TRABAJO DE FIN DE MÁSTER

Utilidad de la Next Generation Sequencing en el

diagnóstico de los trastornos del desarrollo sexual

DANIELA MARTÍNEZ GONZÁLEZ

Trabajo dirigido por:

Dra. Estefanía Montoya

Unidad de genética

Máster en Medicina y Genética Reproductivas

Hospital HLA Vistahermosa

Alicante, curso 2019-2020

Índice
1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 1
1.1 Genética molecular del desarrollo sexual ........................................................................... 1
1.2 Los trastornos del desarrollo sexual.................................................................................... 2
1.3 Historia de los trastornos del desarrollo sexual y diagnóstico ............................................ 3
1.4 Next generation sequencing y trastornos del desarrollo sexual ......................................... 4
2. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 6
3. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................................. 6
4. RESULTADOS ..................................................................................................................... 8
4.1 Rendimiento diagnóstico de la NGS en los trastornos del desarrollo sexual...................... 8
4.2 Genes asociados a trastornos del desarrollo sexual identificados mediante NGS ............. 9
4.3 Clasificación de variantes génicas ..................................................................................... 11
5. DISCUSIÓN....................................................................................................................... 14
5.1 Sobre el rendimiento diagnóstico de Next generation sequencing .................................. 14
5.2 Sobre los genes asociados a trastornos del desarrollo sexual .......................................... 15
5.3 Sobre la clasificación de variantes .................................................................................... 16
5.4 Propuesta de panel dirigido .............................................................................................. 17
6. CONCLUSIONES Y PROYECCIÓN FUTURA .......................................................................... 19
6.1 Conclusiones...................................................................................................................... 19
6.2 Proyección futura .............................................................................................................. 19
7. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................. 20
8. LISTADO DE ABREVIATURAS ............................................................................................ 24
RESUMEN
Los trastornos del desarrollo sexual (TDS) son un conjunto de patologías que afectan al
correcto desarrollo sexual, causadas en una gran proporción de casos por alteraciones
genéticas. A pesar de su estudio exhaustivo, muchas veces no es posible encontrar la
causa genética y poder ofrecer un diagnóstico adecuado debido a la naturaleza
multifactorial de estos trastornos y a la gran heterogeneidad génica que presentan. No
obstante, la introducción de nuevas técnicas de secuenciación masiva, tales como los
paneles dirigidos o la secuenciación del exoma completo (WES), está suponiendo un
gran avance en el diagnóstico de este tipo de enfermedades, así como en la
identificación de nuevas variantes patogénicas o posiblemente patogénicas,
obteniendo buenos rendimientos diagnósticos.
Palabras clave: Desarrollo sexual, Trastornos del desarrollo sexual, Next generation
sequencing, Panel dirigido, Secuenciación del exoma completo, Secuenciación masiva,
Pruebas genéticas, Diagnóstico genético, Rendimiento diagnóstico.

ABSTRACT
Disorders of sex development (DSD) are a group of pathologies that affect correct
sexual development, in most of the cases caused by genetic alterations. Although they
are being studied thoroughly, in some cases it is not possible to offer a diagnosis due
to the multifactorial nature of these disorders and the high heterogeneity.
Nevertheless, with the advent of new massive sequencing technologies, such as
targeted panels or complete exome sequencing (WES), it is representing a great
advance in the diagnosis of this type of diseases. It is also being helpful in the
identification of new pathogenic or possibly pathogenic variants, obtaining in most of
the studies good diagnostic yields.
Keywords: Sexual development, Disorders of sexual development, Next generation
sequencing, Targeted panel, whole exome sequencing, Massive sequencing, Genetic
testing, Genetic diagnosis, Diagnostic yield.
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Genética molecular del desarrollo sexual
El desarrollo sexual engloba un conjunto de procesos fisiológicos que consisten
en el desarrollo del tracto urogenital y el aparato reproductor. El sexo genético se
determina en el momento de la concepción, mientras que la diferenciación de los
sexos gonadal y genital se produce durante periodos críticos del desarrollo fetal. En
concreto, el desarrollo de las gónadas a ovarios o testes no se da hasta 6 semanas tras
la fecundación, permaneciendo hasta entonces bipotenciales. Por lo tanto en el
desarrollo de la gónada hay dos fases clave: la primera, la fase inicial que comprende la
formación de la gónada bipotencial y una segunda fase que conlleva la diferenciación a
ovario o testículo. (1,2)
El desarrollo sexual normal depende de mecanismos sinérgicos que actúan como
factores activantes o represores que interactúan en un patrón espacio-temporal muy
concreto (3), algunos de los cuales se ven resumidos en la Figura 1. Se han descubierto
muchos genes necesarios para la formación de la cresta gonadal bipotencial en
humanos, como NR5A1, WT1, EMX2 o LHX9 (4). Una vez se ha desarrollado uno de
estos órganos, las hormonas liberadas por los mismos llevan a cabo el desarrollo de los
caracteres sexuales secundarios. La expresión del gen SRY (presente en el cromosoma
Y) activa una cascada de eventos genéticos que llevan a la regulación del gen SOX9 en
células de Sertoli (ubicadas en los túbulos seminíferos del testículo, cuya función es
secretora, de sostén y reguladora del desarrollo de las células de Leydig) (5),
produciendo la organogénesis testicular. La expresión de SOX9 también se encarga de
la represión de la expresión de genes involucrados en el desarrollo del ovario, como
WNT4, RSPO1, NR0B1 o FOXL2 (6). Las células de Sertoli secretan hormona anti-
Mülleriana (AMH), que provoca la regresión de las estructuras de Müller en varones.
Por otro lado, las células de Leydig, localizadas entre los túbulos seminíferos del
testículo, secretan testosterona y INSL-3 (insulin-like peptide 3), que promueven la
diferenciación de las estructuras del conducto de Wolff, como el epidídimo, las
vesículas seminales o el conducto deferente. La conversión enzimática de testosterona
a dihdrotestosterona (DHT) produce la virilización de los genitales externos (7).
El desarrollo del ovario es un proceso que incluye vías antagonistas que suprimen el
desarrollo testicular. En ausencia del gen SRY los factores de transcripción ováricos
específicos como FOXL2, MMTV, WNT4, RSPO1 inician la diferenciación del ovario (8).
Estos genes evitan la formación de gónadas masculinas favoreciendo la formación de
las femeninas. En las gónadas XX, los bajos niveles de AMH conllevan al desarrollo del
conducto Mülleriano y estructuras como la parte superior de la vagina, el útero o el
oviducto. La ausencia de andrógenos permite el desarrollo de los genitales externos
femeninos (9).

1
Figura 1. Cronología de genes implicados en el desarrollo de las gónadas. Los genes que aparecen son conocidos por
jugar un papel importante en la diferenciación sexual de las gónadas en humanos. Los genes relacionados con el
desarrollo testicular se muestran en azul, y los implicados en el desarrollo del ovario en rosa. Estos genes
representan vías de regulación que conllevan el desarrollo de las células de Sertoli o de la granulosa a su desarrollo.
Las flechas naranjas son vías antagónicas (9).

1.2 Los trastornos del desarrollo sexual

Los trastornos del desarrollo sexual (TDS) son un grupo heterogéneo de
patologías que se asocian a variaciones en el sexo cromosómico, gonadal o anatómico
(10). Estas condiciones están causadas por alteraciones genéticas, hormonales o de
programación del desarrollo. Cualquier alteración, de origen medioambiental o
genético, que afecte a cualquiera de los niveles de hormonas, proteínas o factores de
transcripción relacionados con el desarrollo sexual, determina el desarrollo
inadecuado de gónadas (disgenesia gonadal), de genitales internos (ausentes o que no
deberían estar presentes) o externos (insuficientemente o excesivamente virilizados).
Con una incidencia de 1:4500 a 1:5000 nacidos vivos (11), los TDS se presentan en el
nacimiento (en forma de ambigüedad genital, discordancia entre el genotipo y el
fenotipo sexuales) o durante la adolescencia con un desarrollo puberal anormal,
amenorrea o virilización insuficiente o excesiva. En etapas más tardías, puede aparecer
como infertilidad o menopausia precoz. Su clasificación, siguiendo el consenso de
Chicago de 2006, está basada en el cariotipo, de modo que se distinguen tres grandes
grupos de TDS: 1) alteraciones cromosómicas 2) Cariotipo 46, XY 3) Cariotipo 46, XX
(12).
En el grupo 1, Alteraciones cromosómicas, se incluyen aquellas que conlleven
anomalías en los cromosomas sexuales, como el síndrome de Klinefelter (47, XXY),
síndrome de Turner (45, X0), mosaicos (45, X0/46, XX) (45, X0/46, XY), quimerismo
(46, XX/46, XY) y variantes de estas condiciones.
Forman parte del grupo 2, aquellas alteraciones en un individuo con cariotipo
masculino 46, XY. Dentro de este grupo, se encuentran anomalías en el desarrollo
gonadal (como la disgenesia gonadal 46, XY completa o parcial), anomalías en el

2
desarrollo genital por alteración en la síntesis o en la acción hormonal (como
andrógenos o la AMH) u otras alteraciones, como síndromes malformativos,
hipospadias o criptorquidismo.
El grupo 3 comprende aquellas anomalías en pacientes con cariotipo femenino 46, XX.
Se incluyen también anomalías en el desarrollo gonadal (por ejemplo, disgenesia
gonadal 46, XX), anomalías en el desarrollo genital por exceso de andrógenos (ya sea
por producción fetal, producción fetoplacentaria o producción materna) u otros
factores, como el síndrome de Rokitansky que provoca la agenesia de estructuras
müllerianas.

1.3 Historia de los TDS y diagnóstico

Aunque existen otras causas, a partir de ahora esta revisión se centrará en
aquellas de origen genético que puedan provocar un trastorno del desarrollo sexual.
Existen muchas alteraciones genéticas que dan lugar a TDS, ya sean anomalías
cromosómicas (como aneuploidías y translocaciones) o alteraciones monogénicas (que
afectan a un único gen). Hoy en día, se conocen alrededor de cientos de mutaciones y
variantes distintas relacionadas con trastornos del desarrollo sexual en humanos,
mientras que otras muchas han sido descubiertas en modelos animales. Estas
mutaciones pueden deberse a variaciones en el número de copias (en inglés, Copy
number variation, CNV), pequeñas deleciones e inserciones pero sobre todo, las
mutaciones más frecuentes encontradas en pacientes con TDS son las variantes de un
nucleótido (en inglés, single nucleotide variants, SNV) tales como mutaciones sin
sentido, cambios en sitios de splicing y codones de parada prematuros (13).
A pesar de las causas genéticas conocidas actualmente, los genes que se han descrito
hasta la fecha solo pueden explicar la mitad de los casos conocidos de pacientes con
TDS (14). En el tratamiento y manejo clínico de casos de pacientes con este tipo de
trastornos, un diagnóstico correcto es crítico para poder predecir el fenotipo, los
riesgos que puede conllevar, una posible terapia hormonal sustitutiva y asignación de
género en el lactante (15). Alcanzar un diagnóstico acertado es también imprescindible
a la hora de realizar un asesoramiento genético tanto a los progenitores en caso de
que deseen tener más descendencia como al propio paciente, siempre y cuando la
causa del trastorno haya sido genética. Por otro lado, si bien conseguir un diagnóstico
correcto tiene un gran impacto a la hora de tomar decisiones médicas, determinar la
etiología de la ambigüedad genital en pacientes con TDS en base a evaluaciones
clínicas y bioquímicas continúa siendo un desafío.

La metodología diagnóstica es clínica, hormonal y genética. El diagnóstico comienza

con una anamnesis y exploración física, consistente en estudiar los antecedentes
personales (historia de consanguinidad, posible exposición prenatal a andrógenos…)
antecedentes familiares y la inspección y palpación de los genitales. Estos estudios se
realizan en paralelo a otras exploraciones complementarias clave, como son el
cariotipo, una ecografía abdominal para determinar la presencia de gónadas, útero y
vagina y el estudio hormonal (17-hidroxiprogesterona, DHEA, Testosterona, FSH, LH,

3
cortisol y hormona antimülleriana, entre otras). Tradicionalmente, averiguar las causas
genéticas de los trastornos del desarrollo sexual era un trabajo laborioso y lento. Se
empezó usando el cariotipo para detectar cambios en el número de cromosomas o su
morfología con un microscopio y a día de hoy, el análisis del cariotipo a partir de
sangre periférica continua siendo una técnica útil para estudiar los cromosomas X e Y.
Además, el uso de marcadores de cromosomas mediante la técnica FISH (fluorescent in
situ hybridization) permite ver ciertos reordenamientos cromosómicos de los
cromosomas (16).
No obstante, las técnicas anteriores solo proporcionan información acerca de ciertos
cambios en la secuencia de los marcadores o cambios en el número o la morfología de
los cromosomas sexuales.
Otra técnica empleada para diagnóstico de los TDS es la secuenciación tipo Sanger
(17), que se basa en el uso de dideoxinucleótidos (ddNTP) marcados radioactiva o
fluorescentemente para su posterior detección en secuenciadores automáticos (18).
Los test genéticos actuales que usan la secuenciación de Sanger de los genes
candidatos son menos eficientes y más laboriosos con respecto a otras técnicas. Con
esta técnica solo se diagnostican alrededor del 20% de los casos de TDS, dejando la
mayoría de casos sin poder diagnosticar a nivel genético (19).
La secuenciación con el método de Sanger presenta limitaciones en casos de
enfermedades con heterogeneidad genética o etiología genética desconocida, pues
conlleva el estudio de un número elevado de genes. Pero a pesar de sus limitaciones,
sigue siendo una técnica a tener en cuenta cuando las características clínicas y las
pruebas bioquímicas sugieren la alteración de una vía específica o están implicados
pocos genes. Además, también es usado como método para validar los resultados de
otras técnicas.
Existen más técnicas para el diagnóstico de TDS, como el análisis cromosómico por
microarray (array CGH o los arrays SNP) que permite detectar tanto duplicaciones
como deleciones a pequeña y gran escala en todo el genoma. El array CGH incluso
puede ser útil para la identificación de genes candidatos asociados a TDS. No obstante,
tiene el inconveniente de que no detecta translocaciones cromosómicas equilibradas y
mosaicismos leves, así como cambios muy pequeños.

1.4 Next generation sequencing y TDS

Tras la publicación del genoma humano en 2001 (20), se hizo evidente el gran
potencial de la secuenciación masiva y los arrays para diagnosticar casos de TDS. Estas
nuevas tecnologías junto con el abaratamiento de las técnicas han facilitado el análisis
y diagnóstico de un gran número de pacientes.
Hasta el momento, la estrategia para el estudio de una patología genética era el
estudio secuencial de los genes candidatos conocidos hasta la fecha mediante la
secuenciación tipo Sanger, anteriormente explicada. Se hacía un barrido, uno por uno,
de los genes hasta que se detectaba, o no, la mutación responsable del fenotipo,
4
siendo este abordaje lento y costoso y, especialmente en patologías con mucha
heterogeneidad genética, muchas veces infructuoso.
Pero la Next generation Sequencing (NGS), puede ofrecer un screening de alto
rendimiento preciso de varios genes y distintos tipos de variantes genómicas en un
solo experimento (21), de forma eficiente. Por lo tanto, se comenzó a usar esta técnica
para diagnosticar no solo TDS, sino numerosas enfermedades o trastornos que afectan
a varios genes (22).
Los ensayos con técnicas de NGS permiten secuenciar múltiples genes causantes de
enfermedades conocidas en paralelo a la evaluación clínica y las pruebas bioquímicas
que se llevan a cabo al paciente, evitando la necesidad de pruebas bioquímicas
adicionales y pruebas radiológicas (23). Conseguir un diagnóstico evita futuras
investigaciones innecesarias, permite un asesoramiento del trastorno específico,
brindando información sobre, por ejemplo, la futura fertilidad del paciente o el riesgo
de padecer cáncer. Además facilita la implementación de pautas médicas
personalizadas en base a las guías consenso actuales específicas de la enfermedad
(10).
Con la secuenciación masiva, se pueden plantear diferentes estrategias a la hora del
diagnóstico del paciente. Es posible realizar estudios dirigidos a un conjunto de genes
mediante paneles dirigidos de NGS (Targeted Next Generation Sequencing, TNGS),
estudios de exoma completo (Whole Exome Sequencing, WES) o incluso la
secuenciación del genoma completo, WGS (Whole Genome Sequencing).
Puesto que WGS estudia el contenido genómico entero de un paciente y WES estudia
solo las secuencias codificantes del genoma, la información recogida con estas técnicas
es enorme, produciendo gran cantidad de datos que muchas veces, es difícil de
interpretar.
Los paneles dirigidos de NGS (Targeted NGS) se realizan sobre un área concreta del
genoma, en genes que se sabe que son causantes de una determinada patología,
estudiando intrones, exones y regiones intergénicas, siendo una excelente opción
siempre y cuando se tenga conocimiento de los genes que están asociados a esa
enfermedad (24).

5
2. OBJETIVOS
El nivel de discordancia entre sexo cromosómico, gonadal y anatómico en
pacientes con TDS es determinante en el manejo y tipo de tratamiento para la
enfermedad. Conseguir llegar a diagnosticar un trastorno del desarrollo sexual es
crucial para poder llevar a cabo una asignación de género acertada, realizar un
asesoramiento genético adecuado o evaluar posibles tratamientos. Este diagnóstico,
con los métodos tradicionales muchas veces no es posible conseguirlo y estos
trastornos quedan sin poder diagnosticar en un gran número de pacientes. No
obstante, la NGS puede ser de gran ayuda para conseguir alcanzar un diagnóstico
fiable para estos casos.

El objetivo principal de este Trabajo de Fin de Máster es valorar la utilidad diagnóstica

de la NGS en TDS tras realizar una revisión de la bibliografía sobre los diferentes
estudios realizados hasta la fecha. Este objetivo ha sido concretado en los siguientes
objetivos específicos, que se corresponden con las etapas seguidas en la realización del
trabajo:
1. Evaluar la utilidad diagnóstica de la NGS en TDS a partir del rendimiento
diagnóstico obtenido en diferentes estudios.
2. Exponer los principales genes asociados a los trastornos del desarrollo sexual.
3. Mostrar la clasificación de las variantes que han aparecido en las distintas
publicaciones.
4. Diseñar y proponer un posible panel dirigido en base a los resultados y los
estudios realizados hasta la fecha.

3. MATERIALES Y MÉTODOS
Para la realización de este trabajo, se ha llevado a cabo una revisión sistemática de
diversas publicaciones y estudios científicos sobre el tema a tratar, alojados en la base
de datos del NCBI. La estrategia de búsqueda realizada se hizo en base a las palabras
clave: Next generation sequencing, Disorders of sexual development, Genetics of
sexual development, Whole genome sequencing, Whole exome sequencing, Array
CGH, Targeted panels, Management of DSD, Sex assignment.
Se seleccionaron artículos en inglés y en español de Medline y Pubmed. Para
completar la información obtenida en estas bases de datos, se recurrió a las páginas
web de la Sociedad Española de Endocrinología Pediátrica (SEEP)(25), European
Reference Networks for Rare Diseases (ERN) y la Rare Endocrine Diseases Reference
Network (EndoERN) (26), American College of Medical Genetics and genomics (ACMG).
El criterio de exclusión para la mayoría de publicaciones buscadas fue que tenían que
ser relativamente recientes, con un filtro de 5 años de antigüedad como máximo.

Con el fin de comprender el mecanismo de ciertos genes, su funcionamiento,

localización citogenética y su implicación en el desarrollo sexual, se usó la base de
datos OMIM, donde además también se proporciona información sobre la relación
genotipo/fenotipo y el tipo de herencia (autosómica dominante, autosómica recesiva,
ligada a X, etc.).

6
Se usó Orphanet y GeneReviews para ampliar la información clínica acerca de las
distintas enfermedades y síndromes causados por alguna mutación en los genes
implicados en el desarrollo sexual, sus características clínicas, el diagnóstico y manejo
de la enfermedad, además del consejo genético recomendado para una determinada
mutación o enfermedad.

La búsqueda inicial comprendió 40 artículos introduciendo en el buscador de Pubmed

“Next generation sequencing and DSD”, que se redujeron a 33 tras excluir aquellos
artículos con una antigüedad mayor a 5 años (es decir, se acotaron a las publicaciones
hechas a partir del año 2015). También fueron excluidos los artículos referentes a otras
especies que no fuera la humana, ya que para esta revisión interesaba saber la utilidad
diagnóstica de las técnicas de Next generation sequencing en grupos de pacientes con
TDS humanos. Fueron seleccionados 9 estudios que evaluaban el rendimiento
diagnóstico de técnicas NGS en distintas cohortes de pacientes. Las referencias
bibliográficas de este Trabajo de Fin de Máster se decidieron tras analizar el resumen,
introducción y resultados de estos 9 artículos, incluyendo tanto ensayos clínicos como
revisiones, excluyendo informes, editoriales y cartas al editor. También se han incluido
en la bibliografía artículos anteriores al año 2015 que se consideraron relevantes
respecto al tema a tratar, siendo el número final de artículos incluidos en esta revisión
de 57.

7
4. RESULTADOS
4.1 Rendimiento diagnóstico de la NGS en los TDS
A partir de la búsqueda bibliográfica realizada en este trabajo, se han
encontrado 57 artículos, en 9 de los cuales se han empleado técnicas NGS como
herramienta diagnóstica en pacientes con TDS.
Los distintos paneles dirigidos utilizados en los artículos seleccionados estudian
numerosos genes, incluyendo aquellos que se han demostrado asociados a TDS por su
papel crítico en el desarrollo genital y gonadal, o participante en vías esteroidogenicas,
tanto genes de pacientes 46, XY como 46, XX. Cabe destacar que ciertos genes (como
el CYP21A2, involucrado en el 95% de los casos de hiperplasia suprarrenal congénita,
CAH, que puede dar lugar a ambigüedad genital) no han sido incluidos en el panel, ya
que los pacientes pueden ser diagnosticados mediante test alternativos al estudio
genético.
Entre los estudios que han sido revisados, algunos se encuentran esquematizados en la
tabla 1, la cual incluye 7 artículos seleccionados en base a su relevancia respecto al
tema a tratar y su reciente fecha de publicación. En ella, se especifica el número de
genes incluidos en el panel (que varía desde 30 hasta 219 genes), el número de
pacientes que formaron parte del estudio (que oscila entre 21 y 326), así como su sexo
cariotípico y los distintos rendimientos diagnósticos (el rendimiento diagnóstico
general oscila entre 29,5% y 44%). Llama la atención el reducido número de pacientes
46, XX. Esto es, entre otros aspectos, debido a que otras causas de TDS en pacientes
46, XX tales como la translocación del gen SRY al cromosoma X, duplicaciones en el gen
SOX9 o CAH debido al déficit del gen CYP21A2 no se pueden detectar mediante esta
técnica (27). De todos los estudios resumidos en la tabla 1, destaca el de Fan 2017 por
obtener el rendimiento diagnóstico general más elevado (44%) así como el
rendimiento diagnóstico en pacientes 46, XX más alto (40%). En cuanto al rendimiento
diagnóstico de pacientes 46, XY, Dong 2016 posee el resultado más elevado (46%). En
todos los trabajos el rendimiento en pacientes XY es superior que en XX, llegando estos
últimos incluso a obtener rendimientos del 0%.

Tabla 1. Resumen de estudios que han usado NGS para diagnóstico de TDS y que han sido seleccionados para la
presente revisión bibliográfica.

Nº de
Nº de Rend. Rend. Rend.
pacientes y
Artículo genes en el diagnóstico diagnóstico diagnóstico
sexo
panel general 46, XY 46, XX
cariotipico
Baxter 2015 64 40 XY - 35% (14/40) -
(28)
Dong 2016 (29) 219 13 XY, 8 XX 38% (8/21) 46% (6/13) 25% (2/8)
Eggers 2016 64 278 XY, 48 XX 38,5% 42,5% 16,5%
(30) (126/326) (118/278) (8/48)
Kim 2017 (31) 67 37 XY, 7 XX 29,5% (13/44) 35% (13/37) 0% (0/7)
Fan 2017 (32) 80 27 XY, 5 XX 44% (14/32) 44% (12/27) 40% (2/5)
Hughes 2019 30 73 XY, 7 XX 31% (25/80) 34% (25/73) 0% (0/7)
(27)
Buonocuore 180 52 XY - 30% (16/52) -
2019 (33)

8
Además de los expuestos en la tabla 1, hay muchos más estudios que analizan la
efectividad de las distintas técnicas de NGS, si bien en grupos menores de personas y/o
sin tener en cuenta el grupo 46, XX. (34,35)

4.2 Genes asociados a TDS con mayor frecuencia.

El número de genes que se han encontrado implicados en el desarrollo sexual
es muy amplio (Figura 2). A pesar de esto, los resultados de las publicaciones incluidas
en esta revisión muestran ciertos genes que, con más frecuencia que otros, presentan
variantes patogénicas en pacientes con trastornos del desarrollo sexual.
Entre los genes más habituales se encuentran AMH, AMHR2, AR, DHCR7, DMRT1,
HSD17B3, KAL1, MAMLD1, NR5A1, NR0B1, SRD5A2, SRY, SOX9, WT1.

Figura 2. Localización citogenética de los distintos genes implicados en el desarrollo sexual. En la izquierda y en azul,
se encuentran los genes implicados en el desarrollo de individuos XY. A la derecha y en rojo, genes de individuos XX.

9
El gen AMH se encuentra en el cromosoma 19 y codifica para la hormona anti-
mülleriana, mientras que el AMHR2 se localiza en el brazo largo del cromosoma 12 y
codifica el receptor de la hormona anti-mülleriana. Ambos están implicados en la
diferenciación sexual masculina, provocando la regresión de los conductos de Müller,
que terminan formando el útero y las trompas de Falopio. Mutaciones en alguno de
estos genes conllevan el fenotipo conocido como Síndrome de conducto mülleriano,
caracterizado por la persistencia de los derivados müllerianos en pacientes
normalmente virilizados (36).
El gen AR, situado en el cromosoma X, codifica el receptor de andrógenos. Variantes
en este gen pueden provocar insensibilidad a los andrógenos, caracterizada por la
presencia de genitales externos femeninos, ambiguos o con defectos de virilización en
un individuo 46 XY, con capacidad de respuesta ausente o parcial a los andrógenos
(37).
DHCR7 es un gen en el cromosoma 11 implicado en la biosíntesis del colesterol.
Mutaciones en este gen afectan a la síntesis o acción de ciertas hormonas que
necesiten de la acción del enzima que codifica, la 7-dehidrocolesterol reductasa. (38)
En el cromosoma 9 se encuentra el gen DMRT1, que codifica un regulador
transcripcional clave en la determinación y diferenciación sexual masculina. Cambios
en su secuencia pueden producir disgenesia gonadal completa o parcial (39).
El gen HSD17B3 codifica para la enzima 17-beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa (17-
beta-HSD), que transforma la androstendiona a testosterona en los testículos fetales.
Sin la acción de esta enzima, el fenotipo es de pseudohermafroditismo, hipovirilización
y ginecomastia. (40)
KAL1 es un gen localizado en el brazo pequeño del cromosoma X y codifica para
anosmina-1, una proteína clave en la migración de GNRH al hipotálamo. Mutaciones
en KAL1 conllevan un fenotipo de hipogonadismo hipogonadotropico con anosmia. En
la misma localización citogenética se encuentra MAMLD1, que se expresa en células de
Sertoli y Leydig fetales (41) durante un periodo clave del desarrollo sexual. Si no se
expresa correctamente, puede producir un fenotipo con micropene, escroto bífido e
hipospadias.
El gen NR5A1 también se encuentra en el cromosoma 9, NR5A1 es un factor de
transcripción que se une al ADN en una región determinada y regula varios genes
implicados en reproducción, esteroidogenesis y diferenciación sexual (42). Si NR5A1
está mutado, puede producir bajo nivel de androgenización, disgenesia gonadal
completa, fallo ovárico precoz, fallo en la espermatogénesis, insuficiencia
adrenocortical…
NR0B1, también llamado DAX1, es un gen del cromosoma X implicado en la formación
de la glándula adrenal, siendo un receptor nuclear que inhibe la actividad
transcripcional de otros receptores nucleares. Variaciones en este gen pueden
provocar hipoplasia adrenal congénita e inversión sexual. (43)
El enzima esteroido-5-alfa-reductasa, codificada por el gen SRD5A2 localizado en el
brazo pequeño del cromosoma 2, cataliza la conversión de la testosterona al
andrógeno más potente, dihidrotestosterona (DHT). Sin esta enzima, se obtiene un
fenotipo caracterizado por ambigüedad genital e hipospadias pseudovaginales y
perineoescrotales.
Uno de los genes más importantes para el desarrollo sexual normal es el SRY,
localizado en el cromosoma Y. Si un individuo 46, XX posee este gen, pueden ser

10
fenotípicamente hombres normales, hombres con ambigüedad genital o
hermafroditas. Mutaciones en este gen pueden provocar disgenesia gonadal entre
otros muchos fenotipos distintos de trastornos del desarrollo sexual. La expresión del
gen SRY inicia una cascada controlada por el factor de transcripción SOX9,
promoviendo la formación de testículos a partir de las gónadas en estado bipotencial.
El gen SOX9, localizado en el cromosoma 17, puede provocar displasia campomélica o
enanismo campomélico, una enfermedad rara asociada con anormalidades
esqueléticas, dificultad respiratoria y sexo invertido en pacientes masculinos (44).

El gen WT1 codifica una proteína de unión a ADN que actúa como un activador o
represor transcripcional, involucrado en la formación del aparato genitourinario y
tejidos del mesotelio (45). Una mutación en este gen puede provocar varias
condiciones sindrómicas, como el síndrome de Denys-Drash, el síndrome de Frasier o
el de Meacham, todos ellos incluyen algún tipo de trastorno del desarrollo sexual,
entre otras condiciones no relacionadas con el desarrollo sexual.

4.3 Nuevas variantes identificadas mediante NGS y su clasificación

Muchas de las mutaciones detectadas en estos genes fueron descubiertas en su
mayoría mediante técnicas de NGS. Todos los artículos mencionados en la tabla 1 han
encontrado en sus estudios mediante NGS numerosas variantes génicas. En el estudio
realizado por Baxter 2015 se encontraron variantes en los genes MAP3K1, WT1, STAR,
AMH que fueron clasificadas como posiblemente asociadas a la enfermedad, ya que se
hallaron estas variantes en pacientes con condiciones sindrómicas. Además, se
detectaron varias VOUS.
Lo mismo ocurre en Dong 2016, (donde se identificaron 6 mutaciones nuevas en CHD7,
SRY, NR0B1) Eggers 2016 (Figura 3a) y en el estudio de Fan 2017, en el cual se compara
el ratio diagnóstico de la NGS frente a la secuenciación gen a gen.
Kim 2017 describe en los resultados que mediante NGS hallaron 9 variantes nuevas, de
las cuales 4 fueron clasificadas como patogénicas o posiblemente patogénicas, en los
genes AR, CYP17A1, CHD7 y NR5A1.
También en la publicación Hughes 2019 se encontraron numerosas variantes génicas
clasificadas como VOUS en AMH, AMHR2, AR, CYP11A1, CYP11B1, HSD17B3, HSDB3B2,
LHCGR, MAMLD1, NR5A1, POR, RSPO1, SRD5A2 y WT1.
Por su parte, Buonocuore 2019 destaca por haber encontrado nuevas variantes
clasificadas como patogénicas en cinco genes clave en el desarrollo sexual (SRY,
DMRT1, NR5A1, DHH y DHX37).
Incluso en artículos más recientes, se siguen encontrando nuevas variantes. En el
estudio realizado por Xue 2019 (46), se describen mutaciones patogénicas no
observadas en publicaciones previas en los genes SRY y MAP3K1 utilizando la técnica
WES en pacientes 46, XY con disgenesia gonadal. En una publicación de finales de abril
del 2020 realizada por Cheng et al. (47) se explica cómo mediante NGS, concretamente
WES, se encuentran variantes patogénicas en los genes AR y MAP3K1, afectando a la
producción del receptor de andrógenos y produciendo por lo tanto un síndrome de
insensibilidad a andrógenos (AIS).

11
En cuanto a la clasificación de las nuevas variantes identificadas en los trabajos, se
clasificaron siguiendo las recomendaciones de la American College of Medical Genetics
and genomics (ACMG) (48). Esta clasificación consiste en dividir las variantes en clases,
dependiendo de su patogenicidad. Las de clase 1 y 2 son variantes no patogénicas o
con poca probabilidad de ser patogénicas. Las variantes de clase 3 son las variantes de
significado incierto, conocidas como VOUS. Las variantes de clase 4 y 5 son aquellas
posiblemente patogénicas y las patogénicas y, por lo tanto, contribuyen a padecer una
enfermedad.
Las variantes de clase 3 son mutaciones que no se han reportado previamente y que,
por lo tanto, no existe información clínica disponible sobre las mismas. La relevancia
clínica de estas variantes se comprueba en bases de datos tales como ClinVar, HMGD y
OMIM, y se buscan publicaciones previas en otras bases de datos como PubMed.

En todos los estudios que se van publicando sobre el uso de NGS para el diagnóstico de
trastornos del desarrollo sexual, se encuentran nuevas variantes génicas, no
reportadas en estudios previos, que dificultan el diagnóstico y el tratamiento de la
enfermedad, siendo una gran proporción de éstas, variantes de significado incierto
(VOUS). La Figura 3 representa un ejemplo de la cantidad de variantes nuevas que se
encontraron en el estudio Eggers (Fig. 3a) y Wang 2018 (Fig. 3b).

a) b)

Figura 3. En ambas gráficas, se representan algunos genes incluidos en los paneles de los estudios de Eggers (a)
2016 y Wang 2018 (b) en el eje Y, mientras que en el eje X se representa el número de variantes de TDS. a) Se
identificaron 28 nuevas variantes génicas en los 64 genes incluidos en el panel. En gris oscuro se representan las
variantes de alelo nulo previamente reportadas, en gris claro las no reportadas, mientras que en verde oscuro se
representan las variantes génicas de cambio de sentido ya descubiertas y en verde claro las no reportadas con
anterioridad. b) Se representan en verde las variantes identificadas en publicaciones anteriores, en azul variantes
no reportadas previamente.

12
En las dos publicaciones de la Figura 3, los autores diferencian entre variantes
previamente descritas en otros estudios y variantes nuevas, cuyo significado no se
conoce. Adicionalmente, en la publicación de Eggers (Figura 3a), se diferencia a las
variantes génicas según el tipo de mutación, ya sean de alelo nulo o de cambio de
sentido.
En genética, un alelo nulo es un tipo de alelo no funcional debido a una mutación
genética, la cual conduce a la ausencia de un determinado fenotipo (49), (como por
ejemplo, una deleción del gen).
Una mutación de cambio de sentido es un tipo de mutación en la cual se produce un
cambio en un nucleótido, provocando la aparición de un codón que codifica para un
aminoácido diferente. Esta mutación puede no tener ningún efecto, o puede dar lugar
a una proteína no funcional. (50)

13
5. DISCUSIÓN
5.1 Sobre el rendimiento diagnóstico de la NGS
Los TDS, con una incidencia de aproximadamente 1,7% de nacimientos (51),
son un reto en cuanto a diagnóstico debido a la expresividad variable, pleiotropía,
solapamiento clínico de varios TDS y heterogeneidad etiológica. Con la llegada de las
nuevas tecnologías genómicas, el rendimiento diagnóstico de los test genéticos para
TDS ha aumentado respecto a las técnicas tradicionales. Este aumento ha llevado al
descubrimiento de nuevas variantes génicas para estos trastornos.
En el caso de los estudios más recientes incluidos en esta revisión, el uso de la NGS
para diagnóstico molecular de pacientes con TDS ha demostrado ser efectivo. Estos
estudios presentan un buen rendimiento diagnóstico y utilidad clínica en casos de TDS
46 XY, usando paneles de 30-219 genes, siendo capaces de encontrar la causa genética
y así poder diagnosticar a una gran proporción de pacientes.
En referencia al número de genes incluido en los paneles, los estudios que se han
hecho recientemente han variado la cantidad de genes secuenciados, usando un rango
de 30 a 219 genes. Los genes fueron seleccionados en base a su implicación en el
desarrollo sexual. Aun así, el uso de un mayor número de genes en el panel no supone
un aumento abrupto del rendimiento diagnóstico, como bien se puede comprobar
entre el estudio de Dong 2016 y Eggers 2016 (tabla 1). El primero usa un panel de 219
genes, consiguiendo un ratio de 8/21, un 38% aproximadamente, mientras que Eggers
emplea un panel con 64 genes y sin embargo obtiene un rendimiento diagnóstico
general similar 126/326, 38%. No obstante, esto puede depender de muchos factores,
como la etnia de los pacientes o los genes escogidos.
A pesar de que la mayoría de estos estudios cuentan con un número relativamente
bajo de personas (algunos ni siquiera incluyen al grupo 46, XX), sugieren que las
técnicas de NGS tales como los paneles dirigidos o WES podrían ser consideradas como
una primera herramienta para diagnóstico de los TDS debido a su sencillez y eficiencia.
Este bajo número de pacientes puede ser explicado debido a que la mayoría de estos
estudios se hicieron junto con hospitales o conjuntos de hospitales de una zona
determinada, donde el número de pacientes con trastornos del desarrollo sexual es
relativamente limitado.
Ahora bien, en cuanto al rendimiento diagnóstico general, las técnicas NGS presentan
un buen rendimiento, permaneciendo sobre un 30-40% en los diferentes estudios que
se han citado. Este porcentaje, se mantiene, tanto en los estudios donde se usaron
grupos más numerosos como en los más reducidos. A pesar de que el rendimiento
diagnóstico general es constante entre las diferentes publicaciones, se requieren más
estudios al respecto, usando grupos mayores de pacientes e intentando incluir
personas de diferentes países ya que existen mutaciones que son más comunes en
algunas etnias debido a factores como la consanguinidad.
Por otro lado, las publicaciones muestran la dificultad de la técnica para confirmar un
diagnóstico molecular en pacientes de TDS 46, XX. Además de que en la mayoría de

14
estudios el número de muestras 46, XX es demasiado pequeño como para ser
representativo de la capacidad diagnóstica de la secuenciación, existen algunas causas
genéticas de TDS en 46, XX que no son detectables por los paneles dirigidos, tales
como la translocación del gen SRY al cromosoma X, duplicaciones del gen SOX9 o
hiperplasia suprarrenal congénita debido a déficit de CYP21A2, que puede
diagnosticarse por otros métodos no genéticos. Es necesario continuar los estudios de
rendimiento diagnóstico en este grupo de pacientes, aumentar la cantidad de genes a
estudiar específicos para este grupo en el panel dirigido conforme se vayan
identificando y clasificando y sobre todo, aumentar el número de personas 46, XX con
el fin de obtener datos suficientes para ser representativos acerca de la capacidad
diagnóstica de la técnica.

5.2 Sobre los genes asociados a TDS

Gracias a las técnicas NGS, se puede llevar a cabo una lectura eficiente del
genoma humano, incluso mejorar el genoma de referencia, debido a la
implementación de nuevas técnicas y al aumento de cobertura. Esta mejora, también
ha permitido la identificación de SNPs (single nucleotide polymorphism),
contribuyendo al descubrimiento de nuevas variantes génicas que pueden tener
relevancia clínica en casos de TDS. El hallazgo en los últimos años de nuevas variantes
ha permitido el conocimiento, cada vez mayor, de la genética y mecanismos
moleculares que actúan en el desarrollo sexual en la especie humana. Estos avances
han sido posibles en gran medida debido a la NGS, a las mejoras tecnológicas y al
abaratamiento de los procesos.
No obstante, este progreso supone a su vez, la aparición de nuevos desafíos que deben
ser superados. En primer lugar, aún no se tiene conocimiento absoluto de los
mecanismos y vías que participan en el desarrollo y mantenimiento sexual ya que a día
de hoy, se siguen descubriendo nuevas mutaciones patogénicas en genes implicados
en el desarrollo sexual y variantes que, aunque no se conozca su significado (VOUS),
pueden llegar a clasificarse tras realizarse estudios e investigaciones posteriores.
Por otra parte, son muchos los estudios que recientemente han hecho énfasis en el
hecho de que una variación determinada en un gen puede resultar en fenotipos
distintos de TDS. Estos hallazgos sugieren por lo tanto que las diferencias en el
desarrollo sexual, no pueden ser percibidas como entidades separadas, sino como un
espectro. Por ejemplo, en Eggers 2016 se encontraron dos variantes de MAP3K1 en
varios pacientes que presentaban un amplio rango de fenotipos (disgenesia gonadal
completa/parcial, hipospadias y falta de virilización). Mazen 2016 sugiere que el gran
espectro fenotípico de los trastornos del desarrollo sexual es debido a la herencia
poligénica de ciertos genes como MAP3K1 (52). Debido a las características variables y
los múltiples hallazgos genéticos, en especial en pacientes 46, XY con TDS, la NGS y en
concreto WES, son útiles para identificar una causa genética sin ideas preconcebidas
debido a la presencia de un fenotipo determinado.

15
Finalmente, surge otra dificultad adicional para la interpretación de resultados a nivel
genómico de estas investigaciones, pues las regiones no codificantes del genoma
pueden jugar un papel clave en el desarrollo sexual. Estas regiones no codificantes del
genoma solo pueden ser estudiadas mediante WGS, pero esta técnica presenta varios
inconvenientes. En primer lugar, la cantidad de datos mediante esta técnica es
abrumadora y su manejo no resulta sencillo. Por otra parte, se encuentran muchas
variantes génicas de significado incierto, ya sea en genes relacionados con la
enfermedad o no, y esto puede generar un problema a la hora de informar al paciente
sobre los resultados del test.

5.3 Sobre la clasificación de variantes

La NGS y el aumento de cobertura debido a las mejoras tecnológicas, han
facilitado la identificación de nuevas variantes génicas en genes implicados en el
desarrollo sexual. No obstante, la aparición de estas nuevas variantes y en concreto de
aquellas cuyo significado no se conoce (variantes de significado incierto, VOUS) supone
un problema de los test genéticos de esta índole, ya que al encontrar una VOUS, se
carecen de datos que permitan concluir su relevancia clínica.
Para clasificar una variante de este tipo, existen diversas estrategias: se pueden
intentar hacer estudios de cosegregación en familiares, para recabar información
clínica adicional y ver si la variante segrega con la enfermedad o se hereda de forma
independiente. En el caso de trastornos del desarrollo sexual esto puede resultar
difícil, debido a que muchas condiciones afectan a la fertilidad y los pacientes no
tienen descendencia. Por otra parte, aunque se confirme la cosegregación, no se
puede descartar que la variante sea únicamente un marcador ligado a una alteración
patogénica no detectada.
Otra estrategia utilizada para clarificar el significado de la variante es realizar un
análisis in silico y experimental del efecto de una mutación en concreto. La manera de
evaluar in silico los cambios de aminoácidos en alguna proteína se basa en la evidencia
de la conservación de las posiciones de aminoácidos a lo largo de la evolución, ya que
las posiciones clave para el funcionamiento de la proteína se habrán mantenido. Por lo
tanto, la mayoría de cambios patogénicos conocidos se localizarán en estas posiciones
conservadas. Se puede analizar la conservación de estos dominios proteicos mediante
el alineamiento múltiple de secuencias proteicas. Una vez se han hallado los residuos
conservados, se debe analizar el efecto de la mutación a nivel proteico. Esto no es
sencillo, y más teniendo en cuenta la dificultad añadida de los estudios in vitro en estos
casos, ya que los procesos de diferenciación y desarrollo sexual se dan sobre todo en
una etapa muy temprana del desarrollo fetal y por lo tanto es muy difícil recrear estas
condiciones a nivel de cultivo celular (53).

16
5.4 Propuesta de panel dirigido

El uso de técnicas de secuenciación masiva (NGS) ha empezado a ser el

conjunto de técnicas preferentes para el diagnóstico molecular de enfermedades
genéticas, especialmente aquellas congénitas monogénicas, ya que promete mejorar
el diagnóstico y el manejo del paciente mediante la secuenciación rápida de muchos
genes simultáneamente a un costo menor en comparación con otras pruebas (54).
Dentro de las técnicas de NGS, los paneles dirigidos ofrecen muchas ventajas, como su
bajo coste, menor tiempo empleado y en general mayor facilidad de manejo y análisis
de datos y parecen ser el método diagnóstico de NGS óptimo para realizar test
genéticos a pacientes con TDS. Por ello, y en base a los resultados obtenidos en este
trabajo y a la bibliografía consultada, se propone un panel dirigido personalizado tras
haber analizado publicaciones anteriores con los principales genes implicados en el
desarrollo sexual, consistente en 47 genes. La inclusión de los genes elegidos en este
panel se realizó en base a una revisión exhaustiva de distintas publicaciones sobre el
desarrollo sexual y su genética molecular. Se comprobó la implicación de estos genes
en el desarrollo sexual mediante la base de datos OMIM y GeneReviews, incluyendo
también el modo de herencia y la localización de los genes, así como un fenotipo
asociado a las mutaciones en los mismos. También se han incluido algunos genes cuya
relación genotipo/fenotipo en humanos no se ha demostrado, pero que debido a su
alto grado de conservación en mamíferos se han tenido en cuenta. Los genes incluidos
en el panel propuesto, así como la herencia, localización y fenotipo de los mismos se
encuentran resumidos en la tabla 2.
Tabla 2. Panel con los genes implicados en el desarrollo sexual propuesto en este Trabajo de Fin de Máster. Los
genes marcados con un (*) son aquellos genes implicados en el desarrollo sexual de mamíferos pero que no se ha
comprobado la relación genotipo/fenotipo en humanos hasta la fecha.

Gen Herencia Localización Fenotipo

AKAP2* - 9q31.3 Implicado en vías de regulación de desarrollo
ováricas.
AMH AR 19p13.3 Síndrome conducto mülleriano persistente
AMHR2 AR 12q13.13 Síndrome conducto mülleriano persistente
AR XL Xq12 Hipospadias, resistencia a andrógenos
ARX XL Xp21.3 Lisencefalía con ambigüedad genital
ATRX XL Xq21.1 46, XY TDS
BMP15 AD Xp11.22 46, XX DSD Disgenesia ovárica
BNC2 AD 9p22.3-p22.2 Obstrucción del tracto urinario inferior
CBX2 AR 17q25.3 Disgenesia gonadal completa 46, XY
CYP11A1 AD/AR 15q24.1 46, XY Inversión sexual con CAH (AR) /Hipospadias
(AD)
CYP11B1 AR 8q24.3 46, XX TDS. CAH por déficit en 11-beta-hydroxilasa
CYP17A1 AR 10q24.32 46, XY TDS. CAH por déficit en 17,20-liasa
CYP19A1 AR 15q21.2 46, XY TDS. Déficit aromatasa
CYP21A2 AR 6p21.33 Virilización. CAH por déficit de 21-hydroxilasa
CHD7 AD 8q12.2 Hipogonadismo hipogonadotropo
DHCR7 AR 11q13.4 Síndrome de Smith-Lemli-Opitz

17
 DHH AD/AR 12q13.12 46, XY Disgenesia gonadal parcial o completa
DMRT1 AD 9p24.3 46, XY TDS
ESR1/2 AR 6q25.1-q25.2 Resistencia a estrógenos
FGFR2 AD 10q26.13 46, XY disgenesia gonadal. Síndrome de Apert
FOXL2 AD 3q22.3 Fallo ovárico precoz
FSHR AR 2p16.3 46, XX Disgenesia ovárica
GNRHR AR 4q13.2 Hipogonadismo hipogonadotropo
HSD17B3 AR 9q22.32 Déficit de 17-β-hidroxi esteroido-deshidrogenasa
HSD3B2 AR 1p12 Déficit de 3-β-hidroxi esteroido deshidrogenasa,
CAH
KAL1 XL Xp22.31 Déficit GnRH, Síndrome de Kallmann
LHCGR AD/AR 2p16.3 46, XY TDS. Hipoplasia de células de Leydig (AR)/
Pubertad masculina precoz(AD)
LHX9* - 1q31.3 Gen implicado en la formación de las gónadas en
modelo animal (ratón).
MAMLD1 XL Xq28 Hipospadias
NR0B1 XL Xp21.2 46, XY Inversion sexual, CAH
NR3C1 AD 5q31.3 46, XX Hiperandrogenismo
NR5A1 AD 9q33.3 46, XY Inversión sexual
PAX2* AD/AR 10q24.31 Involved in initial formation of genital tracts
POR AR 7q11.23 Déficit de la oxidoreductasa del citocromo P450
PROK2 AD 3p13 Hipogonadismo hipogonadotropo
PROP1 AR 5q35.3 Déficit de la hormona pituitaria
RSPO1 AR 1p34.3 46, XX Inversión sexual e hiperqueratosis
palmoplantar
SOX3 XL Xq27.1 46, XX Inversión sexual
SOX9 AD 17q24.3 46, XX Inversión sexual y displasia campomélica
SRD5A2 AR 2p23.1 Hipospadias pseudovaginalis y/o perineoescrotales
SRY YL Yp11.2 46, XX TDS testiculares y 46, XY TDS ováricas
STAR AR 8p11.23 CAH por déficit de colesterol desmolasa
WDR11 AD 10q26.12 Hipogonadismo hipogonadotropo
WNT4 AD 1p36.12 46, XY TDS, 46, XY disgenesia gonadal completa
WT1 AD 11p13 Síndromes: Denys-Drash, Frasier, Meacham
WWOX AR 16q23.1-q23.2 46, XY Disgenesia gonadal
ZFPM2 AD 8q23.1 46, XY Inversión sexual

Se han incluido en este panel ciertos genes como AKAP2, PAX2 o LHX9, que a pesar de
que no se han encontrado mutados en humanos con TDS, su rol en el desarrollo sexual
se considera de relevancia.
AKAP2 interviene en el desarrollo ovárico (55). El déficit en PAX2 puede provocar
disgenesia de los tubulos mesonéfricos (56) debido a su relación con WT1, mientras
que LHX9 es un gen involucrado en el desarrollo sexual muy conservado entre
especies. Se considera determinante en la función de las gónadas humanas debido a su
alta tasa de conservación aminoacídica (57).

18
6. CONCLUSIONES Y PROYECCIÓN FUTURA

6.1 Conclusiones
1. Los paneles dirigidos de NGS para el diagnóstico molecular de pacientes con
TDS han demostrado ser efectivos, con un buen rendimiento diagnóstico
entorno 30-40%.
2. Las técnicas de NGS presentan un buen rendimiento diagnóstico en
pacientes con trastornos del desarrollo sexual 46, XY, con ratio medio del
38%.
3. Los datos obtenidos en los estudios realizados a pacientes 46, XX son poco
representativos debido al reducido número de pacientes pertenecientes a
este grupo que formaron parte de ellos.
4. Existe una escasez de datos sobre la efectividad de la NGS en pacientes 46,
XX. Es importante un estudio a gran escala aumentando el número de
pacientes pertenecientes a este grupo así como el de pacientes
pertenecientes a distintas etnias o lugares geográficos para evitar así la
interferencia en los resultados de factores como la consanguinidad.
5. Continuar con la investigación en este campo es de vital importancia con el
fin de incrementar el número de genes conocidos implicados en el
desarrollo sexual, así como la realización de estudios tanto in vitro como in
silico para clasificar las variantes génicas que se vayan encontrando
mediante NGS. De este modo, disminuir el desconocimiento acerca de este
grupo de genes y el mecanismo de desarrollo sexual.
6. Son necesarios los estudios a nivel de genoma completo con el fin de
caracterizar la implicación de las regiones no codificantes del genoma en el
desarrollo sexual.

6.2 Proyección futura

A pesar de ciertas limitaciones (como la de detectar CNVs), la tecnología NGS está
demostrando ser útil tanto para investigación como para realizar un diagnóstico de
enfermedades. En los estudios hasta ahora realizados en pacientes con trastornos del
desarrollo sexual, los paneles dirigidos y WES han demostrado tener un buen
rendimiento diagnóstico. No obstante, estas técnicas están aún en pleno desarrollo y
junto con el abaratamiento de los costes de secuenciación, prometen ser las técnicas
predilectas en los laboratorios para diagnosticar enfermedades genéticas que
presentan gran heterogeneidad, como los trastornos del desarrollo sexual, lo cual
ayudará a los clínicos a realizar un diagnóstico diferencial, brindar consejo genético y
poder proporcionar un tratamiento adecuado a los pacientes.

19
7. BIBLIOGRAFÍA

1. Eggers S, Sinclair A. Mammalian sex determination-insights from humans and

mice. Chromosom Res. 2012;20(1):215–38.
2. Koopman P, Sinclair A, Lovell-Badge R. Of sex and determination: Marking 25
years of Randy, the sex-reversed mouse. Dev. 2016 May 15;143(10):1633–7.
3. Biason-Lauber A. Control of sex development. Vol. 24, Best Practice and
Research: Clinical Endocrinology and Metabolism. 2010. p. 163–86.
4. Yang Y, Workman S, Wilson MJ. The molecular pathways underlying early
gonadal development. J Mol Endocrinol. 2019;62(1):R47–64.
5. Órganos animales. Reproductor. Túbulos seminíferos. Atlas de Histología
Vegetal y Animal [Internet]. [cited 2020 May 10]. Available from:
https://mmegias.webs.uvigo.es/2-organos-a/imagenes-grandes/reproductor-
tubulos.php
6. Bashamboo A, Eozenou C, Rojo S, McElreavey K. Anomalies in human sex
determination provide unique insights into the complex genetic interactions of
early gonad development. Clin Genet [Internet]. 2017 Feb 1 [cited 2020 Apr
9];91(2):143–56. Available from: http://doi.wiley.com/10.1111/cge.12932
7. Dreger AD, Sandberg D. Disorders of sex development. Pediatr Bioeth.
2009;149–62.
8. Biason-Lauber A. WNT4, RSPO1, and FOXL2 in sex development. Semin Reprod
Med. 2012;30(5):387–95.
9. Gomes NL, Chetty T, Jorgensen A, Mitchell RT. Disorders of Sex Development —
Novel Regulators , Impacts on Fertility , and Options for Fertility Preservation.
:1–31.
10. Lee PA, Houk CP, Ahmed SF, Hughes IA, Achermann J, Ahmed F, et al. Consensus
statement on management of intersex disorders. In: Pediatrics. American
Academy of Pediatrics; 2006. p. e488–500.
11. Walia R, Singla M, Vaiphei K, Kumar S, Bhansali A. Disorders of sex development:
A study of 194 cases. Endocr Connect. 2018;7(2):364–71.
12. Parera LA, Azcona C, Julián S, Conde JB. Anomalías del desarrollo sexual .
Desarrollo sexual diferente. Soc Española Endocrinol Pediátrica. 2019;(1):1–19.
13. Croft B, Ayers K, Sinclair A, Ohnesorg T. Review disorders of sex development:
The evolving role of genomics in diagnosis and gene discovery [Internet]. Vol.
108, Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. John Wiley and
Sons Inc.; 2016 [cited 2020 Apr 3]. p. 337–50. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28033663
14. Papp JC, Sandberg DE, Vilain E, Angeles L, Angeles L, Angeles L, et al. Genetics of
Disorders of Sex Development. 2018;1–23.
15. Audí L, Ahmed SF, Krone N, Cools M, McElreavey K, Holterhus PM, et al.
Genetics in endocrinology: Approaches to molecular genetic diagnosis in the
management of differences/disorders of sex development (DSD): Position paper
of EU COST Action BM 1303 “DSDnet.” Eur J Endocrinol. 2018 Oct
1;179(4):R197–206.
16. Croft B, Ohnesorg T, Sinclair AH. The Role of Copy Number Variants in Disorders
of Sex Development. Sex Dev. 2018;12(1–3):19–29.
17. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating

20
 inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977;74(12):5463–7.
18. Slatko BE, Gardner AF, Ausubel FM. Overview of Next Generation Sequencing
technologies (and bioinformatics) in cancer. Mol Biol. 2018;122(1):1–15.
19. Ono M, Harley VR. Disorders of sex development: New genes, new concepts.
Vol. 9, Nature Reviews Endocrinology. Nature Publishing Group; 2013. p. 79–91.
20. Craig Venter J, Adams MD, Myers EW, Li PW, Mural RJ, Sutton GG, et al. The
sequence of the human genome. Science (80- ). 2001 Feb 16;291(5507):1304–
51.
21. Koboldt DC, Ding L, Mardis ER, Wilson RK. Challenges of sequencing human
genomes. Brief Bioinform. 2010;11(5):484–98.
22. Yang T, Wei X, Chai Y, Li L, Wu H. Genetic etiology study of the non-syndromic
deafness in Chinese Hans by targeted next-generation sequencing. Orphanet J
Rare Dis [Internet]. 2013;8(1):1. Available from: Orphanet Journal of Rare
Diseases
23. Ahmed SF, Bashamboo A, Lucas-Herald A, McElreavey K. Understanding the
genetic aetiology in patients with XY DSD. Br Med Bull. 2013;106(1):67–89.
24. Rodríguez-Santiago B, Armengol L. Tecnologías de secuenciación de nueva
generación en diagnóstico genético pre- y postnatal. Diagnostico Prenat.
2012;23(2):56–66.
25. Sociedad Española de Endocrinología Pediátrica | Asociación Española de
Pediatría [Internet]. [cited 2020 May 12]. Available from:
https://www.aeped.es/sociedades/sociedad-espanola-endocrinologia-
pediatrica
26. Endo-ERN | European Reference Network on Rare Endocrine Conditions
[Internet]. [cited 2020 May 12]. Available from: https://endo-ern.eu/
27. Hughes LA, McKay-Bounford K, Webb EA, Dasani P, Clokie S, Chandran H, et al.
Next generation sequencing (NGS) to improve the diagnosis and management of
patients with disorders of sex development (DSD). Endocr Connect.
2019;8(2):100–10.
28. Baxter RM, Arboleda VA, Lee H, Barseghyan H, Adam MP, Fechner PY, et al.
Exome sequencing for the diagnosis of 46, XY disorders of sex development. J
Clin Endocrinol Metab. 2015;100(2):E333–44.
29. Dong Y, Yi Y, Yao H, Yang Z, Hu H, Liu J, et al. Targeted next-generation
sequencing identification of mutations in patients with disorders of sex
development. BMC Med Genet [Internet]. 2016;17(1):1–9. Available from:
http://dx.doi.org/10.1186/s12881-016-0286-2
30. Eggers S, Sadedin S, van den Bergen JA, Robevska G, Ohnesorg T, Hewitt J, et al.
Disorders of sex development: Insights from targeted gene sequencing of a large
international patient cohort. Genome Biol. 2016;17(1):1–21.
31. Kim JH, Kang E, Heo SH, Kim GH, Jang JH, Cho EH, et al. Diagnostic yield of
targeted gene panel sequencing to identify the genetic etiology of disorders of
sex development. Mol Cell Endocrinol [Internet]. 2017;444:19–25. Available
from: http://dx.doi.org/10.1016/j.mce.2017.01.037
32. Fan Y, Zhang X, Wang L, Wang R, Huang Z, Sun Y, et al. Diagnostic application of
targeted next-generation sequencing of 80 genes associated with disorders of
sexual development. Sci Rep [Internet]. 2017;7(August 2016):1–10. Available
from: http://dx.doi.org/10.1038/srep44536

21
33. Buonocore F, Clifford-Mobley O, King TFJ, Striglioni N, Man E, Suntharalingham
JP, et al. Next-Generation Sequencing Reveals Novel Genetic Variants (SRY,
DMRT1, NR5A1, DHH, DHX37) in Adults With 46,XY DSD. J Endocr Soc.
2019;3(12):2341–60.
34. Özen S, Onay H, Atik T, Solmaz AE, Özklnay F, Gökşen D, et al. Rapid Molecular
Genetic Diagnosis with Next-Generation Sequencing in 46,XY Disorders of Sex
Development Cases: Efficiency and Cost Assessment. Horm Res Paediatr.
2017;87(2):81–7.
35. Wang H, Zhang L, Wang N, Zhu H, Han B, Sun F, et al. Next-generation
sequencing reveals genetic landscape in 46, XY disorders of sexual development
patients with variable phenotypes. Hum Genet [Internet]. 2018;137(3):265–77.
Available from: https://doi.org/10.1007/s00439-018-1879-y
36. Knebelmann B, Boussin L, Guerrier D, Legeai L, Kahn A, Josso N, et al. Anti-
Müllerian hormone Bruxelles: A nonsense mutation associated with the
persistent Müllerian duct syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88(9):3767–
71.
37. Androgen insensitivity syndrome | Genetic and Rare Diseases Information
Center (GARD) – an NCATS Program [Internet]. [cited 2020 May 5]. Available
from: https://rarediseases.info.nih.gov/diseases/5803/index
38. Porter JA, Young KE, Beachy PA. Cholesterol modification of hedgehog signaling
proteins in animal development. Science (80- ). 1996 Oct 11;274(5285):255–9.
39. Raymond CS, Shamu CE, Shen MM, Seifert KJ, Hirsch B, Hodgkin J, et al. Evidence
for evolutionary conservation of sex-determining genes. Nature. 1998 Feb
12;391(6668):691–5.
40. Green VL, Speirs V, Landolt AM, Foy PM, Atkin SL. 17β-Hydroxysteroid
dehydrogenase type 1, 2, 3, and 4 expression and enzyme activity in human
anterior pituitary adenomas. J Clin Endocrinol Metab. 1999;84(4):1340–5.
41. Fukami M, Wada Y, Miyabayashi K, Nishino I, Hasegawa T, Camerino G, et al.
CXorf6 is a causative gene for hypospadias. Nat Genet. 2006 Dec 5;38(12):1369–
71.
42. Tremblay JJ, Viger RS. A MUTATED FORM OF STEROIDOGENIC FACTOR 1 (SF-1
G35E) THAT CAUSES SEX REVERSAL IN HUMANS FAILS TO SYNERGIZE WITH
TRANSCRIPTION FACTOR GATA-4 Running Title: SF-1 G35E competes GATA-4/SF-
1 synergism Keywords: Sex differentiation / MIS / Interaction / Hormone /
Cooperation / Dominant Negative / Mutation / Haploinsufficiency Downloaded
from [Internet]. Vol. 6. JBC Papers in Press; 2003 [cited 2020 May 5]. Available
from: http://www.jbc.org/
43. Niakan KK, McCabe ERB. DAX1 origin, function, and novel role. Vol. 86,
Molecular Genetics and Metabolism. Academic Press Inc.; 2005. p. 70–83.
44. Matsushita M, Kitoh H, Kaneko H, Mishima K, Kadono I, Ishiguro N, et al. A novel
SOX9 H169Q mutation in a family with overlapping phenotype of mild
campomelic dysplasia and small patella syndrome. Am J Med Genet Part A
[Internet]. 2013 Oct [cited 2020 May 5];161(10):2528–34. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24038782
45. Wagner K-D, Wagner N, Schley G, Theres H, Scholz H. The Wilms’ tumor
suppressor Wt1 encodes a transcriptional activator of the class IV POU-domain
factor Pou4f2 (Brn-3b). Gene [Internet]. 2003 Feb 27 [cited 2020 May

22
 5];305(2):217–23. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12609742
46. Xue M, Wang X, Li C, Zhao M, He F, Li X. Novel pathogenic mutations in disorders
of sex development associated genes cause 46,XY complete gonadal dysgenesis.
Gene. 2019;718(May).
47. Cheng Y, Sun Y, Ji Y, Jiang D, Teng G, Zhou X, et al. Novel compound variants of
the AR and MAP3K1 genes are related to the clinical heterogeneity of androgen
insensitivity syndrome. 2020;0:1–16.
48. Richards S, Aziz N, Bale S, Bick D, Das S, Gastier-Foster J, et al. Standards and
guidelines for the interpretation of sequence variants: A joint consensus
recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics
and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015 May
8;17(5):405–24.
49. Snustad DP, Simmons MJ. Genetics. Wiley; 2012. 766 p.
50. Mutación con cambio de sentido | NHGRI [Internet]. [cited 2020 Jun 2].
Available from: https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Mutacion-con-
cambio-de-sentido
51. Blackless M, Charuvastra A, Derryck A, Fausto-Sterling A, Lauzanne K, Lee E. How
sexually dimorphic are we? Review and synthesis. Am J Hum Biol. 2000
Mar;12(2):151–66.
52. Mazen I, Abdel-Hamid M, Mekkawy M, Bignon-Topalovic J, Boudjenah R, El
Gammal M, et al. Identification of NR5A1 mutations and possible digenic
inheritance in 46,XY gonadal dysgenesis. Sex Dev. 2016;10(3):147–51.
53. Baetens D, Verdin H, De Baere E, Cools M. Update on the genetics of differences
of sex development (DSD). Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2019;33(3).
54. Lim ECP, Brett M, Lai AHM, Lee SP, Tan ES, Jamuar SS, et al. Next-generation
sequencing using a pre-designed gene panel for the molecular diagnosis of
congenital disorders in pediatric patients. Hum Genomics. 2015;9:33.
55. Moss SB, Gerton GL. A-kinase anchor proteins in endocrine systems and
reproduction. Vol. 12, Trends in Endocrinology and Metabolism. Elsevier Inc.;
2001. p. 434–40.
56. Wilhelm D, Palmer S, Koopman P. Sex determination and gonadal development
in mammals. Physiol Rev. 2007;87(1):1–28.
57. Ottolenghi C, Moreira-Filho C, Mendonça BB, Barbieri M, Fellous M, Berkovitz
GD, et al. Absence of mutations involving the lim homeobox domain gene LDX9
in 46,XY gonadal agenesis and dysgenesis. J Clin Endocrinol Metab.
2001;86(6):2465–9.

23
8. LISTADO DE ABREVIATURAS

AIS: Síndrome de insensibilidad androgénica

AMH: Hormona anti-Mülleriana
CAH: Hiperplasia suprarrenal congénita
CGH: Hibridación genómica comparativa
CNV: Copy number variant. Variantes en el número de copias
DHEA: Deshidroepiandrosterona
DHT: Dihidrotestosterona
ddNTP: Dideoxinucleótidos
FISH: Hibridación Fluorescente In Situ
FSH: Hormona Folículo-estimulante
INSL-3: Insulin-like peptide 3
LH: Hormona Luteinizante
NGS: Next Generation Sequencing
SNP: Single nucleotide polymorphism. Polimorfismos en un nucleótido
SNV: Single Nucleotide Variant. Variantes en un único nucleótido
TDS: Trastornos del desarrollo sexual
TNGS: Targeted Next Generation Sequencing. Panel dirigido
VOUS/VUS: Variantes de significado incierto
WES: Whole Exome Sequencing
WGS: Whole Genome Sequencing

24