Guía de Prácticas Microbiología General
PRÁCTICA
MICROBIOLOGÍA DE
11 LOS ALIMENTOS
Análisis Bacteriológico de la Leche
Practica 11. Análisis Microbiológico de los Alimentos
I. INTRODUCCIÓN
En todos los alimentos frescos están presentes algunos microorganismos viables. La
finalidad de los métodos de valoración es detectar evidencia de un crecimiento
microbiano anormal en los alimentos o detectar la presencia de organismos
específicos de importancia sanitaria, tales como Salmonella, Staphylococcus y
Clostridium botulinum.
La microbiología de los productos lácteos considera aspectos de ecología microbiana
y de biotecnología para la producción, de los diversos microorganismos que pueden
ser utilizados para obtener productos lácteos, haciendo énfasis en las bacterias ácido
lácticas, también comprende el estudio de los patógenos transmitidos por la leche, y
de los que causan su deterioro.
La composición de la leche hace que esta sea un medio óptimo para el desarrollo de
muchos microorganismos; sin embargo, la leche recién ordeñada posee dentro de
ciertos límites propiedades germicidas o bacteriostáticas, constituida por sustancias
inhibidoras como las lactoperoxidasas y aglutininas. En las leches comerciales o en
polvo, la actividad inhibitoria queda eliminada por efectos de tratamiento térmico.
II. OBJETIVOS
• Determinar la calidad bacteriológica de la leche y productos lácteos.
• Determinar mesófilos viables, coliformes totales, S. aureus, mohos y levaduras.
III. MARCO TEORICO
Los microorganismos son los responsables de los sabores, aromas y caracteres
físicos deseables de muchos productos lácteos como queso, leches fermentadas.
Los microorganismos patógenos y sus toxinas pueden contaminar los alimentos,
sirviendo posteriormente como vehículos de enfermedades.
Página | 116
Dra. María del Carmen Valdez Ortiz
Guía de Prácticas Microbiología General
Pueden originar sabores extraños y defectos físicos.
ALTERACIONES
Las leches enlatadas de tipo condensada, por su elevado contenido de azúcar y su
baja acidez se mantienen en perfectas condiciones, casi indefinidamente sin
refrigeración. Los microorganismos que se pueden desarrollar son mohos como
Aspergillus y Pennicillum.
Los productos a granel, que tienen bajo contenido de azúcar, son más susceptibles de
crecimiento microbiano y los mohos son de origen microbiano por la aparición de
botones es decir el desarrollo micelial
La leche evaporada, mal sellada permite el ingreso de muchos microorganismos que
pueden proliferar y producir la formación de gas, sabor a levadura u otros sabores
desagradables, causados por Bacillus sterothermophilus, Bacillus coagulans y
Clostridium.
Las alteraciones de origen microbiano, en el sabor, se denominan pútrido” y a “frutas”
en el aspecto físico, se presenta la viscosidad y la coagulación parcial de la leche,
producida por Pseudomonas, Flavobacterium, Chromobacterium, Alcaligenes y las
coliformes.
El sabor acido de la leche producido por Streptococcus lactis se detecta cuando la
taza alcanza de 30 a 90 millones por mililitro, a una temperatura de 10 a 37ºC o a
temperaturas de 37 a 50ºC que producen Streptococcus thermophylus, S. fecalis y
Lactobacillus vulgaricus. A temperaturas superiores a 50ºC, es producido por Bacillus.
La proteólisis acida es producida por Micrococcus y Streptococcus faecalis. Bacillus
cereus produce primero la fermentación de la lactosa y luego una proteólisis en la
leche; la cual es acida.
BACTERIAS PATÓGENAS EN LA LECHE
La leche secretada por las glándulas mamarias de los mamíferos sanos normalmente
es estéril. Sin embargo, a partir de ese momento, está sujeto a la contaminación de
dos fuentes principales: (1) la microbiota normal de los conductos mamarios y (2) la
microbiota del entorno externo, incluidas las manos de los ordeñadores, la maquinaria
de ordeño, los utensilios y el pelaje del animal.
Página | 117
Dra. María del Carmen Valdez Ortiz
Guía de Prácticas Microbiología General
La leche es un excelente medio de crecimiento para las bacterias patógenas y puede
ser un reservorio de enfermedades infecciosas. Las infecciones transmitidas por la
leche pueden originarse en animales enfermos o en manipuladores humanos
infectados que contaminan la leche directa o indirectamente. Las enfermedades
animales importantes que se transmiten a los seres humanos a través de la leche son
la tuberculosis bovina, la brucelosis, la yersiniosis, las infecciones estreptocócicas de
los animales y la fiebre Q. Las enfermedades humanas que pueden transmitirse a
través de la leche a través de manipuladores de leche infectados incluyen infecciones
estreptocócicas, shigellosis y salmonelosis.
PASTEURIZACIÓN
La pasteurización es un medio de procesar la leche cruda antes de distribuirla para
garantizar que esté relativamente libre de bacterias y sea segura para el consumo
humano. Es un proceso térmico lo suficientemente suave para preservar las
propiedades físicas y nutricionales de la leche, pero suficiente para destruir los
microorganismos patógenos (con la posible excepción del virus de la hepatitis A). Los
dos métodos más comúnmente utilizados para la pasteurización de la leche son (1)
calentamiento a 62,9 °C (145 °F) durante 30 minutos, o (2) calentamiento a 71,6 °C
(161 °F) durante un mínimo de 15 segundos.
ANALISIS BACTERIOLÓGICO DE LA LECHE
Los estándares bacteriológicos para la leche incluyen (1) conteo total de colonias, (2)
pruebas de coliformes, (3) cultivos para patógenos y (4) pruebas para la enzima
fosfatasa sensible al calor, normalmente presente en la leche cruda (esta enzima se
destruye con una adecuada pasteurización y no debe ser detectable en leche
procesada correctamente).
IV. PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO 1: NUMERACIÓN DE MICROOGRANISMOS AEROBIOS
MESÓFILOS VIABLES – METODO DE RECUENTO EN PLACA
Fundamento: Este método se basa en que cada célula bacteriana presente en la
muestra de alimento, puede desarrollar en un medio de cultivo solido formando
colonias. El número de bacterias aerobias mesófitas presente en los alimentos, es uno
de los indicadores microbianos de calidad de los mismos.
Página | 118
Dra. María del Carmen Valdez Ortiz
Guía de Prácticas Microbiología General
Este indicador es útil para:
• Verificar la eficiencia de los sistemas de limpieza y desinfección y averiguar la
temperatura a que fueron mantenidos los alimentos durante los procesos de
tratamiento industrial, transporte y almacenamiento.
• Tener una idea sobre la alteración insuficiente de los alimentos, de su probable
vida útil, de la descongelación no controlada de los alimentos congelados y de
los usos de temperatura de refrigeración inadecuados en alimentos
refrigerados.
• Evidenciar las causas de contaminación en el proceso de elaboración de los
alimentos.
• Evidenciar las causas de contaminación en el proceso de elaboración sobre la
alteración insuficiente de los alimentos.
Procedimiento:
1. Preparar diluciones 10-1, 10-2 ,10-3 ,10-4 ,10-5
2. Trasvasar mediante una pipeta estéril 1ml de cada dilución 10-1, 10-2,10-3 ,10-4
,10-5 a placas estériles.
3. Incorporar 15 ml de agar fundido a temperatura de 45ºC a cada placa dentro de
los 10 minutos de preparado la dilución.
4. Mezclar en forma inmediata con movimientos de vaivén y rotación de la placa.
5. Una vez solidificado el agar, invertir las placas e incubarlas a temperatura de
37ºC de 18 a 24 horas.
6. Después de la incubación retirar las placas y proceder a contar todas las
colonias observadas, eligiendo la placa con conteo comprendido entre 30 y 300
colonias. Para una mejor valoración estadística, se recomienda hacer por
duplicado.
7. Luego se calcula el promedio de ambas placas y el valor obtenido, se expresa
como recuento estándar en placa en UFC /mL, y se multiplica por el factor de
dilución, según el siguiente cuadro:
Página | 119
Dra. María del Carmen Valdez Ortiz
Guía de Prácticas Microbiología General
Cálculo de colonia
Nº de colonias x número Total
Recuento Total Total
de cuadrantes x dilución
10-1 n(4) x 10 x
10-2 n(4) x 100 x
10-3 n(4) x 1000 x
Suma total x
*Recuento final = suma total/3 UFC/ml
*UFC= Unidades Formadoras de colonia
Figura 34. Numeración de Aerobio Mesófilos Viables
EXPERIMENTO 2: NUMERACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES –
METODO DE RECUENTO EN PLACA
La presencia de estos microorganismos en los alimentos evidencia una contaminación
de origen fecal debido a que no se cumplen buenas prácticas de manipulación de
alimentos. La principal bacteria de este grupo es la Escherichia coli cuya presencia en
los alimentos indica que posiblemente el consumidor en caso de ingerir ese alimento
podría estar expuesto a demás bacterias entéricas.
Página | 120
Dra. María del Carmen Valdez Ortiz
Guía de Prácticas Microbiología General
Procedimiento:
1. Preparar las muestras y diluciones según procedimientos recomendados por su
instructor
2. Trasvasar mediante una pipeta estéril 1ml de cada dilución a placas estériles
3. Incorpore 15 ml del medio VRBA a una temperatura entre 44˚C - 46˚C, dentro
de los 10 minutos de preparado la dilución
4. Mezclar en forma inmediata con movimientos de vaivén y rotación de la placa.
5. Una vez solidificado el agar, invertir las placas e incubarlas a temperatura de
37ºC de 18 a 24 horas
6. Realizar el recuento en las placas que contengan entre 20 y 200 colonias,
considerando aquellas colonias color violeta o rojo oscuro, rodeadas de un
precipitado rojo violeta.
7. Seguir los pasos anteriormente descritos para realizar el cálculo
EXPERIMENTO 3: NUMERACIÓN DE Staphylococcus aureus
El recuento de los Staphylococcus aureus se lleva a cabo fundamentalmente
por 3 razones:
• Cuando existe sospecha de un determinado alimento es el producto de
intoxicación alimentaria, confirmándose tal hecho si se demuestra la
presencia de un gran número de Staphylococcus Coagulasa positivos en
dicho alimento.
• Para demostrar que un alimento pueda determinar casos de intoxicación
alimentaria, cundo se le mantiene en condiciones que le permitan la
formación de toxinas o si se utiliza como ingrediente de otros alimentos
transformados.
• Para determinar contaminación peligrosa a la elaboración del alimento.
Página | 121
Dra. María del Carmen Valdez Ortiz
Guía de Prácticas Microbiología General
En términos generales Staphylococcus aureus es un buen indicador para
demostrar que los métodos de limpieza y desinfección utilizados en la industria
de alimentos no son los adecuados.
Procedimiento:
1. Preparar diluciones 10-1, 10-2 ,10-3,10-4,10-5
2. Trasvasar mediante una pipeta estéril 1ml de cada dilución 10-1,10-2,10-3,
104,10-5 a placas estériles.
3. Incorporar 15 ml de agar fundido a temperatura de 45ºC a cada placa
dentro de los 10 minutos de preparado la dilución.
4. Mezclar en forma inmediata con movimientos de vaivén y rotación de la
placa.
5. Una vez solidificado el agar, invertir las placas e incubarlas a
temperatura de 37ºC de 18 a 24 horas.
6. Luego se procede a contar las colonias que han crecido en superficie
como en profundidad, reconociéndolas con las características culturales
típicas del género, como son: colonias circulares, color amarillo,
convexas. Se elige la placa con recuento comprendido entre 20 y 200.
7. Luego se eligen 5 colonias representativas y se realiza la prueba de la
coagulasa.
8. Resultados: Calcular del total de las colonias características la
proporción de colonias positivas a la prueba de la coagulasa teniendo en
cuenta la dilución empleada.
Prueba de la Coagulasa para Staphylococcus aureus
1. Se pasan las colonias seleccionadas a tubos con caldo BHI y se incuba por 18
a 24 hrs con 35 °C.
2. Luego se adiciona 0.1 ml del cultivo desarrollado a tubos que contienen 0.3 ml
de plasma y se incuba a 35 °C durante un tiempo máximo de 4 horas,
Página | 122
Dra. María del Carmen Valdez Ortiz
Guía de Prácticas Microbiología General
evaluando en cada hora la formación de coágulo visible por la inversión o
inclinación suave del tubo.
EXPERIMENTO 4: RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS
Este es un indicador de deterioro de los alimentos.
Procedimiento:
1. Preparar las muestras y diluciones según procedimientos recomendados por su
instructor.
2. Trasvasar mediante una pipeta estéril 1ml de cada dilución a placas estériles.
3. Sembrar cada tubo de dilución mediante extensión en superficie en Agar
Diclorán Rosa de Bengala con Cloranfenicol (DRBC) o Agar Diclorán 18%
Glicerol.
4. Incubar a las placas de agar a 22-25 ºC durante 5 días. Las placas se incuban
en posición normal (no invertida) porque las colonias de levaduras y los hongos
filamentosos crecen mejor de esta manera.
5. Realizar el recuento en las placas que contengan menos de 150.
6. Seguir los pasos anteriormente descritos para realizar el cálculo.
Figura 35. Hongos y levaduras en agar Dicloran y agar Rosa de Bengala (DRBC)
Página | 123
Dra. María del Carmen Valdez Ortiz
Guía de Prácticas Microbiología General
V. RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSION, REFERENCIAS
Con apoyo de sus fotografías explicará lo realizado en la práctica. Anexará sus
resultados y completará sus discusiones, conclusiones, trabajo encargado y sus
referencias bibliográficas. Para sus resultados, consulte los “Criterios Microbiológicos
de Calidad Sanitaria e Inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano”
RM N° 615-2003 SA/DM disponible en la web.
VI. TRABAJO ENCARGADO
1. Investigue tres enfermedades transmitidas por la leche con su respectivo
agente etiológico.
2. Investigue sobre el método de Petrifilm, para recuento de mesófilos aerobios
viables, coliformes totales y fecales.
3. Investigue los métodos para determinación de Clostridium y Brucella en leche
4. ¿Qué es el “Código Alimentario Internacional” (Codex Alimentarius)? y ¿Qué
importancia tiene para el desarrollo de nuestro país?
5. ¿Qué significan las siglas FDA, FAO, ICMS y AOAC? Investigue a que se
dedican estas instituciones u organizaciones
Página | 124
Dra. María del Carmen Valdez Ortiz
