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Célula de envejecimiento (2015)14,págs. 887–895 Doi: 10.1111/acel.12368

La coenzima Q10 restaura la función mitocondrial y la fertilidad de los

ovocitos durante el envejecimiento reproductivo

Assaf Ben Meir,1,2Eliezer Burstein,1,2Aluet Borrego-

Introducción
Álvarez,1jazmín chong,1Elena Wong,1,3Tetiana Yavorska,
1,3taline naranian,1,3maggie chi,4ying wang,5 La fertilidad femenina es una de las primeras funciones fisiológicas afectadas negativamente

Yaakov Bentov,2,6jennifer alexis,7Jaime Meriano,7Hoon Ki por el envejecimiento. La fecundidad femenina comienza a disminuir a los 32 años y disminuye

Sung,1David L. Gasser,8Kelle H Moley,4siegfried hekimi,5 más rápidamente después de los 37 años (O'Connoret al.,1998). Esta disminución en la

Roberto F Casper1,2,3,6y Andrea Jurisicova1,3,6 probabilidad de concepción ocurre a pesar de la continuación de los ciclos ovulatorios (te
Velde & Pearson, 2002). Aunque los factores neuroendocrinos y uterinos contribuyen a la
1Instituto de Investigación Lunenfeld-Tanenbaum, Hospital Mount Sinai, 25 Orde
disminución relacionada con la edad de un embarazo exitoso, la tasa constante de
Street, Toronto, ON M5T 3H7, Canadá
nacimientos vivos de embarazos de donación de ovocitos en mujeres de edad avanzada
2TCART Fertility Partners, 150 Bloor W, Toronto, ON M5S 2X9, Canadá
3Departamento de Fisiología, Universidad de Toronto, 1 King's College Circle, sugiere que la disminución de la calidad de los ovocitos es el principal factor contribuyente

Toronto, ON M5S 1A8, Canadá
4Departamento de Obstetricia y Ginecología, Universidad de Washington en St.
Louis, 660 S. Euclid Avenue, St. Louis, MO 63110, EE. UU.
5Departamento de Biología, Universidad McGill, 3649 Promenade Sir
William Osler, Montreal, QC H3G 0B1, Canadá
6Departamento de Obstetricia y Ginecología, Universidad de Toronto, 92 College
responsable de la infertilidad con el envejecimiento. Se sabe que el envejecimiento materno
desencadena una serie de alteraciones moleculares que provocan los defectos en la
separación de las cromátidas (Chianget al.,2011) y la descondensación cromosómica, así como
el desprendimiento del huso que causa la desalineación cromosómica (Battagliaet al.,1996; Liu
y Keefe, 2002). Sin embargo, solo se han identificado unos pocos objetivos responsables de

Street, Toronto ON, M5G 1L4, Canadá estos cambios y, hasta el momento, ningún tratamiento ha tenido éxito en mejorar las

7Centro LifeQuest de Medicina Reproductiva, 655 Bay St, Toronto, ON M5G 2K4,
Canadá
8Departamento de Genética, Universidad de Pensilvania, 575 Clinical Research
Building, 415 Curie Boulevard, Filadelfia, PA, 19104-6145, EE. UU.
posibilidades de un nacido vivo en mujeres en edad materna avanzada.
La disminución de la capacidad reproductora femenina con el envejecimiento se
acompaña del agotamiento de la reserva ovárica. En humanos, la pérdida progresiva

Resumen de folículos ováricos no es lineal y se acelera con la edad, especialmente después de

los 38 años (Faddy, 2000). Las vías moleculares detrás del aumento de la pérdida de
La capacidad reproductiva femenina disminuye drásticamente en la cuarta
células germinales en los ovarios envejecidos son poco conocidas. El aumento del
década de la vida como resultado de una disminución relacionada con la
daño en el ADN debido a una maquinaria de reparación del ADN menos activa es un
edad en la calidad y cantidad de ovocitos. Las causas principales del
posible desencadenante de la pérdida de ovocitos (Tituset al.,2013). El complejo
envejecimiento reproductivo y los factores moleculares responsables de la
proceso de maduración del ovocito antes de la ovulación involucra cambios nucleares,
disminución de la calidad de los ovocitos siguen siendo esquivos. Aquí,
citoplasmáticos y epigenéticos que culminan con la formación del huso meiótico.
mostramos que el envejecimiento de la línea germinal femenina se
Todos estos procesos requieren energía, que es proporcionada por las mitocondrias
acompaña de una disfunción mitocondrial asociada con una fosforilación
principalmente a través de la fosforilación oxidativa: OXPHOS (Dumollardet al.,2007),
oxidativa disminuida y un nivel reducido de trifosfato de adenosina (ATP).
ya que el proceso energético alternativo de la glucólisis en el ovocito está limitado
Expresión disminuida de las enzimas responsables de la producción de
debido a la baja expresión de fosfofructoquinasa (Leese & Barton, 1984). El estado
CoQ,Pdss2ycoq6, se observó en ovocitos de hembras mayores tanto en
bioenergético del ovocito influye en su competencia de desarrollo con correlaciones
ratones como en humanos. La disminución relacionada con la edad en la
entre el potencial de implantación, el contenido de ATP (Van Blerkomet al.,1995), y
calidad y cantidad de ovocitos podría revertirse mediante la
potencial de membrana mitocondrial (Wildinget al.,2001). Además, la interferencia con
administración de CoQ10. Alteración específica del ovocito dePdss2
OXPHOS o con la función mitocondrial conduce a la detención de la maduración de los
recapituló muchos de los fenotipos mitocondriales y reproductivos
ovocitos, la desalineación cromosómica y el desarrollo embrionario comprometido
observados en las hembras viejas, incluida la reducción de la producción
(Takeuchiet al.,2005; milet al.,2006; Wymanet al.,2008).
de ATP y el aumento de las anomalías del huso meiótico, lo que resulta en
infertilidad. Reserva ovárica en el ovocito específicoPdss2-animales
La producción de ATP a través de OXPHOS implica la acción de la cadena de
deficientes se redujo, lo que provocó insuficiencia ovárica prematura que
transferencia de electrones que consta de cinco complejos ubicados en la
podría prevenirse mediante la administración dietética materna de
membrana mitocondrial interna. Los complejos I y II oxidan los productos del
CoQ10. Concluimos que el rendimiento mitocondrial deteriorado creado
ácido tricarboxílico (ciclo TCA) y transfieren los electrones a la ubiquinona,
por la disponibilidad subóptima de CoQ10 puede conducir a déficits de
también conocida como coenzima Q (CoQ). Los electrones se transfieren a los
ovocitos asociados con la edad que causan infertilidad.
complejos III y IV, creando un gradiente de protones que culmina en la
Palabras clave: mitocondrias; modelos de ratones; biología molecular del
generación de ATP por el complejo V. La CoQ es pleiomórfica y tiene
envejecimiento; individual; fecundidad; anti-envejecimiento
EnvejecimientoCélula

propiedades antioxidantes críticas, controla el redox celular, altera varias vías

de señalización e influye en la actividad transcripcional de las células y es
requerida para la actividad de la succinato deshidrogenasa (Crane, 2001; Quinzii
et al.,2010).

Correspondencia Varios estudios observacionales demostraron una disminución específica de

Andrea Jurisicova o Robert F. Casper, 25 Orde Street, habitación 6-1016-1, Toronto,
ON M5T 3H7, Canadá. Tel.: 416 586 4800x2052; fax: 416 586 5993; correos
electrónicos: jurisicova@lunenfeld.ca o casper@lunenfeld.ca
Aceptado para publicación30 de mayo de 2015
tejido en los niveles de CoQ con la edad (Kalenet al.,1989; Millaset al.,2004).de
novo La producción de CoQ implica una ruta bioquímica compleja pero poco
conocida, que depende de la actividad de al menos 10 enzimas diferentes. El
anillo de benzoquinona de la CoQ se sintetiza a partir del aminoácido tirosina o

ª2015 Los Autores.Célula de envejecimientopublicado por la Sociedad Anatómica y John Wiley & Sons Ltd. 887
Este es un artículo de acceso abierto bajo los términos de la licencia de atribución Creative Commons, que permite el uso, la
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888Envejecimiento de ovocitos y deficiencia de CoQ10, A. Ben-Meiret al.

fenilalanina, y la cola se produce a partir de acetil-CoA por la vía del mevalonato
a través de la acción de la decaprenil difosfato sintasa tetramérica, codificada
por elPdss1yPdss2genes Tras la condensación del anillo con la cola de
poliprenilo por la enzima COQ2, la estructura del anillo se modifica por
descarboxilación, hidroxilación y metilación, mediada por enzimas codificadas
porCoq 3, 6 y 7.Las proteínas CoQ forman un gran complejo mitocondrial (Tran
& Clarke, 2007) y se requiere la presencia de todos los componentes proteicos
para mantener su estabilidad (Wang & Hekimi, 2013). El objetivo de este estudio
fue determinar si la función mitocondrial deteriorada del ovocito podría
mejorarse mediante la suplementación con estimulantes de la producción de
energía mitocondrial y determinar si la inhibición específica del ovocito deCoQ
La síntesis podría recapitular las anomalías reproductivas observadas con el
envejecimiento.
Resultados
Como el envejecimiento materno se acompaña de una reducción de la función
mitocondrial en los ovocitos (Kujjoet al.,2013), tratamos madres ancianas con
estimuladores conocidos de la bioenergética mitocondrial, CoQ10, ácido alfa lipoico y
resveratrol. CoQ10 mejoró significativamente las tasas de ovulación en este modelo
(Fig. S1A). Por lo tanto, enfocamos nuestros experimentos adicionales para determinar
si la CoQ10 puede mejorar otros fenotipos mediados por el envejecimiento en la línea
germinal femenina. Después de confirmar que la respuesta ovárica mejoró en una
cohorte más grande de hembras tratadas con CoQ10 (Fig. 1), evaluamos si la reserva
ovárica y el rendimiento reproductivo también se pueden mejorar con el
envejecimiento. Si bien se perdió una reserva ovárica sustancial durante un
tratamiento de 3 meses (de 9 a 12 meses, Fig. S1B), la histomorfometría ovárica
confirmó un aumento en el número de folículos primordiales, preantrales y antrales en
el grupo tratado con CoQ10 en comparación con el grupo tratado con vehículo de la
misma edad. cohorte tratada (Fig. 1A). Como la preservación de la reserva ovárica no
significa necesariamente la producción de ovocitos de mejor calidad, sometimos a las
hembras a una prueba de reproducción. El tamaño reducido de la camada observado
en las viejas madres tratadas con vehículos se normalizó con CoQ10
(Fig. 1C). Por lo tanto, la suplementación con CoQ10 no solo preservó el conjunto de
folículos ováricos, sino que también facilitó la ovulación de gametos capaces de
sustentar un desarrollo normal.
La disfunción mitocondrial se ha implicado en el envejecimiento de los ovocitos (Bentov et
al.,2011). Como CoQ es un componente bien conocido de la cadena de transporte de
electrones, a continuación evaluamos si el tratamiento con CoQ10 podría mejorar el
rendimiento mitocondrial en los ovocitos. Determinamos que el grupo de mitocondrias que
respiraban disminuyó en los ovocitos envejecidos y aumentó con el tratamiento con CoQ10 a
un nivel similar al de los controles jóvenes (Fig. 2A). La disminución de la actividad mitocondrial
en los ovocitos envejecidos se reflejó en una menor reducción de FAD++ a FADH2, ya que la
proporción de FAD++ oxidado (fluorescente) a MitoTracker (reserva mitocondrial activa)
aumentó con la edad y esto se normalizó por CoQ10 (Fig. 2A). Por el contrario, el potencial de
la membrana mitocondrial se elevó con el envejecimiento (Fig. 2A) y se restauró a los niveles
observados en los animales jóvenes después de la exposición a la CoQ10. Durante la
finalización de la meiosis I, la producción mitocondrial y las demandas de ATP aumentan
drásticamente (Daltonet al.,2014). Esto se puede monitorear mediante el aumento de especies
reactivas de oxígeno derivadas de mitocondrias (ROS - Mitosox). Los niveles de ROS
disminuyeron con el envejecimiento y se restauraron en los ovocitos de las madres tratadas
con CoQ10 (Fig. 2A). Tanto la producción de ATP como el consumo de oxígeno disminuyeron
con el envejecimiento y aumentaron significativamente con la administración de CoQ10 (Fig.
2B). De acuerdo con estos resultados, los metabolitos del ciclo TCA, incluidos el citrato, el
malato y, en menor medida, el fumarato, se redujeron con el envejecimiento y aumentaron
con el tratamiento con CoQ10 a los niveles observados en los controles jóvenes (Figs. 2B y S2).
Los resultados de estos estudios indican que la inhibición de la actividad del ciclo TCA es una
de las principales razones de la función mitocondrial deficiente en los ovocitos envejecidos.
Usando resultados previamente publicados de estudios de micromatrices en
ovocitos murinos envejecidos (Hamataniet al.,2004; Sarténet al.,2008), establecimos
que la expresión de genes implicados en el metabolismo mitocondrial se reducía con
el envejecimiento. Expresión desdhaynduf3,el eliminador de ROS mitocondrialCésped1
así como el regulador de la cromatina dependiente de ATP Esmarca2 (Fig. 2C) se
redujeron significativamente en los ovocitos de la

(A)

(B) (C)

Figura 1Impacto del tratamiento con CoQ10 en la reserva ovárica y el rendimiento reproductivo en un modelo de ratón envejecido. (A) La reserva ovárica fue significativamente mayor en ratones viejos tratados con
CoQ10 durante un período de 15 semanas (norte =9/edad y tratamiento) evidenciado por un número significativamente mayor de folículos primordiales en reposo y secundarios en crecimiento. Los valores
representan números promedio de folículos - SEM. Las imágenes de los ovarios estimulados de cada grupo se muestran a la derecha - aumento 509. (B) Número de ovocitos ovulados recolectados después de la
estimulación hormonal de las crías (norte =20), vehículo antiguo tratado (norte =16) y viejas madres tratadas con CoQ10 (norte =dieciséis). Los valores representan el número promedio de ovocitos por hembra - SEM.
(C) Tamaño de la camada en crías (norte =39), vehículo antiguo tratado (norte =15), y viejos ratones tratados con CoQ10 (norte =11). El número de crías vivas nacidas de madres en el mes 13 de edad disminuyó, pero se
normalizó después de la suplementación con CoQ10. Cada hembra produjo solo una camada durante la prueba de reproducción. Los datos del diagrama de dispersión se muestran como media por hembra - SEM.

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 Envejecimiento de ovocitos y deficiencia de CoQ10, A. Ben-Meiret al.889

(A) (B)

(C)

Figura 2Mejora en la función mitocondrial en ovocitos de ratones viejos con vehículo después de la suplementación con CoQ10. (A) Los ovocitos de ratones CoQ10 jóvenes, viejos y viejos se tiñeron con MitoTracker
Red, JC-1 y Mitosox o se examinaron en busca de autofluorescencia verde (FAD). El conjunto de mitocondrias que respiran (MitoTracker Red) se redujo en los ovocitos de ratones vehículos viejos en comparación con
CoQ10 jóvenes o viejos, que no eran diferentes entre sí. La proporción de FAD oxidado (FAD++)/MitoTracker Red aumentó en ovocitos viejos. El potencial de membrana mitocondrial (MMP) aumentó en los ovocitos
viejos, mientras que la producción de ROS (Mitosox) disminuyó. Estos efectos de envejecimiento se normalizaron con el tratamiento con CoQ10. Los valores representan unidades de fluorescencia aleatorias (RFU) por
ovocito - SEM. Para todos los experimentos, se usaron ovocitos individuales y los grupos conteníannorte =15-25 ovocitos/edad/tratamiento. (B) ATP (nMETRO) y los metabolitos del ciclo TCA (milimoles de sustrato por
kilogramo de peso húmedo por ovocito) se evaluaron en ovocitos individuales de jóvenes (norte =7–15), vehículo antiguo (norte =8–14) y CoQ10 antigua (norte =11–17). El consumo de oxígeno se expresa como una
proporción de señales fluorescentes obtenidas mediante un escaneo con 1 minuto de diferencia y refleja la descomposición oxidativa de la sonda por ovocito. Los datos mostrados son medios - SEM. (C) Niveles de
expresión de genes implicados en la función mitocondrial (Ndufs3, Sdha y Sod1) y organización de la cromatina (Esmarca2)en los ovocitos ovulados se redujeron con el envejecimiento y mejoraron después del
tratamiento con CoQ10 (media - SEM). Cada muestra contenía un grupo de 3 ovocitos (norte =4 jóvenes,norte =6 vehículo antiguo ynorte =5 grupos antiguos de CoQ10), y los datos se muestran como la proporción de
transcrito de referencia (actina)/objetivo (estudiado).

animales de edad avanzada y aumentó en el grupo de edad tratado con CoQ10. Por el Los ratones mayores tratados con CoQ10 eran similares a los tamaños de camada observados en los

contrario, la suplementación con CoQ10 no tuvo un impacto significativo en la animales jóvenes (Fig. 1C).

expresión de genes implicados en la transcripción o la organización de la cromatina.
(Cggbp1, Arf1, Ezh2, Bmi1, Rbbp4, Kpna2) (Figura S2). Por lo tanto, concluimos que el
tratamiento materno con CoQ10 aumenta la función mitocondrial en ovocitos
envejecidos, restaura la actividad del ciclo TCA y normaliza la producción de energía.
Varios modelos de ratón han relacionado el estado bioenergético de los ovocitos
con resultados meióticos anormales, en particular defectos en el posicionamiento del
huso y la dispersión cromosómica (Wanget al.,2009; Luzzoet al.,2012). Por lo tanto,
evaluamos el huso de la metafase II y la alineación cromosómica de los ovocitos
ovulados. Como se informó anteriormente, el envejecimiento estuvo acompañado por
la producción de ovocitos con tasas más altas de defectos del huso y desalineación
cromosómica. El tratamiento con CoQ10 en los ratones viejos restauró la apariencia
normal del huso y evitó la dispersión cromosómica hasta un grado indistinguible de
las madres jóvenes (Fig. 3A). Además, los niveles de transcripción de genes implicados
en la progresión meiótica como Tuba1a, Nek2,yGancho1todos aumentaron
significativamente después del tratamiento con CoQ10 en los animales viejos (Fig. 3B),
mientras que no se observaron cambios para ccna2 (Figura S2). Lo que es más
importante, el tamaño de las camadas de cachorros nacidos vivos en el
Se cree que la fuente de CoQ10 en la mayoría de los tejidos se origina en la
producción endógena porque la biodisponibilidad de CoQ10 de la dieta es muy
baja. En roedores, la principal variante de CoQ es CoQ9 con un contenido
variable de CoQ10 que difiere entre tejidos. Al igual que el hígado, el ovario
parece absorber eficientemente la CoQ10 de fuentes externas sin un impacto
dramático en los niveles endógenos de CoQ9. (Tabla S1).
Luego procedimos a determinar si los ovocitos envejecidos expresan niveles
alterados de enzimas involucradas en la biosíntesis de CoQ. La RT-PCR cuantitativa de
ovocitos en etapa de crecimiento (GV) reveló una disminución significativa en Coq6y
Coq9expresiones (Fig. 4A) pero ningún cambio en elPdss1/2 niveles de transcripción.
Para establecer si los ovocitos humanos muestran los mismos cambios moleculares
que los ratones, evaluamos la expresión de estos objetivos en ovocitos GV obtenidos
de pacientes que se sometieron a un tratamiento de FIV. Similar al ratón, una
disminución significativa enCoQ6se observó expresión en los ovocitos de pacientes
mayores (Fig. 4B). El análisis de transferencia Western de ovarios aislados de madres
jóvenes y viejas reveló una reducción en las proteínas PDSS2 y CoQ6 (Fig. 4C). La
inmunolocalización en secciones de ovario confirmó la expresión de PDSS2 y CoQ6 en
ovocitos de crecimiento

ª2015 Los Autores.Célula de envejecimientopublicado por la Sociedad Anatómica y John Wiley & Sons Ltd.
890Envejecimiento de ovocitos y deficiencia de CoQ10, A. Ben-Meiret al.

(A) (B)

Fig. 3CoQ10 rescata los defectos del huso en los ovocitos envejecidos. (A) Porcentaje de desalineación cromosómica o del huso en ovocitos ovulados de jóvenes (norte =60), viejo (norte =73) y la
antigua CoQ10 (norte =51) ratones. Los ovocitos se tiñeron con anticuerpo antitubulina (verde) y DAPI (rojo). Las imágenes representativas del huso normal (en forma de barril) y la alineación
cromosómica (aspecto de cepillo de dientes) se consideraron normales. Las flechas demuestran el desprendimiento de cromosomas del huso o la organización del huso deformado. Las letras (a
frente a b y a* frente a b*) son significativamente diferentes entre sí (pag <0,05). (B) Expresión de genes implicados en la formación/fijación del huso y la ejecución meiótica (Tuba1a, Hook1, Nek2 y
Smarca2)en los ovocitos se redujo con el envejecimiento y mejoró después del tratamiento con CoQ10. Cada muestra contenía un grupo de 3 ovocitos, y cada categoría de edad estaba
representada pornorte =4 jóvenes,norte =6 de edad, ynorte =5 grupos antiguos de CoQ10, y los datos se muestran como la proporción media de referencia (actina)/objetivo - SEM.

(A) (B)

(C)

Figura 4Expresión reducida de genes de biosíntesis de CoQ10 en ovocitos con el envejecimiento. (A) Cambio de veces en el nivel de ARNm de GV agrupados (3 por muestra;norte =6 jóvenes,norte =6
años) se normalizaron a una edad joven. Transcritos que codifican enzimasPdss1 y Pdss2no cambió con el envejecimiento, pero sí la expresión de las enzimas implicadas en la modificación del
anillo de hidroxibenzoato (Coq6yCoq9)disminuido significativamente. (B) Cambio de veces en el nivel de ARNm de los genes de síntesis de CoQ10 en un solo ovocito humano GV por paciente (norte
=8 pacientes <32 años,norte =8 pacientes > 39 años mujeres). Los datos se muestran como media - SEM y se normalizan a actina. (C) Inmunocitoquímica de ovocitos GV expuestos a anticuerpos
anti-PDSS2 y anti-COQ6 de jóvenes (norte =9) y ratones de vehículos viejos (norte =5). Los valores representan unidades de fluorescencia medias - SEM. Western Blot de lisados de ovario completos
de ratones jóvenes (3 meses) y viejos (12 meses) transferidos con anticuerpos anti-PDSS2, anti-COQ6 y anti-actina.

folículos (desde la etapa de folículo secundario en adelante), así como una expresión La CoQ6 en los lisados de ovario podría reflejar una composición tisular alterada (por
más baja, aunque detectable, en el estroma, la teca, el cúmulo y las células ejemplo, una reserva de folículos disminuida), realizamos inmunocitoquímica en
luteinizadas de la granulosa (Fig. S4). A medida que disminuyen los niveles de PDSS2 y ovocitos en etapa GV aislados de hembras jóvenes y viejas. Tanto PDSS2 como

ª2015 Los Autores.Célula de envejecimientopublicado por la Sociedad Anatómica y John Wiley & Sons Ltd.

La CoQ6 se redujo significativamente con la edad (Fig. 4C) en los ovocitos, aunque no
observamos una reducción significativa en el nivel de CoQ9/10 en los lisados ováricos totales
en animales de edad avanzada (Tabla S1). Como los ovocitos solo representan una fracción
muy pequeña del contenido total del tejido ovárico, los cambios que ocurren en estas células
serían imposibles de rastrear.
El trabajo anterior ha establecido que la interrupción dePdss2y la prevención de la
síntesis de CoQ son letales embrionarias. Sin embargo, actualmente se desconoce si la
función de esta enzima es necesaria para la ovogénesis. Utilizamos la interrupción
condicional dePdss2en ovocitos para investigar si la interrupción de la síntesis de
CoQ10 afectará la reserva ovárica. El ZP3- Cre3Mrtlínea tiene una alta eficiencia de
escisión (~ 98%), con actividad restringida a los ovocitos iniciados en la etapa de
folículo primordial (Fig. S3A). Los niveles de PDSS2 se redujeron en los ovocitos GV en
crecimiento dePdss2fl/fl Cre+ratones (Fig. S3B), y la inmunorreactividad estuvo
prácticamente ausente en los ovocitos completamente desarrollados (Fig. S3C).
Aunque elPdss2fl/fl cre-las hembras tuvieron un promedio de 6 crías por camada, la
Pdss2fl/fl Cre+hembras (norte =4) no produjo ninguna descendencia viable durante un
ensayo completo de reproducción de 3 meses cuando se cruzó con machos de
fertilidad comprobada (Fig. S3D). A los 4 meses de edad,Pdss2fl/fl Cre+los ovarios
femeninos no contenían folículos sanos y estaban acompañados por un útero
hipotrófico, una condición que se asemeja a una falla ovárica prematura. La tasa de
ovulación a las 4 semanas de edad, poco después del inicio de la pubertad, reveló una
disminución del número de ovocitos ovulados y la reserva ovárica de la Pdss2fl/fl Cre+los
ratones ya estaban gravemente comprometidos, como lo demuestra la pérdida del
50% de los folículos (Fig. 5A, B).
Luego investigamos si los ovocitos ovulaban por jóvenesPdss2fl/fl Cre+
las hembras exhibieron fenotipos mitocondriales similares a los encontrados en las
hembras viejas. El grupo mitocondrial que respira (por ejemplo, MitoTracker Red), ROS
mitocondrial y ATP se redujeron significativamente (Fig. 5C, D). Además, una mayor
proporción de ovocitos dePdss2fl/fl Cre+las hembras contenían una desalineación de los
cromosomas, lo que sugiere que la interrupción de la vía biosintética de CoQ10 podría
contribuir a los resultados meióticos anormales observados con el aumento de la edad
materna (Fig. 5E). Como hemos observado niveles reducidos de CoQ6 en ovocitos
envejecidos, examinamos si este resultado podría ser una respuesta a la deficiencia de
PDSS2. Por cierto,Pdss2- Los ovocitos G deficientes también expresaron un nivel
reducido de proteína CoQ6 (Fig. 5F).
Determinar si la CoQ10 es el factor responsable de la mala reserva ovárica
provocada porPdss2deficiencia, expusimos a las madres durante el embarazo/
lactancia a CoQ10 con la posterior suplementación dietética de las crías con CoQ10
durante la lactancia. A los 2 meses de edad control Pdss2fl/fl Cre+los ratones mostraron
tasas de ovulación severamente reducidas acompañadas de una reducción en la
reserva ovárica. Este fenotipo en las crías se corrigió parcialmente mediante la
exposición a CoQ10 durante la lactancia (Fig. 5B). Además, el potencial de la
membrana mitocondrial, la producción de ATP y los niveles de superóxido mejoraron
en los animales suplementados con CoQ10, sin un cambio en la reserva mitocondrial
que respira (Fig. 5B, C). También observamos una mejora en el huso y la alineación
cromosómica (Fig. 5D). Curiosamente, la exposición de los jóvenesPdss2fl/fllas hembras
a CoQ10 no alteraron la reserva ovárica, la reproducción, las tasas de ovulación o la
función mitocondrial (Fig. S4). Estos resultados indican que la síntesis disminuida de
CoQ creada por ovocitos específicosPdss2la interrupción es suficiente para alterar la
función ovárica, lo que sugiere que la deficiencia de CoQ puede contribuir a la pérdida
acelerada de ovocitos y a los malos resultados del embarazo que se observan con el
envejecimiento.
Discusión
En este estudio, demostramos que la suplementación con CoQ10 en un modelo
animal anciano retrasó el agotamiento de la reserva ovárica, restauró la
expresión del gen mitocondrial del ovocito y mejoró la actividad mitocondrial.
Como resultado, se ovularon más ovocitos en ratones viejos, se mejoró el
potencial de desarrollo de los ovocitos y nacieron más crías. los
ª2015 Los Autores.Célula de envejecimientopublicado por la Sociedad Anatómica y John Wiley & Sons Ltd.
Envejecimiento de ovocitos y deficiencia de CoQ10, A. Ben-Meiret al.891
interrupción condicional de laPdss2El gen que resulta en la deficiencia de CoQ en los
ovocitos recapituló muchos de los cambios fenotípicos característicos de la disfunción
mitocondrial del ovocito asociada con el envejecimiento reproductivo. Estos cambios
podrían revertirse alimentando a los animales con CoQ10. La suplementación con
CoQ10 no tuvo impacto en la reserva ovárica o la calidad de los ovocitos de las
hembras jóvenes, lo que sugiere que la CoQ10 no tiene un efecto reproductivo
beneficioso en animales en los que la función mitocondrial está intacta.
El proceso de envejecimiento reproductivo en los mamíferos incluye una reducción
progresiva de la reserva folicular ovárica con disminución de la calidad de los ovocitos.
Se ha confirmado una mayor pérdida de folículos ováricos con el envejecimiento tanto
en ovarios de roedores como en humanos (Faddyet al.,1983; Faddy, 2000). Detectamos
un número significativamente mayor de folículos primordiales después de 12 semanas
de tratamiento con CoQ10. Cuando realizamos recuentos de folículos, no vimos
ovocitos primordiales moribundos en ovarios envejecidos, según la morfología y la
condensación de cromatina. Por lo tanto, la explicación más probable para el aumento
observado en el número de folículos se debe a la disminución de la atresia. La segunda
posibilidad alternativa para aumentar la reserva de folículos primordiales es una
disminución en el reclutamiento hacia el crecimiento. Sin embargo, como vemos un
poco más de ovocitos primarios en el grupo de tratamiento con CoQ10, esta es una
explicación poco probable.
Los estudios de micromatrices publicados previamente que compararon ovocitos
viejos y jóvenes revelaron una expresión alterada de los genes responsables de la
función mitocondrial, las respuestas al estrés oxidativo, la alineación cromosómica y la
ubiquitinación (Hamataniet al.,2004; Sarténet al.,2008). El examen ultraestructural de
los orgánulos celulares en ovocitos envejecidos confirmó los defectos en la
arquitectura mitocondrial (Kujjoet al.,2013). Con base en los resultados de nuestro
estudio, está claro que los defectos en el desempeño mitocondrial ocurren
concomitantemente con la disminución en el desempeño reproductivo, y atribuimos
estos cambios a una producción insuficiente de CoQ por parte de los ovocitos. El daño
del ADN es otro factor que contribuye al envejecimiento de los ovocitos (Tituset al.,
2013), y queda por determinar si la deficiencia de CoQ9/10 puede acelerar el daño del
ADN. Sin embargo, es claro que la interrupción dePdss2en los ovocitos es suficiente
para desencadenar defectos mitocondriales que recuerdan al envejecimiento.
CoQ10 es esencial para la actividad mitocondrial, ya que las mutaciones puntuales
en las enzimas responsables de la síntesis de CoQ10 se caracterizan por fenotipos que
involucran tejidos que consumen mucha energía, como el sistema nervioso central, el
músculo esquelético y el riñón (Lópezet al.,2006; Penget al.,2008; Heeringaet al.,2011),
y estos síntomas pueden aliviarse parcialmente con la administración de CoQ10. A
diferencia de la mayoría de los tejidos de roedores en los que la CoQ9 es la forma
predominante de ubiquinona, los ovarios producen niveles relativamente altos de
CoQ10 y pueden absorber CoQ10 de fuentes externas de manera eficiente.
Observamos una disminución transcripcional deCoQ6en ovocitos envejecidos y
disminución concomitante en el nivel de proteína PDSS2. Existe una relación recíproca
entre estas dos enzimas, ya que la interrupción dePdss2Disminución desencadenada
de la proteína CoQ6. Se describieron previamente cambios similares paraCoQ9y CoQ7
(García-Corzo et al.,2013). Es posible que la interrupción de elementos clave en la ruta
de la CoQ pueda dar como resultado una estabilidad alterada del complejo enzimático
CoQ completo (Wang y Hekimi, 2013).
En humanos, las concentraciones de CoQ10 disminuyen después de los 30 años de
edad en algunos tejidos (Morreet al.,2003; Millaset al.,2004), y quizás esto contribuya al
proceso de envejecimiento. El momento de la disminución relacionada con la edad en
la disponibilidad de CoQ10 parece coincidir con la disminución de la fertilidad y el
aumento de las aneuploidías embrionarias. De hecho, la correlación entre los niveles
bajos de CoQ10 en plasma y los abortos espontáneos se informó previamente (Noiaet
al.,1996). Además, los niveles de CoQ10 en el líquido folicular se correlacionan con la
maduración del ovocito y el grado del embrión durantein vitro fecundación (Turiet al.,
2012). Nuestros resultados sugieren que el ovocito es el objetivo beneficioso de la
suplementación con CoQ10. Sin embargo, también es posible que las células de la
granulosa/cúmulo y/o el entorno uterino también puedan
892Envejecimiento de ovocitos y deficiencia de CoQ10, A. Ben-Meiret al.

(A) (B)

(C)

(D) (MI) (F)

Figura 5Disminución de la reserva ovárica y de la calidad de los ovocitos enPdss2fl/fl Cre+ratones es rescatado por la suplementación con CoQ10. (A) El recuento folicular de ovarios (media - SEM) de
ratones vehículo de 4 semanas de edad reveló una disminución de la reserva ovárica enPdss2fl/fl Cre+(n =8) en comparación conPdss2fl/fl cre-ratones (norte =5). La pérdida de folículos se refleja también
en la reducción de la tasa de ovulación (norte =8Pdss2fl/fl Cre+,norte =dieciséisPdss2fl/fl cre-). (B) El tratamiento con CoQ10 desde el nacimiento hasta las 7 semanas de edad evitó la pérdida de reserva
ovárica (media - SEM) y mejoró la tasa de ovulación desencadenada porPdss2deficiencia. (C) Oocitos dePdss2fl/fl Cre+exhiben disfunción mitocondrial con disminución de la reserva mitocondrial
respiratoria, potencial de membrana mitocondrial reducido (MMP) y disminución de la producción de ROS. Similar al envejecimiento, los niveles de MMP y ROS mitocondrial mejoraron
significativamente con la suplementación con CoQ10. (D) Producción de ATP por ovocito mejorada por la administración de CoQ10 enPdss2fl/fl Cre+hembras Todos los datos que se muestran son la
media - SEM obtenidos de 20 a 40 ovocitos. (E) La desalineación cromosómica fue significativamente más frecuente en los ovocitos dePdss2fl/fl Cre+(n =62) en comparación conPdss2fl/fl cre-(n =118), y
esto fue corregido por la administración de CoQ10 (norte =56). (F) Nivel de proteína anti-COQ6 en ovocitos GV en crecimiento.Pdss2fl/fl Cre+ovocitos presentes con niveles significativamente reducidos
de proteína CoQ6 (norte =31Pdss2fl/fl cre-,norte =44Pdss2fl/fl Cre+).

beneficiar y contribuir así a aumentar la capacidad reproductiva de las hembras
tratadas con CoQ10.
Debido a las limitaciones de la tecnología, no hemos podido medir los niveles de
CoQ9/10 en los ovocitos. Sin embargo, demostramos que la expresión de múltiples
enzimas de síntesis de CoQ disminuye con el envejecimiento en ovocitos humanos y
murinos, y la interrupción específica de la célula de la vía de síntesis de CoQ en
animales jóvenes tiene un impacto negativo en la calidad de los ovocitos. Así, los
ovocitos, similares a los podocitos en el riñón (Penget al.,2008), neuronas
dopaminérgicas en la sustancia negra (Ziegleret al.,2012) y células gliales/neuroblastos
en el cerebelo (Luet al.,2012), parecen ser exquisitamente sensibles a la disminución
de los niveles de CoQ. Como administración de CoQ10
mejores resultados reproductivos, disminución de la pérdida de folículos y mejora de
la energía mitocondrial de los ovocitos en el modelo animal envejecido, es tentador
proponer que la suplementación con CoQ10 en la dieta podría tener efectos
reproductivos beneficiosos en mujeres que buscan concebir a una edad más avanzada.
Si bien nuestros resultados en un modelo animal parecen prometedores, existen
enormes diferencias entre los ratones que envejecen y las mujeres, entre las que
destaca la diferencia de orden de magnitud en la esperanza de vida. En términos
relativos, el uso de CoQ10 durante 12 a 16 semanas en un ratón equivale a una década
en humanos. Además, se desconoce si un nutriente mitocondrial como la CoQ10 por sí
solo podría revertir el impacto de décadas de exposición ambiental de los ovocitos en
humanos. a gran escala adicional

ª2015 Los Autores.Célula de envejecimientopublicado por la Sociedad Anatómica y John Wiley & Sons Ltd.

Se necesitan estudios sobre la dosificación, la duración del tratamiento y la seguridad de los
resultados clínicos antes del uso de CoQ10 en un entorno clínico.
Procedimientos experimentales
animales y tratamiento
Se obtuvieron ratones hembra del Instituto de Investigación del Cáncer (ICR) de Harlan
Laboratories Inc. (Mississauga, Canadá). Todos los experimentos con ratones se realizaron de
acuerdo con las pautas del Canadian Council on Animal Care (CCAC) para el uso de animales
en la investigación y el cuidado de animales de laboratorio según los protocolos aprobados
por los comités de cuidado de animales en el Hospital Mount Sinai o el Centro de
Fenogenómica de Toronto. Todos los ratones se alojaron con libre acceso a comida y agua, y
se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h:12 h. Para los experimentos de
envejecimiento, solo se utilizaron reproductores probados (retirados), mientras que los
controles jóvenes eran hembras vírgenes (7 a 8 semanas de edad).
Para interrupción condicional dePdss2en ovocitos, ratones portadores del
alelo loxP dePdss2tm1.1Dalgse cruzaron con transgénicosZP3-Cre3Mrtanimales
(Lewandoskiet al.,1997), y el genotipado se realizó como se describió
anteriormente. La eficiencia de la escisión en la línea ZP3-Cre fue probada por el
BORRARCAG-Bgeo/ALPPreportero.
a-ácido lipoico (ALA), resveratrol (Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario, Canadá) y
CoQ10 (Sigma-Aldrich o Advanced Orthomolecular Research Inc., Calgary,
Alberta, Canadá) se disolvieron en aceite de sésamo. Ratones de nueve meses
de edad fueron inyectados por vía subcutánea con dosis de ALA (33 mg kg-1),
resveratrol (10 mg kg-1), CoQ10 (22 mg kg-1), o placebo (aceite de sésamo) tres
veces por semana durante un período de al menos 12 semanas, ya que un
tratamiento más corto no mostró efectos beneficiosos en los ensayos
preliminares de reproducción. Se utilizó un tratamiento de 12 a 13 semanas
para el análisis de varios resultados en los ovocitos ovulados. Para
experimentos de rescate en elPdss2modelo, las madres durante el embarazo y
sus crías después del destete recibieron CoQ10 (LiQsorb, Tishcon, Westbuty, NY,
EE. UU.) en agua potable (0,4 mg mL-1) (Saikiet al.,2008).
Para el desempeño reproductivo, las madres se establecieron con sementales machos
jóvenes de fertilidad comprobada y se revisaron diariamente para detectar signos de
embarazo y parto. Las madres se trataron previamente durante 12 semanas y se pusieron a
reproducirse mientras seguían siendo tratadas durante un período de un mes más (p. ej.,
tratamiento final hasta la semana 16). El tratamiento (inyecciones) se detuvo cuando la
hembra estaba preñada (según lo determinado por la ganancia de peso ~ día 10,5 después del
apareamiento). Todas las hembras adultas juntas se mantuvieron con los machos durante 4
semanas y 3 semanas más después, mientras que las jóvenesPdss2las hembras fueron
monitoreadas durante al menos 4 meses. Se utilizaron 21 hembras ICR de edad, aunque solo
15 produjeron una sola camada durante este período en el grupo de control. Se usaron doce
hembras para el tratamiento con CoQ10, de las cuales 11 produjeron una sola camada durante
la prueba de reproducción.
Inducción de la ovulación, recolección de ovocitos y evaluación de la
reserva ovárica
Los ratones fueron superovulados con gonadotropina sérica de yegua preñada
(ProSpec, Rehovot, Israel) y 48 h más tarde con gonadotropina coriónica humana (hCG)
(Sigma-Aldrich) por inyección intraperitoneal. A las hembras jóvenes se les
administraron 5 UI de ambas gonadotropinas, mientras que a las hembras mayores se
les administraron 10 UI. Los ratones se sacrificaron por dislocación cervical y se
extrajeron los oviductos. Los ovocitos se recuperaron en líquido tubárico humano
modificado (LifeGlobal, Guilford, CT, EE. UU.) suplementado con BSA al 0,1 % (Sigma-
Aldrich) y sin células del cúmulo utilizando hialuronidasa (Sigma-Aldrich). Los ovocitos
en etapa de vesícula germinal murina (GV) se recolectaron 48 h después del cebado
con PMSG. Los ovocitos humanos inmaduros (GV) no utilizados para la inseminación se
obtuvieron de mujeres de 27 a
ª2015 Los Autores.Célula de envejecimientopublicado por la Sociedad Anatómica y John Wiley & Sons Ltd.
Envejecimiento de ovocitos y deficiencia de CoQ10, A. Ben-Meiret al.893
45 años que estaban en tratamiento de FIV. El estudio fue aprobado por el
Hospital Mount Sinai (MSH Número REB: 05-0044-E), se obtuvo el
consentimiento de todos los sujetos y los experimentos se ajustaron a los
principios de la Declaración de Helsinki.
Los ovarios murinos se fijaron en fijador de Dietrich, se incrustaron, se
seccionaron en serie (completamente) y se tiñeron, y el número de folículos
sanos en varias etapas de desarrollo se determinó mediante recuentos
sistemáticos en cada décima sección, resumidos y multiplicados por un factor
de 10. Para la eficiencia de la escisión, los ovarios deBORRARZP3-Cre+las hembras
se recolectaron a los 2 meses de edad y las secciones congeladas se tiñeron
para determinar la actividad de la fosfatasa alcalina como se describió
anteriormente (Lobeet al.,1999). El número de ovocitos extirpados (p. ej., azul)
se determinó contando 5 secciones de ovario aleatorias de tres hembras.
Ensayos metabólicos, etiquetado mitocondrial y puntuación del
huso
Los ensayos metabólicos microanalíticos para los niveles de citrato, malato y fumarato
se realizaron como se describió anteriormente (Chiet al.,2002), y para el ensayo de
ATP, se utilizó Cell Titer GLO (Promega Madison, WI, EE. UU.) usando ATP como
estándar. Los ovocitos ovulados se tiñeron con MitoTracker Red, ROS – Mitosox
(Invitrogen, EE. UU.), DePsifer (Trevigen, Gaithersburg, MD, EE. UU.) y se realizó
autofluorescencia para FAD (FITC) como se describió anteriormente (Fernandeset al.,
2012). Para el consumo de oxígeno (MitoXpress Intra; Luxcel, Cork, Irlanda), la zona
pelúcida se eliminó con solución ácida de Tyrode y los ovocitos se cultivaron durante
un mínimo de 5 h en presencia de una sonda a la concentración recomendada por un
fabricante y posteriormente se tomaron imágenes en un disco giratorio. microscopio
confocal usando filtros apropiados. Se tomaron diez secciones ópticas de cada
muestra con 1 minuto de diferencia de cada ovocito y se analizaron con el software de
análisis de imágenes Volocity, PerkinElmer Inc., Waltham, MA, EE. UU. Los datos finales
se muestran como la proporción de estos valores. Los ensayos de ATP y consumo de
oxígeno fueron validados mediante el tratamiento de ovocitos con8yoMETROantimicina
durante 30 min (Fig. S5).
Los ovocitos se puntuaron según el aspecto de la estructura del huso y
la disposición de los cromosomas. El ovocito normal contenía un huso en
forma de barril con cromosomas condensados colocados en el centro del
ecuador del huso. La morfología anormal del huso incluía una reducción
en el número de microtúbulos o el tamaño del huso y el desprendimiento
del huso de los cromosomas. La dispersión o desalineación de los
cromosomas de la placa cromosómica también se definió como anormal.
inmunotinción
Las secciones de ovario fijadas en formalina tamponada neutra al 10 % se incluyeron
en parafina, se seccionaron y se rehidrataron. Se usó recuperación de antígeno con
tampón de citrato antes de la exposición al anticuerpo PDSS2 (1:40) seguido de ABC
Vectastain Kit (Dako, Glostrup, Dinamarca). Secciones dePDfl/fl ZP3-Cre+
las hembras se usaron como control negativo. Los ovocitos aislados en la
etapa GV se fijaron en fijador PHEM y se realizó inmunocitoquímica
indirecta de los ovocitos como se describió previamente (Fernandeset al.,
2012). Los anticuerpos primarios incluyeron antitubulina de ratón (1:500;
Invitrogen) y anti-CoQ6 o PDSS2 de conejo (1:100; 1:200, respectivamente;
Proteintech Group Inc, Chicago, IL, EE. UU.), seguido de incubación con
burro antiratón Alexa 488 o burro anti-conejo Alexa 594 (Invitrogen). El
ADN se contrastó con 40,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e imagen en
microscopio confocal. Los valores obtenidos de muestras sin anticuerpo
primario se restaron de las señales experimentales y los datos se
mostraron como la suma de la intensidad expresada como unidades
aleatorias de fluorescencia (RFU).
894Envejecimiento de ovocitos y deficiencia de CoQ10, A. Ben-Meiret al.
RT-PCR cuantitativa
Después de la recuperación de los ovocitos, se transfirieron tres ovocitos a una solución de
isotiocianato de guanidinio (GITC) y se preparó el ADNc para el análisis de PCR en tiempo real
como se describe (Perumalsamyet al.,2010). Las secuencias para cebadores directos e inversos
se enumeran en la Tabla S2. Todos los experimentos de expresión génica utilizaron la mezcla
de PCR verde SYBR con LiteCycler (Roche, Mississauga, ON, Canadá). Las condiciones de qRT-
PCR fueron las siguientes: 95°C durante 10 minutos y luego 40 ciclos de 95°C durante 30 s, 60°
C durante 30 s, y 72°C durante 30 s. Las comparaciones de los niveles de expresión se
determinaron mediante el método deltaCT normalizado ab-actina
mancha occidental
Se prepararon lisados de proteínas ováricas en tampón SDS-RIPA al 1 % que contenía
un cóctel inhibidor de proteasa completo (Roche) y se determinaron las
concentraciones de proteínas mediante el ensayo de proteínas BCA. Las muestras de
proteínas se resolvieron mediante geles de acrilamida al 12 % y se transfirieron a
membranas de PVDF. Después del bloqueo, las transferencias se probaron con anti-
CoQ6 o anti-PDSS2 de conejo (1:400 y 1:600, respectivamente; Proteintech Group Inc)
seguido de hibridación con anti-actina de cabra (Santa Cruz Biotechnology, Dallas,
Texas, EE. UU.) como control de carga. Las transferencias se lavaron e incubaron con
anticuerpos secundarios conjugados con HRP apropiados y ECL Plus.
Extracción y medición de ubiquinona
Para la determinación de las concentraciones de ubiquinona ovárica (UQ), se
homogeneizaron ovarios e hígados completos en 0,5 ml de tampón de
homogeneización (0,25METROsacarosa, 10 mMETROTampón Hepes pH 7,4, 1 mMETROEDTA)
con diez pasadas del homogeneizador de teflón (Wheaton Overhead Stirrer, Wheaton
Instruments, Millville, NJ, EE. UU.). Después de que el volumen total se hizo hasta 500
yoL con el tampón de homogeneización, 5yoL de los homogeneizados se utilizó para
determinar su contenido de proteína total utilizando el reactivo de Bradford (Bio-Rad
Mississauga, ON, Canadá). Para extraer UQ, los homogeneizados de ovario completo
se mezclaron con un volumen igual de hexano/etanol durante 10 min mediante
agitación vorticial. Después de la centrifugación a 9000gramodurante 10 min, la capa
de hexano se recogió y se evaporó hasta sequedad utilizando una centrífuga de vacío
(Eppendorf, Mississauga, ON, Canadá). Luego, el residuo de quinona se disolvió en
etanol al 100% y se analizó por HPLC con detección UV a 275 nm (Beckman System
Gold, Beckman Coulter Inc, Brea, CA, EE. UU.). Una columna de fase inversa C18 (25,09
0,46 cm, 5yom, Hichrom, Berkshire, Reino Unido) con una elución isocrática a un
caudal de 1,8 mL min-1. La fase móvil fue metanol/etanol (70:30 v/v). Las
concentraciones de ubiquinonas se estimaron por comparación del área del pico con
las de las soluciones estándar de concentración conocida. Finalmente, la cantidad de
quinona se normalizó al contenido de proteína en las muestras.
análisis estadístico
Todos los resultados se dan como media - SEM. Todas las pruebas estadísticas se
realizaron con SIGMAPAGSLOTE11 (Systat Software Inc., San José, CA, EE. UU.). Los análisis
se realizaron con un método unidireccionalANOVAseguido de la prueba posterior de
Tukey o Dunn, la prueba de suma de rangos de Mann-Whitney, con la prueba t de
Student o el análisis de chi-cuadrado, según corresponda. Los resultados se
consideraron estadísticamente significativos sipag <0.05.
Reconocimiento
Los autores desean agradecer a A. Perumalsamy por su ayuda con el análisis de los
datos de qPCR. Nos gustaría expresar nuestro agradecimiento a los pacientes por las
donaciones de ovocitos inmaduros para este estudio.
ª2015 Los Autores.Célula de envejecimientopublicado por la Sociedad Anatómica y John Wiley & Sons Ltd.
Fondos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones operativas de los Institutos Canadienses de
Investigación en Salud (14058, 112220, 84328, 123518) y el programa CRC/CFI de la
Cátedra de Investigación de Canadá (AJ).
Conflicto de intereses
Todos los autores excepto RFC declaran no tener conflicto de intereses. RFC es
un consultor pagado por Fertility Nutraceuticals.
Contribución del autor
ABM, EB, ABA, JC, EW, TY, TN, MC, YW, HS y AJ realizaron los experimentos;
ABM, YB, KHM, SH, RFC y AJ diseñaron experimentos y analizaron datos;
JA, JM y DLG proporcionaron los reactivos. ABM, RFC y AJ escribieron el
artículo.
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información de soporte
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Figura S1. (A) Tasa de ovulación de ratones de 12 meses de edad del vehículo de control (n =9),
CoQ10 (norte =8), ALA (norte =7) y Resveratrol (norte =9) hembras tratadas. El grupo tratado
con CoQ10 fue el único que mostró un aumento significativo en la tasa de ovulación en
comparación con el control. (B) Reserva de folículos ováricos en reproductoras retiradas ICR a
los 9 meses de edad al inicio del tratamiento y después de los 12 meses de edad (los datos
para 12 meses son los mismos que los de la Fig. 1).
Figura S2. (A) Nivel de expresión génica (ARNm) en ovocitos GV de ratones jóvenes, viejos y
viejos tratados con CoQ10 que no mostraron cambios significativos con la edad y/o con el
tratamiento. Los valores representan la relación deb-actinapara apuntar a los niveles de
genes. (B) Los niveles de fumarato no se redujeron significativamente con la edad, pero
aumentaron con el tratamiento con CoQ10.
Figura S3.Validación de la actividad de ZP3Cre en ovocitos. (A) Ovarios deBORRARCAG-
Bgeo/ALPP ZP3-Cre+ratones. La actividad de Cre está restringida a los ovocitos y ya se inicia en la
etapa de folículo primordial (flechas). (B) Los niveles de proteína PDSS2 se redujeron
significativamente en ovocitos GV en crecimiento de 3 semanas de edadPdss2fl/fl Cre+
(n =14) en comparación conPdss2fl/fl cre-(n =12), lo que indica la eficiencia de la escisión. (C) Los
folículos antrales con ovocitos completamente desarrollados presentan ausencia de actividad
de Pdss2 en Pdss2fl/fl Cre+ratones (puntas de flecha), mientras que todavía se observa
inmunorreactividad en las células del cúmulo que rodean al ovocito (flechas). (D) Desempeño
reproductivo de jóvenes fl/fl y fl/flCre+ratones durante 4 meses de ensayo de cría.
Figura S4.La suplementación con CoQ10 (LiQsorb) no tiene efecto sobre (A) la reproducción
(por ejemplo, el tamaño de la camada), (B) las tasas de ovulación, (C) la reserva ovárica, (D) la
respiración mitocondrial (intensidad de Mitotracker Red o producción de ROS) y E) la ovulación
de ovocitos cromosómicamente anormales en hembras jóvenes (hasta 3–4 meses de edad)
Pdss2 fl/fl (WT) y (F) nivel de ATP. Sin embargo, de manera similar a la administración
subcutánea de CoQ10, LiQsorb mejoró el nivel de ATP en los ovocitos en hembras Pdss2 fl/fl
tratadas de 12 meses de edad (G).
Figura S5.Validación de ATP y ensayo de consumo de oxígeno. Los ovocitos ovulados se
recogieron y se cultivaron en medio HTF con o sin antimicina durante 30 min seguido de la
medición de ATP (nMETRO) (A) o consumo de oxígeno basado en imágenes de MitoXpress Intra
(B) expresado como proporción de la fluorescencia de la sonda tomada en un intervalo de 1
min. Los datos mostrados son medios - SEMnorte =16 ovocitos para experimento ATP ynorte =
10 para el experimento de consumo de oxígeno. Ambos ensayos muestran una reducción
significativa de la señal (pag <0,001) después de inhibir la actividad del Complejo III.
Tabla S1.Nivel de CoQ9 y CoQ10 (ng mg-1de proteína) después de la
suplementación en varios tejidos.
Tabla S2.Lista de cebadores utilizados para estudios de expresión génica.