TINCIN

Los colorantes sufren combinacin qumica con el protoplasma de la bacteria;

si la clula no est muerta, el proceso de tincin la destruye; por tanto, tal
proceso es drstico y puede producir artefactos.
Los colorantes utilizados a menudo son sales. Los colorantes bsicos
consisten de cationes teidos con un anin incoloro; ocurre lo contrario con los
colorantes cidos. Las clulas bacterianas son ricas en cidos nucleicos y
portan cargas negativas en los grupos fosfato. sta se combina con las cargas
positivas de los colorantes bsicos. Los colorantes cidos no tien a las clulas
bacterianas y por tanto pueden utilizarse para teir el material de fondo a fin
de proporcionar un contraste de color.
Los colorantes bsicos tien las clulas bacterianas de manera uniforme a
menos que en primer lugar se destruya el RNA citoplsmico. Sin embargo,
pueden utilizarse tcnicas de tincin especial para diferenciar los flagelos,
cpsulas, paredes celulares, membranas celulares, grnulos, nucleoides y
esporas.
TI N C I N D E G RA M

Una caracterstica taxonmica importante de las bacterias es su respuesta a la

tincin de Gram. Las propiedades de tincin de Gram parecen ser
fundamentales, porque la reaccin de Gram se correlaciona con muchas otras
propiedades morfolgicas en formas con relacin filogentica. Un
microorganismo que en potencia es positivo para la tincin de Gram puede
parecerlo slo bajo condiciones ambientales particulares y en un cultivo joven.
Los procedimientos de tincin de Gram inician con la aplicacin de un colorante
bsico, violeta de genciana. A continuacin se aplica una solucin de yodo;
todas las bacterias se tien de color azul en este punto del procedimiento.
Luego la clula se trata con alcohol. Las clulas Gram positivas que conservan
el complejo de violeta de genciana-yodo adquieren un color azul y las clulas
gramnegativos se descoloran por completo con la adicin de alcohol. Como
ltimo paso se aplica otro colorante (como rojo de safranina) de forma que las
clulas gramnegativos decoloradas adquieran un color contrastante; las clulas
Gram positivas adquieren un color violceo.
La base de la reaccin diferencial a la tincin de Gram es la estructura de la
pared celular, como se coment antes en este captulo.
El procedimiento recibi su nombre por el histlogo, Hans Christian Gram,
quien desarroll este procedimiento de tincin diferencial en un intento de teir
las bacterias en tejidos infectados. La tincin de Gram depende de la
capacidad de ciertas bacterias (grampositivas) para retener un complejo de
cristales de color violeta (un colorante de color violceo) adems de yodo

despus de un breve lavado con alcohol o acetona. Las bacterias

gramnegativas no retienen el complejo de colorante-yodo y se vuelven
translucidas, pero pueden volverse a teir con safranina (un colorante de color
rojo). As, las bacterias grampositivas adquieren un aspecto violceo bajo el
microscopio, en tanto que las bacterias gramnegativas se ven de color rojo. La
diferenciacin entre estos dos grupos refleja diferencias fundamentales en sus
envolturas celulares.
Adems de brindar proteccin osmtica (5 a 20atm).
Una capa de la pared gramnegativa (la membrana externa) evita el paso de
molculas relativamente grandes.
ESTUDIO MICROSCOPICO Y TINCIONES

La tincin con el mtodo de Gram es una tcnica muy til en la microbiologa

diagnostica. Casi todas las muestras en casos en que se sospecha una
infeccin bacteriana deben ser colocadas en extensiones (frotis) en laminillas
(portaobjetos), se teirn con el mtodo de Gram y se estudiaran
microscpicamente. En el estudio microscpico, habr que identificar en primer
lugar la reaccin de Gram en las bacterias (el color azul violceo denota la
presencia de organismos Gram positivos; el color rojo Gram
negativos), y su morfologa (forma: cocos, bacterias, fusiformes u otros). Las
caractersticas de las bacterias en extensiones teidas con tincin de
Gram no permiten identificar su especie. El informe de cocos Gram
positivos en cadenas es sugerente pero no definitivo en cuanto a la
presencia de especies de estreptococos; los cmulos de cocos
grampositivos sugieren la presencia de una especie de estafilococos. Algunas
bacterias Gram positivas no viables pueden mostrar caractersticas de tincin
Gram negativas. De manera tpica se ha definido a la morfologa bacteriana
con el empleo de microorganismos que han proliferado en agar. Sin embargo,
tienen una morfologa muy variable las bacterias en lquidos o tejidos
corporales.
En la bsqueda de micobacterias habr que teir las muestras con tcnicas
para microorganismos acidorresistentes, es decir, tinciones de ZiehlNeelsen o de kinyoun

T I N C I N AC I D O R R E S I S T E N T E

Las bacterias acidorresistentes son aquellas que conservan la carbolfucsina

(tiroxina bsica disuelta en una mezcla de alcohol-fenol) incluso cuando se
decolora con cido clorhdrico en alcohol. Un frotis de clulas sobre una
laminilla se cubre con carbolfucsina y se calienta en bao mara. A
continuacin se lleva a cabo la decoloracin con la mezcla de cido alcohol y
por ltimo se aplica una tincin de contraste (azul o verde). Las bacterias acido
resistentes (micobacterias y algunos actinomicetos relacionados) adquieren
color rojizo en tanto que otras clulas adquieren el color del segundo colorante.
Es muy limitado el nmero de gneros de bacterias cido-alcohol resistente:
Mycobacterium
Nocardia
T I N C I N N E G ATI VA

Este procedimiento consiste en la atencin del entorno con un colorante cido,

dejando a las clulas incoloras. El colorante negro de nigrosina (tinta china) se

utiliza a menudo. Dicho mtodo se emplea para aquellas clulas o estructuras

difciles de teir en forma directa.
El microorganismo de la imagen es bacillus cereus
T I N C I N D E LO S F L AG E LO S

PRINCIPIO

La mayora de las bacterias mviles tienen flagelos, cuyas formas, cantidad y

posicin son caractersticas importantes para la identificacin de gneros y
especies, en particular cuando las reacciones qumicas son dbiles o confusas.
La tcnica de coloracin de Leifson (o sus modificaciones) es la empleada con
mayor frecuencia en los laboratorios clnicos y no es difcil de realizar, siempre
y cuando se sigan los detalles exactos de cada paso del procedimiento.
Los flagelos bacterianos pueden colorearse con soluciones alcohlicas de
colorantes de rosanilina, que forman un precipitado cuando el alcohol se
evapora durante el procedimiento de coloracin. Se utiliza fucsina bsica
(acetato de pararosaanilina) como colorante principal con el agregado de cido
tnico a la solucin, como mordiente. Se puede utilizar un colorante de
contraste, como el azul de metileno, para visualizar mejor las bacterias, en los
casos en que la coloracin principal es dbil o no reacciona en absoluto con la
pared celular de la bacteria.
C O N T R O L D E C A LI DA D

Positivas: Pertirico, Escherichia coli; polar monotrico. Pseudomonas

aeuroginosa: multitrico. Burkholderia cepacia
Negativas Acinetobacter baumanii
PROCEDIMIENTO

M T O D O D E L E I FS O N

Preparar una suspensin poco densa de bacterias de agua a partir de un cultivo

joven en un agar apropiado
Colocar dos gotas de la suspensin bacteriana en un extremo de un
portaobjetos lavado con cido. Dejar secar al aire. Con un lpiz de cera, dibujar
una lnea perpendicular en la superficie del vidrio del lado interno de la
suspensin seca

Colocar el portaobjetos en un soporte inclinado y cubrir la suspensin

bacteriana seca con una capa fina de colorante. La marca hecha con el lpiz de
cera impide que el colorante se escurra del extremo del portaobjetos
Colorear durante 5 a 15 minutos, dejando que se forme un precipitado a
medida que se evapora el alcohol. El tiempo de tincin disminuye si el
colorante es fresco, si la temperatura del ambiente es alta, si hay corrientes de
aire en el laboratorio o si la capa de colorante es muy delgada. Las condiciones
opuestas aumentan el tiempo de coloracin
Cuando se forma el precipitado, enjuagar el portaobjetos suavemente con agua
destilada, eliminar el exceso de agua y dejar secar al aire
M T O D O D E RY U

Preparar un frotis tomando bacterias de un cultivo joven en un medio de cultivo

libre de hidratos de carbono con una aguja de siembra, tocando levemente el
centro de cada una de dos gotas de agua destilada colocadas en un
portaobjetos nuevo, lavado antes. Dejar que las gotas se sequen a temperatura
ambiente
Cubrir los frotis secados al aire con abundante solucin colorante durante 1 a
5 minutos (puede ser necesario realizar algunas pruebas para determinar el
tiempo exacto en el que se produce la coloracin satisfactoria de los flagelos,
pero sin que haya excesivos detritos en el fondo). Eliminar la solucin colorante
por lavado con agua corriente
Una vez secos los frotis observarlos con el microscopio con objetivo de
inmersin. Los cuerpos celulares y los flagelos se tien de violeta
R E S U LTA D O S

I N T E R P R E TAC I N

Observar el portaobjetos teido con el microscopio con objetivo de inmersin

en aceite (100x). Deben verse los flagelos coloreados de rojo oscuro a azul
negro. Comparar la morfologa con las microfotografas proporcionadas en el
atlas of bacterial flagellation de leifson.
Los flagelos son demasiado delgados (12 a 30 nm de dimetro) para que sean
visibles en el microscopio de luz. Sin embargo, su presencia y distribucin
pueden demostrarse al tratar las clulas con una suspensin coloidal inestable
de sales de cido tnico, lo que causa la precipitacin intensa sobre las
paredes celulares y flagelos. De esta manera, el dimetro aparente de stos se
incrementa a un tamao tal que las tinciones subsiguientes con fucsina bsica
hacen visibles a los flagelos con microscopa de luz.

En las bacterias peritricas los flagelos forman haces durante el movimiento y

tales haces pueden tener un grosor tal que sea posible observarlos en clulas
vivas en la microscopa de campo oscuro o de contraste de fases.
Vibrio cholerae. Tincin de Leifson para evidenciar el flagelo (coloreada
digitalmente).
TINCIN DE LA CPSUL A

La presencia de la cpsula por lo comn se demuestra por procedimientos de

tincin negativa o modificaciones de tales procedimientos. Uno de estos
mtodos de tincin de la cpsula (mtodo de Welch) implica el tratamiento
con solucin de violeta de genciana caliente seguido de un lavado con solucin
de sulfato de cobre. Este ltimo se utiliza para eliminar el exceso de colorante
porque las tcnicas convencionales de lavado causaran la disolucin de la
cpsula. Las sales de cobre tambin proporcionan color al fondo, con el
resultado de que la clula y el fondo adquieren un color azul oscuro y la
cpsula tiene un color azul mucho ms plido.
TINCIN DE NUCLETIDOS

Los nucletidos se pueden teir con la tincin de Feulgen, un mtodo especfico

para el DNA.
Tincin de Feulgen
Esta reaccin se basa en que una hidrolisis acida de duracin moderada
ocasiona ruptura del nucletido y separacin de la base; especialmente se
produce separacin de bases adenina y guanina. El resto cido que queda se
denomina cido apurinico y es este el que es capaz de reaccionar con el
reactivo de Schiff.
E N S AYO D E S C H I F F

Otro ensayo de clasificacin para aldehdos que se emplea en ocasiones es el

de Schiff. En el que se hace reaccionar la fucsina (hidrocloruro de p-rosaanilina)
con el aldehdo en una disolucin que contenga cido sulfuroso, con lo que se
forma un complejo purpura. Esta coloracin, debida al colorante quinoide que
resulta, es bastante inconfundible, y en consecuencia, una buena indicacin de
la presencia de un aldehdo de un carbonilo. Desafortunadamente el ensayo no
es siempre tan seguro como podramos esperar. La mayor parte de los
aldehdos aromticos dan coloraciones caractersticas a pesar de su solubilidad
limitada (probablemente a causa de su carcter aromtico). Los aldehdos
alifticos cuyo mayor peso molecular limita su solubilidad a menudo dan
resultados dudosos.
El reactivo de Schiff es incoloro o rosa tenue. Cuando reacciona con un
aldehdo, se origina una reaccin violeta oscuro. Por otra parte, las cetonas
tienden a dar slo una tonalidad rosa con el reactivo de Schiff. A veces cuando
un supuesto aldehdo no da un resultado positivo, puede ser a causa de la
insolubilidad del compuesto carbonilo. La adicin de una pequea cantidad de
acetona como disolvente puede permitir la observacin de la coloracin
caracterstica. Si se emplea est tcnica, es importante aadir la acetona en
primer lugar y observar el cambio de color en ausencia del problema.
Advertencia: est variante no es totalmente segura y su resultado debe
considerarse si es claramente positivo.
Necesaria hidrlisis cida lo que teimos es una fraccin del ADN
Tie especficamente el ADN de una forma proporcional a la existencia del
mismo.
Los resultados de la tincin no son siempre iguales, ya que dependen de los
reactivos utilizados para la oxidacin del ADN, variando el tiempo de actuacin
de los mismos en funcin de su concentracin y temperatura en la que discurre
el proceso.
No tie todo el ADN
Variaciones individuales en cada laboratorio por lo que los resultados deben
admitir obligatoriamente un amplio grado de libertad
T I N C I N D E E S P O RA S

Las esporas se observan de la manera ms simple como cuerpos refrigerantes

intracelulares en suspensiones celulares no teidas o como reas incoloras en
clulas teidas por mtodos convencionales. La pared de la espora es
relativamente impermeable, pero puede lograrse que el colorante penetre la
espora mediante el calentamiento de la preparacin. La misma
impermeabilidad que sirve para evitar la decoloracin de la espora despus de
un tratamiento con alcoholes suficiente para decolorar clulas vegetales. Ms
tarde puede aplicarse un segundo colorante. Las esporas a menudo se tien
con verde de malaquita o carbolfucsina.