Los nuevo engl y revista de medicamento

Artículo original

Mutaciones en TUBB8 y ovocito humano

Arresto meiótico

Ruizhi Feng, Ph.D., Qing Sang, Ph.D., Yanping Kuang, MD, Xiaoxi Sun, MD, Zheng Yan, Ph.D.,
Shaozhen Zhang, MD, Juanzi Shi, MD, Guoling Tian, Ph.D .,
Anna Luchniak, Ph.D., Yusuke Fukuda, Ph.D., Bin Li, MD, Min Yu, MD, Junling Chen, MD, Yao
Xu, Ph.D., Luo Guo, Ph.D., Ronggui Qu, MS, Xueqian Wang, Ph.D., Zhaogui Sun, Ph.D., Miao
Liu, Ph.D., Huijuan Shi, Ph.D., Hongyan Wang, Ph.D., Yi Feng, MD, Ruijin Shao, Ph.D., Renjie
Chai, Ph.D., Qiaoli Li, Ph.D., Qinghe Xing, Ph.D., Rui Zhang, Ph.D., Eva Nogales, Ph.D.,

Li Jin, Ph.D., Lin He, Ph.D., Mohan L. Gupta, Jr., Ph.D.,

Nicholas J. Cowan, D. Phil. Y Lei Wang, Ph.D.

RESUMEN

ANTECEDENTES

La reproducción humana depende de la fusión de un ovocito maduro con un espermatozoide Las afiliaciones de los autores se enumeran en el
para formar un huevo fertilizado. Los eventos genéticos que conducen a la detención del ovocito humano Apéndice. Dirija las solicitudes de reimpresión al Dr.
L. Wang en wangleiwanglei@fudan.edu.cn , o al Dr.
se desconocen la maduración. Cowan en nicholas.cowan @ nyumc.org.

MÉTODOS
Drs. R. Feng, Sang, Kuang, X. Sun, Yan y S. Zhang
Secuenciamos los exomas de cinco miembros de una familia de cuatro generaciones, tres de los cuales tenían
contribuyeron igualmente a esto.
infertilidad debido a la meiosis de ovocitos que detengo. Realizamos la secuenciación de Sanger de un gen artículo.

candidato, TUBB8, en muestras de ADN de estos miembros, miembros adicionales de la familia y miembros de otras
N Engl J Med 2016; 374: 223-32.
23 familias afectadas. La expresión de TUBB8 y todos los demás isotipos de β-tubulina se evaluó en ovocitos DOI: 10.1056 / NEJMoa1510791

humanos, embriones tempranos, espermatozoides y varios tejidos somáticos mediante un ensayo cuantitativo de Copyright © 2016 Sociedad Médica de Massachusetts.

reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa. Evaluamos el efecto del TUBB8 mutaciones en el
ensamblaje del heterodímero que consiste en un polipéptido de α-tubulina y un polipéptido de β-tubulina
(heterodímero de α / β-tubulina) in vitro, en la arquitectura de los microtúbulos en las células HeLa, en la dinámica de
los microtúbulos en las células de levadura y en el ensamblaje del huso en ovocitos de ratón y humanos.

RESULTADOS

Identificamos siete mutaciones en el gen específico de primates TUBB8 que fueron responsables de la meiosis de
ovocitos que detengo en 7 de las 24 familias. TUBB8 la expresión es exclusiva de los ovocitos y del embrión temprano,
en el que este gen representa casi toda la β-tubulina expresada. Las mutaciones afectan el plegamiento dependiente de
la chaperona y el ensamblaje del heterodímero α / β-tubulina, interrumpen el comportamiento de los microtúbulos en la
expresión en células cultivadas, alteran la dinámica de los microtúbulos in vivo y causan defectos catastróficos en el
ensamblaje del huso y detención de la maduración en la expresión en ratones y ovocitos humanos.

CONCLUSIONES

TUBB8 las mutaciones tienen efectos dominantes-negativos que alteran el comportamiento de los microtúbulos y el
ensamblaje y maduración del huso meiótico de los ovocitos, lo que causa infertilidad femenina. (Financiado por el Programa

Nacional de Investigación Básica de China y otros).

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S
ausente en los dos controles, y no había
comienza cuando un ovocito en metafase II se fusiona o si tenía una prevalencia
reproducción
con humana
un espermatozoide exitosa
para formar un óvulo fertilizado. por debajo del 0,1% en la base de datos de variantes de 1000
En los ovocitos humanos, el ciclo celular meiótico comienza en el genomas, la base de datos del Proyecto de secuenciación del
ovario neonatal y se detiene en la profase I de la meiosis hasta la exoma del NHLBI (Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la
pubertad, cuando un aumento de la hormona luteinizante estimula Sangre) y el Consorcio de agregación del exoma. Realizamos la
la reanudación de la meiosis y la ovulación. Esto conduce a la secuenciación de Sanger del gen candidato en miembros de las
progresión del ovocito de la metafase I a la metafase II. 1-3 familias 1 a 24 (consulte la sección de métodos en el apéndice
complementario para obtener más detalles). Analizamos la
Los ovocitos detenidos en la profase I tienen un núcleo intacto, expresión génica en ovocitos, predecimos los efectos de las
denominado vesícula germinal, mientras que los ovocitos que han mutaciones candidatas en la estructura de la proteína y probamos
reanudado la meiosis se caracterizan por la ruptura de la vesícula los efectos funcionales de las mutaciones in vitro, en células HeLa,
germinal. Después de la ruptura de la vesícula germinal, la metafase en levadura y en ovocitos de ratón y humanos (ver la sección de
I se completa mediante la extrusión de un cuerpo polar y la división Métodos en el Apéndice complementario).
asimétrica. Los ovocitos maduros se detienen nuevamente en la
metafase II. 4 En la mayoría de los mamíferos, esta es la única etapa
en la que los ovocitos pueden fertilizarse con éxito. 1

Resultados

La fertilización in vitro (FIV) ahora representa del 1 al 3% de los TUBB8 y detención de la maduración de ovocitos

nacimientos en todo el mundo. 5 Es común que algunos ovocitos humanos

permanezcan inmaduros después de la estimulación ovárica y la
administración de gonadotropina coriónica humana. 6 pero se ha
informado la detención completa de la maduración de los ovocitos en
solo unas pocas mujeres, 7-12 y no se sabe nada sobre la causa
genética de este fenotipo.
Métodos
Participantes del estudio
Los pacientes con detención de la maduración de los ovocitos de 24
familias fueron remitidos desde el Centro de Medicina Reproductiva
del Noveno Hospital, afiliado a la Universidad Jiao Tong de
Shanghai, el Instituto de Genética e FIV de Shanghai Ji Ai y el
Centro de Servicios de Atención Maternoinfantil de Shaanxi. La
Identificamos una familia de cuatro generaciones (Familia 1) con un
patrón autosómico dominante poco común de herencia de infertilidad
femenina primaria (Fig. 1). Los cónyuges de las mujeres afectadas
tenían recuentos de espermatozoides normales, con características
morfológicas y motilidad de los espermatozoides normales. El intento de
FIV en el Paciente III-5 dio como resultado ovocitos que estaban en
metafase I (Tabla 1); estos ovocitos no maduraron incluso después de
un cultivo prolongado in vitro. En el Paciente III-4, la inyección
intracitoplasmática de espermatozoides produjo tres ovocitos en
metafase I y uno con características morfológicas anormales; ninguno de
estos ovocitos tenía un huso visible en el microscopio de polarización
Figura 1 (página opuesta). Pedigríes y TUBB8 Situación de las familias

junta de revisión institucional de la Facultad de Medicina de afectadas por el arresto de ovocitos.

Shanghai de la Universidad Fudan aprobó el estudio y los
participantes proporcionaron su consentimiento informado por
escrito. Se proporciona información adicional en la sección de
Métodos en el Apéndice complementario, disponible con el texto
completo de este artículo en NEJM.org.
Procedimientos de estudio
Secuenciamos los exomas de tres mujeres afectadas y dos
mujeres no afectadas de la Familia 1, utilizando la captura
Agilent SureSelect Whole Exome y la tecnología de
secuenciación Illumina. Se consideró que una variante era una
mutación candidata si estaba presente en las tres mujeres
afectadas,
Pedigríes de siete familias con heredado o de novo
TUBB8 se muestran mutaciones. Los cuadrados denotan a miembros
masculinos de la familia, círculos a miembros femeninos de la familia,
símbolos sólidos a miembros de la familia afectados y símbolos abiertos a
miembros de la familia no afectados. Las líneas horizontales dobles cortas
indican que no hubo descendencia. Las flechas indican los probandos en las
familias 1 y 2. La familia 1 incluye cinco mujeres afectadas con infertilidad
primaria a largo plazo. La mutación V229A en TUBB8 fue heredado del padre
de cada mujer afectada. El miembro de la familia IV-2 es una niña de 7 años
que porta la mutación y no se pudo evaluar la fertilidad. Las mutaciones
D417N, M363T, R2K y M300I se identificaron en las familias 2,
5, 6 y 7, respectivamente; la transmisión paterna es evidente. Las mutaciones
S176L y R262Q identificadas en las familias 3 y 4 son de novo. Los
cromatogramas de secuenciación de Sanger se muestran cerca de los
pedigríes. W denota tipo salvaje.

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(Fig. 2A y 2B), y la abfección morfológica) implicaba una única mutación: un ovocito heterormal que luego no pudo
fertilizarse. mutación zygous missense c.T686C (p.V229A) en
Análisis de la secuencia del exoma completo en cinco miembros: la región codificante de TUBB8, un gen que codifica bers de la Familia 1
(tres afectados y dos no af- un isotipo de tubulina β específico de primates, la función

Infertilidad primaria

Familia 1
? Fertilidad no evaluada
(c.T686C, V229A, heredado)

yo
c.T686C
V229A

II
II-4
1 2 3 4 5 T GG T / C GRAMO T C

W / WW / W V229A / W W/W

II-5
III T GG T GRAMO T C

1 2 3 4 5 6 7
V229A / W V229A / W V229A / W V229A / WW / W

IV ? III-5
T GG T / C GRAMO T C
1 2
V229A / W

Familia 2 c.G1249A
(c.G1249A, D417N, heredado) D417N

yo
I-1
1 2 Automóvil club británico C GEORGIA UNA CC
D417N / W W/W

I-2
II Automóvil club británico C GRAMO UNA CC

1 2 W/W 3W/W
D417N / W D417N / W

II-2
W / WW / W Automóvil club británico C GEORGIA UNA CC

Familia 3 Familia 4 Familia 5 Familia 6 Familia 7

(c. C527T, S176L, (por ejemplo, G785A, R262Q, (c. T1088C, M363T, (por ejemplo, G5A, R2K, (por ejemplo, G900A, M300I,

de novo) de novo) heredado) heredado) heredado)

yo

1 2 1 2 1 2 1 2 1
W/W W/W W/W W/W M363T / WW / W R2K / WW / W M300I / W desconocido

II
1 1 1 1 1
S176L / W R262Q / W M363T / W R2K / W M300I / W

c.C527T c.G785A c.T1088C c.G5A c.G900A

S176L R262Q M363T R2K M300I

I-1 I-1
T GRAMO T C GG UNA C C C GG C T AAA T / C GRAMO T C T GRAMO UNA G / AGG UNA GRAMO UNA T MORDAZA C T

I-2 II-1
T GRAMO T C GG UNA C C C GG C T AAA T GRAMO T C T GRAMO UNA GGG UNA GRAMO UNA T MORDAZA C T

II-1
T GRAMO T CONNECTICUT GG UNA CCC MORDAZA C T AAA T / C GRAMO T C T GRAMO UNA G / AGG UNA

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Tabla 1. Características clínicas y características de los ovocitos recuperados en pacientes de las siete familias con TUBB8 Mutaciones. *

No. de anteriores Total No.

Duración FIV o ICSI de ovocitos
Familia y paciente No. Mutación Años de infertilidad Ciclos Recuperado Etapa o etapas de los ovocitos

año

Familia 1, Paciente III-4 V229A 37 8 1 4 3 en MI, 1 con características

morfológicas anormales

Familia 1, Paciente III-5 V229A 32 10 2 21 21 en MI

Familia 2, Paciente II-2 Familia D417N 37 9 5 37 7 en GV, 30 en MI 3 en

3, Paciente II-1 Familia 4, S176L 34 10 4 43 GV, 40 en MI

Paciente II-1 Familia 5, R262Q 37 10 2 12 12 en MI

Paciente II-1 Familia 6, M363T 25 4 3 18 1 en GV, 17 en MI 2 en

Paciente II-1 Familia 7, R2K 33 7 2 54 GV, 52 en MI

Paciente II-1 M300I 26 6 2 26 26 en MI

* GV denota vesícula germinal, inyección intracitoplasmática de espermatozoides ICSI, fertilización in vitro de FIV y metafase I de MI.

ción de los cuales no se había determinado. Esta mutación se
cosegregó con la infertilidad femenina en la Familia 1 y se
caracterizó por la transmisión paterna (Fig. 1). Posteriormente
identificamos otros seis TUBB8 mutaciones en siete pacientes
infértiles con un fenotipo similar de detención de la maduración de
los ovocitos: dos pacientes de la Familia 2 (c.G1249A,
resto en las familias 1 a 7. La ubicación y conservación
evolutiva estricta de los residuos afectados se muestran en
la Figura S3 en el Apéndice complementario.
TUBB8 y suministro de β-tubulina en ovocitos humanos

Los microtúbulos son polímeros dinámicos ensamblados a partir

p. D417N), un paciente de la Familia 5 (c.T1088C,
p.M363T), un paciente de la Familia 6 (c.G5A, p.R2K) y un
paciente de la Familia 7 (c.G900A, p.M300I) (todas estas
mutaciones fueron de transmisión paterna), así como
mutaciones de novo en un paciente de la Familia 3 (c.C527T,
p.S176L) y un paciente de la Familia 4 (c.G785A, p.R262Q)
(Fig. 1). Sin mutaciones en TUBB8 se detectaron en 17
pacientes adicionales que eran de las otras 17 familias con
infertilidad primaria. Cada paciente de las familias 2 a 7 se
sometió de dos a cinco intentos fallidos de FIV o de inyección
intracitoplasmática de esperma. Casi todos los ovocitos
recolectados durante estos intentos se detuvieron en la
metafase I, y ninguno tenía un huso visible (Tabla 1 y Fig. S1
en el Apéndice complementario). La inmunotinción de un
ovocito en metafase I de cada uno de los pacientes de las
familias 1, 2, 3, 4 y 6 reveló un huso anormal o ningún huso
detectable (Fig. 2C). Por tanto, todos los pacientes carecían de
ovocitos maduros en metafase II.
Estos resultados y un análisis de la expresión específica de
alelos en un solo ovocito S176L (Fig. S2A y S2B en el Apéndice
complementario) implican que el TUBB8 Es probable que las
mutaciones hayan sido responsables de la maduración de los
ovocitos.
de heterodímeros que constan de un polipéptido de α-tubulina y un
polipéptido de β-tubulina (α / β-tubulina). 13 Nueve isotipos de
β-tubulina se expresan en mamíferos; estos se distinguen
principalmente por variaciones en la cola C-terminal ácida que
afectan funciones celulares específicas. 14 Mutaciones en
TUBB1, TUBB2A, TUBB2B, TUBB3, TUBB4A, y
TUBB4B han sido descritos; estos causan una amplia gama de
enfermedades, que generalmente involucran defectos basados en
microtúbulos en la migración neuronal. 15-17
A pesar de que TUBB8 tiene la secuencia de un gen de la tubulina,
se desconoce su función. Es inusual porque existe solo en primates.
Hipotetizamos que en primates, TUBB8 influye en el comportamiento
de los microtúbulos en los ovocitos, en los que la autoorganización
de los microtúbulos y las proteínas motoras dirigen el ensamblaje del
huso meiótico y la orientación cromosómica. 18,19 Sorprendentemente,
encontramos que TUBB8 es el único isotipo de β-tubulina expresado
en un nivel alto en diferentes etapas del desarrollo de los ovocitos
humanos y está esencialmente ausente en los espermatozoides
maduros y en los tejidos somáticos como el cerebro y el hígado (Fig.
S4 en el Apéndice complementario). Inmunotención de ovocitos
humanos en diferentes etapas de desarrollo con el uso de un
anticuerpo anti-TUBB8 ostensiblemente específico, o un anti-FLAG

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Figura 2. Fenotipos de ovocitos con detención de la maduración. UNA Ovocitos normales

Un ovocito normal (Panel A) y un ovocito del probando de la Familia 1 (Panel MI MII

B) se separaron de las células de la granulosa y se examinaron mediante

Ligero
microscopía de luz y polarización. El ovocito normal en metafase II (MII) Microscopio
tiene un primer cuerpo polar (flecha negra en el panel A), y los ovocitos
normales en metafase I (MI) y MII tienen husos visibles (flechas blancas en
el panel A). Todos los ovocitos del paciente están en MI y ninguno tiene un
Polarización
primer cuerpo polar (Panel B) (Fig. S1 en el Apéndice complementario). Los
Microscopio
ovocitos en pacientes de la Familia 1 (Panel B) y de las Familias 2 y 6 (Fig.
S1 en el Apéndice complementario) no tienen huso visible (no se obtuvieron
datos de microscopía de polarización para los ovocitos del paciente de la
Familia 3). En las imágenes microscópicas de polarización en el Panel B, el
segundo Ovocitos de III-4 en la familia 1 (V229A)
rojo indica la reflexión interna de la señal de luz de entrada; para la
visualización de los ovocitos del paciente, Se utilizó la mayor intensidad de
entrada posible para descartar la posibilidad de que estuviera presente algún Ligero

cabezal. Los ovocitos normales y los ovocitos de los miembros de la familia Microscopio

afectados (Panel C) se inmunomarcaron con anticuerpos contra la β-tubulina

para visualizar el huso (verde) y se contratiñeron con Hoechst 33342 para
visualizar el ADN (azul).
Polarización
Microscopio

C Inmunomarcación y contratinción para visualizar el huso y el ADN

β-tubulina Hoechst Unir

anticuerpo, en el caso de un ovocito de vesícula germinal humana

microinyectado con TUBB8 – BANDERA Tipo salvaje

ARN complementario - confirmó que TUBB8 está

localizado en el huso (Fig. S5 en el Apéndice
complementario).
S176L
Implicaciones estructurales

Mapeamos los residuos mutantes de TUBB8 en la estructura

atómica de la tubulina (código 3JAS de Protein Data Bank
[PDB]). 20 S176 se encuentra en una interfaz longitudinal entre D417N
dímeros ensamblados, donde interactúa con la α-tubulina (Fig.
S6A en el Apéndice complementario), y se encuentra en una
región clave (V177-S178-D179) en la β-T5 bucle que cambia en
la hidrólisis de trifosfato de guanosina (GTP). 20,21 Es probable que V229A

la mutación S176L interrumpa las interacciones longitudinales,

inhibiendo así el ensamblaje de microtúbulos. M363 puede
interactuar con V288 dentro de la región del bucle M de la
proteína (Fig. S6B en el Apéndice complementario); la mutación R262Q

M363T podría debilitar potencialmente la interacción con V288 y,

por tanto, causar inestabilidad de los microtúbulos. 22 D417 y
R262 interactúan, formando un puente de sal en la superficie
exterior del microtúbulo (Fig. S6C en el Suplementario R2K

Apéndice); este puente sería roto por las proteínas asociadas a los microtúbulos. Mutaciones M300 y V229 D417N y R262Q. D417
está involucrado están enterrados dentro de la subunidad β-tubulina y en la unión de kinesina, 23 y su mutación haría que su
mutación pudiera desestabilizar su plegamiento (Fig. probablemente afectaría negativamente la interacción entre S6B en el
Apéndice complementario). Finalmente, los microtúbulos R2 y la quinesina y posiblemente otros se encuentran en la interfaz α-β
dentro del hetero-

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UNA segundo

Contra la bandera Anti-α-tubulina Unir Normal Anormal Borrado

Bajo

100

Normal 80

Porcentaje de células
60

40

20

0
SO
PE A
7N 6L 2Q 3T 2K 0I
29 7
36
R 30
V2 41 S1 26 M
D R M
Intermedio
100

Anormal 80

Porcentaje de células
60

40

20

0
O
2K 0I
S
PE A
7N 6L 2Q 3T
29 7
36
R 30
V2 41 S1 26 M
D R M
Alto
100

80
Porcentaje de células
Borrado 60

40

20

0
SO
PE A
7N 76
L
2Q 3T 2K 0I
29 36
R 30
V2 41 S1 26 M
D R M

Figura 3. Efectos de formas mutantes y de tipo salvaje de TUBB8 sobre microtúbulos en células HeLa.

Las células HeLa se transfectaron con construcciones diseñadas para expresar TUBB8 etiquetado con FLAG en el extremo C (tipo salvaje y mutante). El panel A muestra los
resultados de la inmunotinción con anticuerpo contra el epítopo FLAG para detectar la expresión del transgén (verde) y la inmunotinción con anticuerpo de α-tubulina para detectar
la red de microtúbulos endógenos (rojo). Se muestran ejemplos de células que expresan los diversos transgenes, con microtúbulos ensamblados en una red de interfase normal o
anormal o con la obliteración completa de la red de microtúbulos; en las últimas células, la marca FLAG aparece como un patrón moteado difuso en todo el citoplasma. La barra
indica 10 μm. El panel B muestra un análisis cuantitativo de los fenotipos de microtúbulos que se muestran en el panel A. La baja expresión de TUBB8 mutante se asoció
típicamente con el fenotipo normal, mientras que la expresión intermedia y alta de TUBB8 mutante se asoció típicamente con los fenotipos anormales y borrados. Se examinaron
aproximadamente 200 células transfectadas que expresaban TUBB8 de tipo salvaje o mutante en cada uno de tres experimentos separados. Se muestran los porcentajes medios
de células asignadas a cada categoría fenotípica (red de microtúbulos normal, anormal u obliterada); yo las barras indican desviaciones estándar.

dímero (Fig. S6A en el Apéndice complementario); su sustitución
podría afectar el ensamblaje y la estabilidad del dímero.
Ensamblaje de heterodímero de α / β-tubulina in vitro
La generación de novo de heterodímeros de tubulina requiere la
acción concertada de un espectro de chaperonas: prefoldina
(PFD), la chaperonina citosólica dependiente de ATP (CCT) y
cinco chaperonas específicas de tubulina (TBCA, TBCB, TBCC,
TBCD,
y TBCE) que funcionan en concierto corriente abajo de CCT como una
nanomáquina de ensamblaje de heterodímero dependiente de GTP. 24 Para
investigar posibles defectos de pliegue incurridos como resultado de la
mutación, monitoreamos el ensamblaje de 35 Polipéptidos TUBB8 de
tipo salvaje y portadores de mutantes marcados con S cinéticamente.
Ninguna de las mutaciones tuvo influencia sobre la eficiencia de
traducción (Fig. S7A en el Apéndice complementario). Sin embargo,
las proteínas mutantes TUBB8 mostraron un espectro de
cuantificación

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diferencias positivas en el flujo característico de la etiqueta de que la alteración está fuertemente influenciada por el contexto del isotipo
los complejos binarios PFD-β-tubulina y CCT-β-tubulina a de la β-tubulina.
TBCA-β-tubulina y TBCD-β-tubulina, en comparación con el Para evaluar la capacidad del TUBB8 mutaciones para
control de tipo salvaje (Fig. S7B y Tabla S2 en el Apéndice interferir con la dinámica de los microtúbulos, examinamos las
complementario). Estos datos revelan una serie de defectos de consecuencias de incrustarlos en
ensamblaje de heterodímeros causados por TUBB8 TUB2 en Saccharomyces cerevisiae ( Fig. S9 en el Apéndice
complementario). Obtuvimos cepas de levadura diploide con
mutaciones. Algunos de estos defectos son atribuibles a cada mutación en estado heterocigoto, con la excepción de
cambios en los equilibrios que gobiernan el ensamblaje de S176L. Descubrimos que, al igual que las esporas de levadura
novo de heterodímeros 24 que llevan la mutación D417N, 26 las de las cepas que portaban la
o mal plegado; la mayoría conduce a una disminución del rendimiento de mutación V229A o la mutación R262Q no fueron viables, una
heterodímeros ensamblados. observación que es consistente con una alteración sustancial de
la función de los microtúbulos (Fig. S10 en el Apéndice
Interrupción de microtúbulos in vivo complementario). Las esporas haploides que albergan R2K,
Para determinar la influencia de la TUBB8 mutaciones en el M300I y M363T eran viables pero con diversos grados de
comportamiento de los microtúbulos in vivo, trans- fectamos deterioro del crecimiento.
construcciones etiquetadas con FLAG en células cultivadas (HeLa).
En el caso de TUBB8 de tipo salvaje, observamos el ensamblaje
conjunto en una red de microtúbulos normal (Fig. 3A), excepto en En comparación con la cepa de control, las cepas
niveles altos de expresión de genes trans. Por el contrario, el con las mutaciones R262Q y D417N tenían mayor
mutante TUBB8, a niveles intermedios o altos de expresión, se resistencia al fármaco desestabilizador de microtúbulos
incorporó a los microtúbulos con una apariencia anormal y con benomyl, reflejando microtúbulos inusualmente estables
frecuencia causó la pérdida completa de la red de microtúbulos in vivo. Por el contrario, las mutaciones R2K, V229A,
("obliteración"). El fenotipo de obliteración se asoció más M300I y M363T disminuyeron la resistencia al benomilo,
fuertemente con las mutaciones que se predice que interferirían con lo que sugiere que desestabilizan predominantemente
la estabilidad del heterodímero, el plegamiento de la β-tubulina o la los microtúbulos in vivo (Fig. S11A y S11B en el
Apéndice complementario). Además, en las células que
polimerización (V229A, S176L, M363T, R2K y M300I), mientras que
se causó una organización alterada de los microtúbulos. por expresan la proteína fluorescente verde-α-tubulina, los
mutaciones que se predice que interfieren con la unión de la microtúbulos astrales en las células heterocigotas
quinesina (R262Q y D417N) (Fig. 3B). V229A y R2K se despolimerizaron casi el doble de
rápido y la frecuencia de rescate (es decir, la frecuencia
con la que la despolimerización catastrófica de los
microtúbulos se convierte en microtúbulos crecimiento)
Repetimos estos experimentos de expresión utilizando se redujo notablemente, en comparación con las células
constructos en los que introdujimos tres de los TUBB8 mutaciones
de control (Fig. S11C en el Apéndice complementario).
en TUBB5
(también llamado TUBB), un isotipo de β-tubulina que, a
diferencia de TUBB8, se expresa ampliamente en tejidos de
mamíferos, especialmente en el sistema nervioso central en
desarrollo. 25 Encontramos que TUBB5-FLAG de tipo salvaje
invariablemente se incorporó a una red de microtúbulos normal,
mientras que la expresión de S176L, M363T y R262Q en el
contexto de TUBB5-FLAG causó una variedad de fenotipos de
microtúbulos anormales que eran similares a los visto en
experimentos paralelos realizados en el contexto de TUBB8 –
FLAG, pero a una frecuencia muy reducida (Fig. S8 en el TUBB8 y conjunto de husillo deteriorado
Apéndice complementario). Concluimos que la expresión in vivo Establecer la relación causal entre mutaciones en TUBB8
de mutaciones TUBB8 resulta en la alteración de la arquitectura y el fenotipo de infertilidad, microinyectamos de tipo
de los microtúbulos, con el grado de alteración dependiendo de salvaje y mutado
la mutación, y TUBB8 ARN en ovocitos de ratón. Para ovocitos microinyectados con tipo
salvaje TUBB8 ARN, la maduración fue normal aproximadamente 12 horas
después de la germinación.

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UNA Figura 4. Mutado TUBB8 ARN en ovocitos humanos y de ratón.

75
El panel A muestra las tasas de extrusión de cuerpos polares en ovocitos de
ratón inyectados con ARN mutado en comparación con las tasas en un control
de tipo salvaje. Las tasas, que se muestran como la media de las tasas en tres
Tasa de extrusión del cuerpo polar (%)

50 experimentos, disminuyeron significativamente en los ratones con ARN mutado.

Las barras T indican desviaciones estándar. Un solo asterisco indica P <0,01 y
un asterisco doble P <0,001, en comparación con los ovocitos de tipo salvaje;
* * * * Los valores de P se basan en pruebas t para datos no apareados. Los paneles B
*
25 * y C muestran inmunotinción de ovocitos de ratón (Panel B) y humanos (Panel C)
microinyectados con ARN que codifica TUBB8 de tipo salvaje o mutante (S176L
** o D417N) 12 horas (ratón) y 16 horas (humano) después de la vesícula germinal.
Descompostura. Los ovocitos MI se tiñeron con Hoechst 33342 para visualizar
0
los cromosomas (azul), β-tubulina para visualizar los husos (verde) y FLAG para

2K
6L
A

2Q

3T

0I
7N
je

visualizar TUBB8 (rojo).

29

R
7

30
va

36
26
41

S1
V2
l

M
sa

M
R
D
po
Ti

segundo

β-tubulina Bandera Hoechst Unir

de cualquiera de los mutados TUBB8 Los ARN dieron como resultado

Tipo salvaje
una detención de la maduración y un huso deformado, así como una
reducción en la tasa de extrusión del primer cuerpo polar (tasa de 6 a
33% frente a una tasa media [± DE] de 61 ± 2,2% en la naturaleza). tipo
de control) (Fig. 4A).
S176L

Repetimos estos experimentos usando una concentración

más alta de tipo salvaje, S176L y D417N
TUBB8 ARN (1000 ng por microlitro). La concentración más alta
dio como resultado un ensamblaje del huso grave o
D417N
completamente dañado con ambos ARN mutados (Fig. 4B): el
fenotipo de los ovocitos humanos en detención de la maduración.
También probamos hasta qué punto el contexto del isotipo de
C tubulina contribuye a estos efectos mediante la microinyección de
β-tubulina Bandera Hoechst Unir ovocitos de ratón con ARN que codifican TUBB5 de tipo salvaje o
mutante (S176L, R262Q o M363T). En amplio acuerdo con
nuestro TUBB5 datos de transfección en células cultivadas (Fig.
Tipo salvaje
S8 en el apéndice suplementario), ovocitos microinyectados con
tipo salvaje o mutado TUBB5 Los ARN tenían husos con
características morfológicas normales (Fig. S13 en el Apéndice
complementario). Este resultado implicó que los fenotipos de
ensamblaje del huso deteriorado que observamos son conferidos
S176L
por las mutaciones en el contexto del isotipo TUBB8. Para validar
aún más los efectos de TUBB8 mutaciones, microinyectamos TUBB8
S176L y D417N mutaron ARN en ovocitos de vesículas
germinales humanas; observamos huso grave o completamente
dañado
D417N

ruptura de vesículas finales, con un ensamblaje claramente visible (Fig. 4C), un hallazgo que es un huso en forma de barril
consistente (Fig. S12 en el Suplemento con los fenotipos de los ovocitos de ratón Apéndice). Por el contrario, la
microinyección se trata de la misma manera.

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 Mutaciones en TUBB8 y detención meiótica de ovocitos humanos

Discusión isotipo de β-tubulina preponderante único. Este hallazgo

Aunque el proceso de maduración de los ovocitos ha
ha sido ampliamente investigado en ratones, 27 el ge era
La causa netica de la maduración de los ovocitos humanos detiene
previamente desconocido. Hemos identificado el isotipo de
varias mutaciones en TUBB8, que codifica una función. Estas
β-tubulina de maduración de ovocitos hasta ahora
mutaciones interfieren con humanos ternalmente de una manera
indeterminada y ambos son paarise de novo heredados (Fig. 1
autosómica dominante o varios casos previstos para conferir
y Tabla 1). Están en la estructura del heterodímero de tubulina
cambios en el Apéndice Suplementario). Las mutaciones de
(se encontró que la Fig. S6 afecta el Apéndice complementario
plegamiento y ensamblaje in vitro (Fig. S7 en los fenotipos de
del heterodímero de tubulina α / β), causa un espectro de
microtúbulos llamativos en la dinámica de los túbulos de expresión in
células cultivadas en cultivo (Fig. 3) y altera el Apéndice
vivo (Fig. S11 en las Suplementaciones causaron defectos de
micromentario). Además, el TUBB8 expresión en ovocitos de
maduración de los ovocitos en imitan con precisión el fenotipo de
ratón y humanos que concluimos de estas observaciones que
infertilidad (Fig. 4). TUBB8 Causar detención de la maduración de los
muta y que TUBB8 tiene un papel clave en el huso meiótico
ovocitos.
refuerza la hipótesis de que diferentes tu-
Los isotipos de bulina pueden conferir propiedades únicas en La
subconjuntos funcionalmente distintos de microtúbulos. 28
capacidad de TUBB8 mutante para causar micro y en ovocitos
La alteración de los túbulos en la expresión en células cultivadas El efecto
sugiere un modelo en el que una proporción crítica de
dominante y acumulativo ocurre cuando se incorpora a los polímeros, lo
heterodímeros mutantes son inestables, en comparación con los
que conduce a una mayor cantidad de células de tipo salvaje y, con
microtúbulos en la hilación de microtúbulos.
frecuencia, a una completa aniquilación.
El hecho de que TUBB8 está presente únicamente en
compañeros sugiere que el gen ha tenido mutaciones únicas en TUBB8
prirole en la evolución de estas especies. Machos con carpa con
son fértiles, que son espermatozoides consismatizados y resaltan las
ausencia de TUBB8 expresión en distinguir la meiosis y la
diferencias que los primates machos y hembras. Nosotros
formación de huso en mutaciones en una alta proporción de
encontramos TUBB8
infértiles La ausencia de una mutación observada en TUBB8
mujeres (7 de 24) con detención de la maduración de los ovocitos. en
algunas de las mujeres afectadas implica que descontribuir a la detención
Los efectos en otros genes aún no descubiertos también pueden

de la maduración de los ovocitos humanos.

ensamblaje y maduración en ovocitos humanos. Observamos que los
datos presentados aquí proporcionan la base para desarrollar
herramientas de diagnóstico que utilizan la reacción en cadena de la
polimerasa para la identificación
ción de mujeres con mutaciones en TUBB8.
Los formularios de divulgación proporcionados por los autores están disponibles con
TUBB8 se expresa de forma única en ovocitos humanos y embriones tempranos,
texto completo de este artículo en NEJM.org.
Con el apoyo de subvenciones del Programa Nacional de Investigación Básica de
China (2015CB943300, al Dr. L. Wang), el Programa de Investigación Científica Clave
de Shanghai (14DJ1400101 al Dr. L. Wang), la Fundación Nacional de Ciencias
Naturales de China (81270747 y 81571501, al Dr. L. Wang), el Proyecto 111 (B13016,
al Dr.
L. Wang) y los Institutos Nacionales de Salud (5R01GM097376, al Dr. Cowan;
R01GM094313, al Dr. Gupta; y R01GM051487, al Dr. Nogales).
donde representa la mayor parte de el

Agradecemos al Dr. Qingyuan Sun, Instituto de Zoología, Academia China de

la β-tubulina que está presente (Fig. S4 en el Apéndice
complementario). De ello se deduce que los husos de ovocitos
humanos consisten en microtúbulos
polimerizado a partir de heterodímeros que contienen un microscopía.
Ciencias, por la instrucción en la manipulación de ovocitos y técnicas
relacionadas, y Ke Qiao, Laboratorio Clave de Virología Molecular Médica,
Ministerio de Educación y Salud Pública, Universidad de Fudan, por técnicas
asistencia en confocal

Apéndice
Las afiliaciones de los autores son las siguientes: el Laboratorio Estatal Clave de Ingeniería Genética, los Institutos de Ciencias Biomédicas, el Laboratorio Clave de Antropología
Contemporánea del MOE y el Centro de Innovación Colaborativa de Genética y Desarrollo, Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de Fudan (RF, QS, YX , RQ, XW, HW, QL, QX, LJ,
LH, LW), Instituto de Genética e FIV de Shanghai Ji Ai, Hospital de Ginecología y Obstetricia, Universidad de Fudan (XS, MY, JC), Departamento de Otorrinolaringología, Hospital de
Otorrinolaringología y Otorrinolaringología, Universidad de Fudan (LG), Departamento de Medicina Integrativa y Neurobiología, Laboratorio Estatal Clave de Neurobiología Médica, y
Facultad de Medicina de Shanghai, Universidad de Fudan (YF), Centro de Medicina Reproductiva, Noveno Hospital de Shanghai, Universidad Jiao Tong de Shanghai (YK, ZY,

SZ, BL), Instituto de Investigación de Planificación de la Familia de Shanghai (ZS, ML, HS) y Centro Bio-X, Laboratorio clave para la genética de los trastornos del desarrollo y
neuropsiquiátricos, Ministerio de Educación, Universidad Jiao Tong de Shanghai (LH), Shanghai, Centro de Medicina Reproductiva, Centro de Servicio de Cuidado Materno
Infantil de Shaanxi, Shaanxi (JS), y Laboratorio Clave de Genes del Desarrollo y Enfermedades Humanas, Ministerio de Educación, Instituto de Ciencias de la Vida, Universidad
del Sureste, Nanjing (RC) - todos en China; el Departamento de Bioquímica y Farmacología Molecular, Centro Médico Langone de la Universidad de Nueva York, Nueva York
(GT, NJC); el Departamento de Genética Molecular y Biología Celular de la Universidad de Chicago, Chicago (AL, Y. Fukuda, MLG); el Departamento de Fisiología -
Endocrinología, Instituto de Neurociencia y Fisiología, Universidad de Gotemburgo, Gotemburgo, Suecia (RS); el Departamento de

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Genética, Desarrollo y Biología Celular, Universidad Estatal de Iowa, Ames (MLG); y la División de Ciencias de la Vida, el Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley (RZ,
EN), el Departamento de Biología Celular y Molecular (EN) y el Instituto Médico Howard Hughes (EN), Universidad de California Berkeley, Berkeley.

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Médicas (ICMJE) considerarán la mayoría de los informes de
ensayos para su publicación solo si los ensayos se han registrado.
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