Tema 9.

Extracción y purificación
de enzimas
- Concepto de purificación enzimática

- Ruptura de células y tejidos

- Naturaleza del medio de extracción y protección

de la actividad

- Técnicas de concentración y purificación de

enzimas
- Criterios de pureza y homogeneidad 1
Extracción y purificación de enzimas
- Es uno de los pasos más complejos y tediosos en el
campo de la enzimología

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Extracción y purificación de enzimas
La purificación es un paso crítico a la hora de:

- Determinar la estructura tridimensional de

la enzima.

- Determinar el mecanismo de catálisis

enzimático

- Obtener (en muchas ocasiones) un producto

comercial (especialmente en diagnóstico y
terapéutica) 3
Extracción y purificación de enzimas
- ¿Por qué es tan complejo purificar enzimas?
- Debido a la complejidad de los organismos y al
elevado número de proteínas y otras sustancias
que un organismo o tejido puede contener.
- Las enzimas pueden formar agregados
moleculares con otras proteínas, Ácidos nucleicos,
Polisacáridos o lípidos
- El desarrollo de la química preparativa de
proteínas ha sido fundamental para los sistemas de
purificación de enzimas que existen ahora. 4
Extracción y purificación de enzimas
- ¿Qué nos debemos plantear a la hora de extraer y
purificar una enzima?
Elección del Método de Disponer de un
material de partida ruptura celular ensayo enzimático
Órgano/tejido/fracc adecuado apropiado
ión subcelular

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Extracción y purificación de enzimas
- ¿Qué nos debemos plantear a la hora de extraer y
purificar una enzima?
Técnicas de
Técnicas cromatográficas solubilización/insolubilización
Filtración/ Intercambio Precipitación por salado
Iónico/ Afinidad por el (sulfato amónico)/cambio de
ligando disolvente

Eliminación de
contaminantes Disponer de un
criterio de pureza
Filtración molecular/
Diálisis

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 Extracción y purificación de enzimas
- Concepto de purificación:

- Para emprender una purificación es necesario tener

un ensayo enzimático para medir actividad de la enzima
(concentración)
- Actividad específica debe ir aumentando tras cada
paso de purificación 7
 Ensayo de actividad enzimática (en
un proceso de purificación)
- Debe ser fácil de realizar (más importante que el
hecho de que sea muy fiable o preciso)
- Debe realizarse siempre en las mismas condiciones
(para poder ser comparativo)

- El sustrato debe ser económico, estable, debe usarse en

condiciones de saturación (para que la velocidad sea
independiente de la [S] y proporcional a la cantidad de
enzima)
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 Elección de la fuente de la enzima
- La actividad enzimática (cantidad de enzima) varía en
los diferentes organismos y en los diversos tejidos de un
organismo
- Es recomendable seleccionar aquella fuente donde sea
más abundante (pérdida de enzima en la purificación)

- La fuente debe ser lo más fresca posible

- La elección de una fuente adecuada simplifica la

extracción y la purificación de la enzima
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 Localización de la enzima
- Hay que tener claro cual es la localización exacta de la
enzima de interés

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 Localización de la enzima
- Clasificación de las enzimas según su localización
1. Enzimas en solución verdadera (citoplasma o medio
extracelular): permanecen en el sobrenadante después
de la eliminación de los componentes particulados
2. Enzimas asociadas a estructuras celulares
(mitocondrias, núcleos, peroxisomas)

- En solución dentro de la estructura celular

- Asociadas al material lipoproteico insoluble
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 Ruptura de células y tejidos
- Implica la obtención de un homogenado:
1. Homogenización mecánica

Homogenizador tipo
Potter-Elvehjem Homogenizador de aspas Homogenizador de paletas
Muy utilizados para tejidos vegetales y animales
blandos 12
 Ruptura de células y tejidos
2. Homogenización sónica: el choque de ondas sónicas
o ultrasónicas que provoca cambios de presión de miles
de atmosferas (sonicadores)

Utilizado para bacterias, levaduras, eritrocitos, bazo 13

 Ruptura de células y tejidos
3. Desintegración térmica: ciclos de
congelación/descongelación rápidos

-80ºC

-195.8ºC

Ultracongeladores Nitrógeno líquido 14

 Ruptura de células y tejidos
3. Desintegración térmica: ciclos de
congelación/descongelación rápidos

Bacterias, eritrocitos y cultivos celulares 15

Naturaleza del medio de extracción y
protección de la actividad
En el caso de enzimas intracelulares, antes de la rotura,
la célula debe resuspenderse en un medio adecuado
(medio de extracción) para asegurar la protección de la
actividad de la enzima.
Una vez que la enzima se ha extraído de su entorno
natural está expuesta a muchos agentes que pueden
dañarla. - Cambios bruscos del pH
- Temperaturas extremas
- Acción de las proteasas
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Naturaleza del medio de extracción y
protección de la actividad
El medio de extracción debe estar diseñado para la
protección:
- Soluciones tamponadas, de fuerza iónica
adecuada
- Bajas temperaturas (todas las soluciones deben
estar frías)
- Adición de agentes protectores (inhibidores de
proteasas, protectores de grupos funcionales)
- Debe contener todos aquellos ingredientes para
facilitar la liberación de la enzima (detergentes) 17
 Naturaleza del medio de extracción y
protección de la actividad
Para proteger la actividad:
- El proceso de ruptura y purificación debe ser lo más
corto posible
- El proceso de ruptura y purificación debe hacerse en
frío

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Concentración y purificación de enzimas
Separación de los distintos componentes intracelulares
(centrifugación diferencial)

Purificar y concentrar

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Concentración y purificación de enzimas
Una vez localizada la fracción donde está la enzima de
interés, si es soluble se procede a su purificación y si es
insoluble se solubiliza (detergentes)

Es requerimiento indispensable que la enzima esté

soluble antes de proceder a cualquier técnica de
purificación.

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Concentración y purificación de enzimas
Técnicas más frecuentes en la purificación de enzimas:

- De exclusión
molecular o filtración
en gel
- De intercambio
iónico

- De afinidad

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Concentración y purificación de enzimas
Técnicas más frecuentes en la purificación de enzimas:

https://www.separations.eu.tosohbioscience.com/solutions/hplc-
products/size-exclusion 22
Concentración y purificación de enzimas
Técnicas más frecuentes en la purificación de enzimas:

https://www.labtube.tv/video/MTAwNDA1 23
Concentración y purificación de enzimas
Técnicas más frecuentes en la purificación de enzimas:

Y
Anticuerpo
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Concentración y purificación de enzimas
Técnicas más frecuentes en la purificación de enzimas:

https://www.youtube.com/watch?v=OhsS8HfSwZA
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Concentración y purificación de enzimas
Técnicas más frecuentes en la purificación de enzimas:

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 Criterios de homogeneidad
En cada paso de purificación:
Es necesario realizar un ensayo enzimático para
determinar el éxito de purificación

Se utiliza la Actividad Enzimática Específica como

criterio de purificación. Debe aumentar 27
 Criterios de homogeneidad
Monitoreo del proceso de purificación:
• AE:
Unidades totales en la fracción i
mg de proteínas totales en la fracción i
• Rendimiento:
Unidades totales en la fracción i
Unidades totales en la fracción original
• Grado de purificación:
AE en la fracción i
AE en la fracción original

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 Criterios de homogeneidad
Monitoreo del proceso de purificación:

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 Criterios de homogeneidad
Cuando una purificación enzimática ha alcanzado la
etapa donde posteriores purificaciones no producen un
incremento de AEE se investiga la homogeneidad de la
muestra mediante otros métodos.
Para ello se realizan diversos métodos analíticos
como la electroforesis, la cromatografía líquida o la
focalización isoeléctrica

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