con un aglutinógeno presente de forma natural en la superficie de un tipo celular. Unión-aglutinación.
• Test de aglutinación cualitativa (aglutinación rápida).
• Grupos sanguíneos AB0, test de la brucelosis (lecha mal pasteurizada, Animal-Hombre).
• Serotipificación bacteriana (Ag presentes en su superficie).
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¿Cómo facilitar la aglutinación de un Ac incompleto?

• Aumentar la viscosidad del medio celular. (Seroalbúmina bóvina al 30%, dextrano, polivinil pirrolidinna)
• Eliminar los residuos negativos de ácido siálico (-, antígeno bacteriano) de la membrana. Células con tripsina,
papaína, bromelina o ficina.
• Disminuir la fuerza iónica del medio que circula los hematíes LISS. (Sustancias de baja fuerza iónica, glicinato
sódico).
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Tipos de aglutinación
INDIRECTA

• Aglutinina reacciona con un aglutinógeno transferido pasivamente a

la superficie de una partícula vital o inerte. Aglutinógeno no asociado
a partícula de forma natural.
• Unión químicamente Ag soluble a partículas vitales, bacterias,
eritrocitos o inerte (látex, carbón).
• Sensibilización, proceso por el que partículas son recubiertas de
aglutinógeno no propios.

Hematíes con aglutinógeno de toxoplasma

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Tipos de aglutinación
INDIRECTA
Látex, partículas de poliestireno
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¿Cómo facilitar la sensibilización?

• Exponer las células a la acción de algunas sustancias. (ácido tánico, favorece la adsorción del aglutinógeno).
• Emplear moléculas bifuncionales (bencidina). Primero se fija a la superficie y luego fija el aglutinógeno
(covalente).
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Tipos de aglutinación
INDIRECTA INVERSA

Hepatitis B
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Formas de realizar una prueba de aglutinación

• Portaobjetos de cristal (grupos sanguíneos).

• Superficie de tarjetas visualizadoras (partícula blanca).
• Placas de microtitulación.
• Tubos de ensayo.
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Valoración de la aglutinación

Esta técnica puede ser:

– Cualitativa: resultado positivo o negativo.
– Cuantitativo: sí se hace una dilución seriada del suero y se calcula el título de Ac. Título de Ac es la
inversa de la máxima dilución del suero que da positiva la reacción de aglutinación. Muy difícil

¿Título?
¿?
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Valoración de la aglutinación
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Valoración de la aglutinación
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Valoración de la aglutinación
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Calcula el título de Ac

1. Dibuja la placa en tu cuaderno.

2. Marca los controles positivos y negativos.
3. Identifica el título de anticuerpo de cada muestra.
4. ¿Qué indica el recuadro de la muestra 6? Explica.
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Reacción de inhibición de aglutinación

• Permite detectar antígenos solubles (no unidos a partículas)
• Anticuerpo saturado. No produce aglutinación
• Ag en baja concentración, no satura el Ac. Aglutinación

• Algunos virus aglutinan eritrocitos (gripe, Newcastle). Para detectarlos, se añaden AC específicos y se determina la inhibición
de la hemaglutinación por bloqueo del virus. Se emplea para titular sueros.
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Reacción de inhibición de aglutinación

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Reacción de inhibición de aglutinación

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AGLUTINACIÓN PRECIPITACIÓN

Ag particulado + Ac =Inmunocomplejo Ag soluble + Ac =Inmunocomplejo

(complejo reticular) (insoluble de gran tamaño)
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PRECIPITACIÓN

• Ag soluble interacciona con el Ac=IC-Ag-Ac

• Ag y Ac deben de ser multivalentes
• Ag (varios determinantes antigénicos, 4-5)
• Ac (2 paratopos)
• IC insolubles que precipitan
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TIPOS DE REACCIONES
• En medio líquido o en medio semisólido.
• En medio líquido: generan un gran precipitado cuyos componentes se unen laxamente. REACCIONES DE
FLOCULACIÓN.
• En medio semisólido: se usa el gel de agar (algas marinas) y el de agarosa (polisacáridos del agar). REACCIONES DE
INMUNODIFUSIÓN o PRECIPITACIÓN EN GEL.
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Factor determinante de la precipitación

Cantidad de antígeno y anticuerpo
Concentración equivalente (1:3)- Punto de equivalencia

Ac Ac
Ag Ag
Prozona (1.:6) Postzona (2:1)
IC. Solubles y No precipitado
pequeños
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Factor determinante de la precipitación

Cantidad de antígeno y anticuerpo
Concentración equivalente (1:3)- Punto de equivalencia

Ac Ac
Ag Ag
Prozona (1.:6) Postzona (2:1)
IC. Solubles y No precipitado
pequeños
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Factor determinante de la precipitación

Cantidad de antígeno y anticuerpo
Concentración equivalente (1:3)- Punto de equivalencia
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REACCIONES EN MEDIO SEMISÓLIDO

• Desplazamiento o difusión a través del medio semisólido del Ag, del Ac o de ambos produciendo un arco o una banda
cuando se encuentren en concentración adecuada.
• Desplazamiento de forma espontánea; doble difusión y la inmunodifusión radial (IDR).
• Desplazamiento provocado por un campo eléctrico; Inmunoelectroforésis, electroinmunodifusión y la
contrainmunoelectroforesis.
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REACCIONES EN MEDIO SEMISÓLIDO

DOBLE DIFUSIÓN (Ouchterlony)
Pasos:
1. Verter el gel de agar o agarosa sobre una placa Petri (5ml, 1%)
2. Taladrar unos pocillos en el gel. Uno central y varios periféricos
3. En el central se sitúa un reactivo (Ag o Ac) y en los periféricos el otro (Ag o Ac)
4. Los reactivos difunden a través del gel de forma radial, hasta alcanzar el PE y precipitar
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REACCIONES EN MEDIO SEMISÓLIDO

DOBLE DIFUSIÓN (Ouchterlony)
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REACCIONES EN MEDIO SEMISÓLIDO

DOBLE DIFUSIÓN (Ouchterlony)

Factores a tener en cuenta:

1. Tamaño y forma de los pocillos.
2. La distancia entre los pocillos.
3. Tiempo de incubación.

La línea de precipitación se dispone de forma

perpendicular al eje que une cada pocillo de Ag con
el del Ac
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REACCIONES EN MEDIO SEMISÓLIDO

DOBLE DIFUSIÓN (Ouchterlony)
Muestras distintas en los pocillos periféricos
Muestras con antígenos iguales, parecidos o distintos.
Se observan tres patrones (comparación e identificación de Ag)

a y b (Ag)
A y B (Ac)

I- Patrón de identidad total: Las dos líneas se prolongan dando lugar a una única línea. Los Ag comparten el epítopo contra el que se
dirige el Ac.
II- Patrón de desigualdad: Las dos líneas se cruzan y muestran espolones. (Los Ag no tienen ningún epítopo común).
III- Patrón de identidad parcial: Se muestra un espolón en la zona de unión (El Ag comparte un epítopo, pero no los dos) El espolón
apunta al inespecífico con respecto al Ac.
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REACCIONES EN MEDIO SEMISÓLIDO

DOBLE DIFUSIÓN (Ouchterlony)
Cuantificación aproximada de la cantidad de Ag
Diluciones seriadas de la muestra
El resultado se compara con los obtenidos en otra placa con concentraciones conocidas
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REACCIONES EN MEDIO SEMISÓLIDO

Inmunodifusión radial (IDR)
 Es una inmunoprecipitación entre un Ag y un Ac, obteniéndose como resultado final un anillo de precipitación.
 Medio semisólido; gel de agarosa incorporando un reactivo (Ac). Ejemplo. Preparo 5 ml de agarosa 1% (4,5 ml de
agarosa y 0,5ml de suero (10%)) Distribuido homogéneamente.
 El segundo reactivo (Ag) se introduce en un pocillo.
 La inmunodifusión es progresiva, la difusión del Ag provoca la IP que se va extendiendo hasta que todo el Ag ha
reaccionado con el Ac.

 + concentración de Ag/+ difusión. Área final del Ag es directamente

proporcional a la concentración del Ag.
 Permite cuantificar la concentración del Ag
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REACCIONES EN MEDIO SEMISÓLIDO

Inmunodifusión radial (IDR)

Factores que influyen en la formación del anillo.

• Volumen de la muestra
• Concentración de anticuerpo
• pH
• Tiempo de incubación (24-48h)
• Temperatura (27ºC) +temperatura
• - difusión
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REACCIONES EN MEDIO SEMISÓLIDO

Inmunodifusión radial (IDR)

Recta de calibrado
área

Ag

¿+/- concentrado?
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REACCIONES EN MEDIO SEMISÓLIDO

Inmunodifusión radial (IDR)
Recta de calibrado. No curva Mal apuntes
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REACCIONES EN MEDIO SEMISÓLIDO

Inmunoelectroforésis
Se utiliza cuando la mezcla antigénica es demasiado compleja y los Ag han de
separarse antes de ser visualizados.

1. La mezcla a analizar (suero con Ag) se deposita en un pocillo central de un

gel de agarosa.
2. Someter a una corriente eléctrica, para separar los Ag en función de su
carga.
3. Medio tamponado a un pH determinado. Carga positiva va al cátodo, carga
negativa al ánodo.
4. Se vierte el anticuerpo en un canal creado previamente.
5. Se deja en reposo, para la difusión.
6. Aparecen bandas, forma de arco, IP (PE).
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REACCIONES EN MEDIO SEMISÓLIDO

Inmunoelectroforésis
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Inmunoelectroforésis
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REACCIONES EN MEDIO SEMISÓLIDO

Contrainmunoelectroforesis
 Técnica de doble difusión forzada por un campo eléctrico (para acortar tiempo y aumentar sensibilidad).
 Los componentes dispuestos en el pocillo migran en direcciones opuestas.
 Geles de agar, pH determinado para cargar positivamente el Ac y cargar negativamente el Ag.
 Los reactivos se mueven en direcciones opuestas hasta colisionar.
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REACCIONES EN MEDIO SEMISÓLIDO

Contrainmunoelectroforesis
 Técnica de doble difusión forzada por un campo eléctrico (para acortar tiempo y aumentar sensibilidad).
 Los componentes dispuestos en el pocillo migran en direcciones opuestas.
 Geles de agar, pH determinado para cargar positivamente el Ac y cargar negativamente el Ag.
 Los reactivos se mueven en direcciones opuestas hasta colisionar.
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REACCIONES EN MEDIO SEMISÓLIDO

Electroinmunodifusión
 Es una inmunodifusión radial forzada por la aplicación de una corriente eléctrica (acorta tiempo y facilita la lectura de los resultados).
Electroforesis en cohete (rocket)
 Los Ag sometidos a electroforesis en un gel que lleva incorporado el Ac o el suero.
 pH determinado para que el Ac tenga carga neutra y no migre por acción de la carga eléctrica.

 Extremo del gel (preparado con Ac) se coloca la muestra de Ag y diferentes concentraciones
de Ag conocidas. La carga hace que el Ag difunda y forma el cohete.
 Curva patrón
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REACCIONES EN MEDIO SEMISÓLIDO

Electroinmunodifusión
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REACCIONES EN MEDIO LÍQUIDO

• Los IC quedan suspendidos en la muestra dando un aspecto turbio al tubo.

• Pueden precipitar produciendo copos de precipitado.

• Para favorecer su determinación, es preferible evitar la sedimentación y medir lo antes posible.

• Dos técnicas para realizar la cuantificación del antígeno; turbidimetría y nefelometría.

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REACCIONES EN MEDIO LÍQUIDO

TURBIDIMETRÍA
• Rayo de luz colimado (haces paralelos) atraviesa una muestra homogénea de partículas, una parte de la luz es absorbida, otra
reflejada, transmitida y otra dispersada en todas las direcciones.
• Turbidimetría mide la cantidad de luz absorbida, es decir la luz NO DISPERSADA o no transmitida.
• + cantidad de luz absorbida, + número de partículas en suspensión, + concentración.
• INMUNOTURBIDIMETRÍA
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REACCIONES EN MEDIO LÍQUIDO

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REACCIONES EN MEDIO LÍQUIDO

NEFELOMETRÍA
• Nefelometría mide la cantidad de luz dispersada, la luz desviada con un determinado ángulo con respecto al rayo
incidente.
• El ángulo de dispersión es entre 30º-90º.
• La intensidad de luz dispersada es directamente proporcional a la cantidad de IC formados y, por tanto a la
concentración de Ag.
• INMUNONEFELOMETRÍA
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REACCIONES EN MEDIO LÍQUIDO

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Factores que influyen en la inmunoprecipitación

• Concentraciones de los reactantes (Ag y Ac).

• Temperatura. Amplio rango, pero algunos Ac precisan una temperatura específica.

• pH. Neutro. Comprendido entre 6-7,5.

• Concentración de sales en el medio. +sales/+ solubles los IC/+ difícil precipitar.

• Carga de los IC. Los que tienen cargas elevadas precipitan mal.

• Afinidad y avidez. +afinidad y + avidez de un Ac-Ag, + rápido se forma el IC y + estable es el precipitado.