Biología Molecular

BIOLOGÍA MOLECULAR
UNIVERSIDAD CEU SAN PABLO
MEDICINA
2019/20
Alejandra González González

Biología Molecular 2019/20 ESTRUCTURA Y METABOLISMO DE ÁCIDOS NUCLÉICOS Alejandra González González
1. ESTRUTURA Y METABOLISMO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Transcripción: paso de ADN a ARN. Traducción: paso de ARNm a aa. Retrotranscripción: de ARN a ADN.
Ácidos Nucleicos
Los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos. Los nucleótidos se forman de un nucleósido y un grupo
fosfato. El nucleósido se compone de un azúcar y una base nitrogenada. La pentosa es desoxirribosa si es ADN
y ribosa si es ARN. La ausencia del grupo hidroxilo en el C2 determina si es ADN o ARN. El grupo fosfato tiene
carácter acido, el azúcar tiene carácter neutro y la base tiene un carácter neutro. Los ácidos nucleicos tienen
carácter ácido.
Las 5 bases nitrogenadas más importantes son A, G, C, T, U. Pueden clasificarse en dos grupos dependiendo
del anillo heterocíclico aromático.
Purinas: A y G. Doble anillo.

Pirimidinas: C, U y T. Anillo único. La diferencia entre el U y T es que T tiene un grupo metilo. Evolutivamente
el ARN transmitía la información genética, al agregarle un grupo metilo se formó la timina para el ADN. Existen
procesos en el organismo que intercambian T por U en el ADN pero también existen mecanismos para
reconocer estos cambios y arreglarlos.
Las bases nitrogenadas son hidrófobas y existen dipolos. Pueden establecerse enlaces de H.
Las bases deben unirse al azúcar mediante el enlace N-glicosídico. En las purinas es un enlace 1-9, mientras
que en las pirimidinas es 1-1 (C del azúcar – N de la base). Formamos nucleósidos. El nucleósido lo uniremos
al grupo P mediante un enlace fosfoéster que sucede en el grupo hidroxilo.
Hay que saber diferenciar el tipo de azúcar en función de si está o no el grupo hidroxilo, diferenciar un
nucleósido de un nucleótido y saber diferenciar las bases unas de otras.
1

Para
unir
los
monómeros se generan enlaces fosfodiéster. En el extremo 5´tenemos un P libre mientras que al final de la
cadena en 3´ hay un grupo hidroxilo libre (siempre dirección 5´-3´). La dirección es 5’-3’, pero el enlace es
entre el grupo hidroxilo del extremo 3’ del nucleótido con el fosfato del extremo 5’ del siguiente nucleótido.
La composición de los ácidos nucleicos hace que tengan las siguientes características:
- Tiene carácter hidrófilo de la cadena polinucleotítica, puede establecer enlaces de H con el agua
mediante los compuestos polares (P y –OH de las ribosas), al contrario que las bases nitrogenadas, que
permanecen mirando al interior.
- Carácter acido y carga negativa. A pH fisiológico el ADN tiene carga negativa, que es fundamental ya
que permitirá que establezca interacciones iónicas son residuos con carga positiva como aa como la
Lys y Arg que se encuentran en las histonas, que son fundamentales para el empaquetamiento de
ADN.
- Rigidez. Los enlaces fosfodiéster no forman un gran ángulo, por lo que la molecula es relativamente
rígida, casi no tiene índice de rotación. Esto tiene como consecuencia la viscosidad.
- Absorción de luz UV. El carácter aromático de los anillos de las bases absorbe luz uv hasta 260 nm. A
nivel experimental es la base que nos ayuda a determinar la concentración de ADN en una solución,
ya que es proporcional a la absorbancia. 280nm es el pico de absorción que tiene las proteínas debido
a la aromaticidad de algunos aa.
- Químicamente estables. El ADN es muy estable. Si añadimos un ácido fuerte podemos degradarlo. Si
el ácido es débil se rompería principalmente el enlace glicosídico de las purinas, que son enlaces más
débiles. En medio básico el ARN se romperá, el ADN no. El ADN es una doble hélice, las bases
establecen uniones débiles unas con otras. A pH básicos estos enlaces de H pueden romperse. La doble
hélice se puede desnaturalizar sin necesidad de romper el polímero. A pH básico se romperían los
enlaces fosfodiéster del ARN.
- Viscosidad. Se refiere a la doble hélice. Es consecuencia de la rigidez. Su longitud en relación con su
diámetro le aportan la viscosidad.
ADN
Contiene la información genética. La célula debe tener una biosíntesis ordenada de los componentes de la
célula. La molécula de ADN define la individualidad de un organismo. El azúcar es la desoxirribosa. Las bases
son ACTG. Su tamaño es de 6.4· 10^9 pares de bases. Se encuentra en el núcleo pero tambien en mitocondria
y cloroplastos. Es una molécula bicatenaria y forma una doble hélice dextrógira (gira a la dcha en una
conformación B del ADN).
Chargaff mediante técnicas de cromatografía en papel determino el contenido de las cadenas de ADN. El
contenido de A=T y el de C=G. Tambien demostró otras relaciones: C+T/A+G= 1 y A+C/T+G=1 y A+T/G+C no es
1. Esto solo se cumple para una molécula bicatenaria, no en el ARN monocatenario. También determino el
carácter hidrofílico e hidrofóbico de los componentes de los nucleótidos. Wilkins y Rosalind Franklin
demostraron que el ADN era una doble hélice. Watson y Crick establecieron gracias a los estudios anteriores
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la conformación B del ADN. A través de estos experimentos se determinó la estructura helicoidal con doble
periodicidad a lo largo del eje de 0,34 (distancia entre bases) y 3,4 nm (paso de hélice) del ADN.
Completar propiedades, estructura y modelos conformacionales.
Niveles de organización del ADN de orden superior

La condensación del ADN permite que el ADN quepa en el núcleo. Para ver los niveles de empaquetamiento
debemos comprender dos conceptos: 1. El superenrrollamiento es el enrollamiento o giro sobre si misma de
la doble hélice de ADN. Puede generar tensiones que se liberan en procesos como la replicación. La acción de
las topoisomerasas permite liberar tensión debido al superenrrollamiento. 2.El empaquetamiento es el
plegamiento del ADN a través de la interacción con proteínas. Sucede gracias a la interacción de ADN y
proteínas, principalmente histonas. La atracción electrostática la tiene la carga negativa del ADN con la carga
positiva que tienen las histonas. Tambien intervienen proteínas no histónicas como las HMG (high motility
group). La cromatina es la asociación de ADN con proteínas.
Para replicar el ADN la eucromatina debe descondensarse y el ADN debe estar en forma B. El proceso contrario
sucede en fase G2, antes de entrar en mitosis para formar los cromosomas y dividir el material genético. El
cromosoma es el grado de condensación mayor de ADN. Los cromosomas solo son visibles en el momento de
la división. La cromatina en la célula se encuentra en forma de eucromatina.
Nivel 1 de empaquetamiento: se forma una fibra de 10 nm con un grado de condensación 6 veces mayor que
el ADN en forma totalmente desplegada. Hace falta plegar la doble hélice. Se forman estructuras llamadas
nucleosomas, formado por histonas + 200 pb. El polímero de nucleosomas se conoce como collar de perlas.
En el nucleosoma hay un corazón o core llamado octámero de histonas. Es una asociación de 8 histonas: 2
H2A, 2 H2B, 2 H3, 2 H4. La disposición del octámero de histonas permite que 147 pb se enrollen a su alrededor.
El ADN continua y se asocia a H1 hasta llegar al octámero de histonas continuo. El ADN que va de un octámero
a otro se denomina ADN espaciador y se considera parte del nucleosoma. Nucleosoma: octámero de histonas,
H1, ADN enrollado y ADN espaciador.
Nivel 2 de empaquetamiento: tiene lugar el superenrrollamiento. El ratio de empaquetado es de 40 veces. 6

nucleosomas por vueltas manteniendo un eje centrar donde se alienarán H1. Se forma el solenoide o fibra de
30nm. Se forma una fibra de 30 nm.
Nivel 3 de empaquetamiento: se forma la eucromatina, es la forma en la que se suele encontrar el ADN en el

núcleo. Supone un nivel de empaquetamiento 680 veces mayor. Se forma por el superenrrollamiento del
solenoide sobre un esqueleto de proteínas no histónicas como la HMG. Es un estado de condensación en el
que se da la transcripción. Cada asa o bucle es una unidad de transcripción. Se forma una fibra de 300 nm.
La eucromatina puede continuar condensándose formando heterocromatina, que es transcripcionalmente

inactiva. La heterocromatina se sigue condensando a un cromosoma, que constituye el nivel 4 de
empaquetamiento y solo sucede con la división celular. El ratio de empaquetamiento es de 50000 veces. Tiene
un diámetro de 1 micra. La heterocromatina es transcripcionalmente inactiva.
ADN Mitocondrial
En la mitocondria encontramos un cromosoma anclado a MMI. Es ADN circular bicatenario. Puede haber hasta
10 copias de este cromosoma en una mitocondria. Todas las mitocondrias tienen el mismo ADN. Su ADN es no
repetitivo y codificante (93%). Hay 37 genes (2 rARN y 22 tARN), el resto serán proteínas que participan en
la respiración celular.
RNA
Es una molécula intermedia entre ADN y proteínas. Existe ARN de transmisión de la información génica como
mARN y tARN. Otros son de soporte estructural de orgánulos como el rARN. Otro tiene función de regulación
como el miARN y los ribointerruptores en bacterias. Otros tienen actividad enzimática como las ribozimas.
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Están formados por ribosa. Las bases son AGUC. Su tamaño es variable y menor que el del ADN. Es una
molecula monocatenaria y lineal con posible apareamiento intracatenario en una doble hélice en C3´acabando
en A. Tiene diferentes funciones y organización 3D. Distintas localizaciones. No cumple las leyes de Chargaff.
Tipos
- mARN: copia de ADN que sirve de molde para la síntesis proteica. Cadena extendida (asociación
proteínas). Sufre un proceso de maduración en el que se añade una caperuza, cadena poliA y splicing.
- tARN: estructura de hoja de trébol donde diferenciamos diferentes brazos. Tiene papel adaptador
activa, transporta y sitúa los aa. Encontramos bases no habituales. Ribotimidina y pseudouridina en
el brazo I y dihidrouridina en el brazo III; brazo II es el brazo acptor donde se encuentra el anticodón.
- rARN: función estructural en los ribosomas. Tienen una subunidad mayor y otra menor. La mayor esta
compuesta (60s) por 5 rARN distintos: 5s, 5.8s, 28s. La subunidad pequeña (40s) esta formado por
rARN 18s. En el proceso de traducción se separan para que interaccionen correctamente.
- miARN
- siARN (ARN pequeño de interferencia o ARN de silenciamiento)
- snARN (ARN pequeño nuclear)
- scARN (ARN citoplasmático pequeño)
- Ribointerruptores
- Ribozimas
- ARN orgánulos (mitocondria y cloroplastos)
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2. ORGANIZACIÓN Y ELEMENTOS DEL GENOMA
EUCARIÓTICO
Palíndromo: secuencias que se leen igual de un lado que del otro. Una cadena leída de dcha a izq era igual que
la otra leída de izq a dcha.
El genoma eucariota es nuclear con 23 cromosomas y genoma mitocondrial con hasta 10 copias del mismo
cromosoma. Un gen es el conjunto de regiones de ADN, estructurales y reguladoras, necesarias para codificar
y expresar un producto génico, sea éste un ARN maduro de cualquier tipo o una proteína funcional. Hay
genes que tras la transcripción se quedan como ARNm maduro, mientras que otros pasan a ARNm y después
a proteína. antes de formar el ARN tanto mensajero como transferente y ribosómico, se forman transcritos
primarios, que son los preARN/hnARN. El ADN codificante nuclear es un porcentaje muy pequeño comparado
con el ADN codificante. El ADN mitocondrial es mayoritariamente codificante.
ADN de copia única: Mayor parte del genoma (60%) en organismo superiores. Completar con esquema de la
presentación.
ADN repetitivo
Agrupado: unidades de repetición en una región concreta de un cromosoma.
Disperso: unidades de repetición dispersas en distintos cromosomas.
Codificante
Agrupado
Familias génicas clásicas: conjunto de genes repetidos en tándem que codifican un mismo arn o proteina. Alto
grado de homología (relación evolutiva y funcional). Son copias en tándem y se sintetizan de forma rápida y
en mucha cantidad.
Ejemplo Familia Clásica de las Histonas: son 5 unidades de transcripción independientes (para las 5 histonas).
Se transcriben de forma independiente.
Ejemplo Familia Clásica de rARN: una sola unidad de transcripción que se transcribe por completo (se forma
pre ARNr grande) y se procesa en diferentes rARN.
Familias multigénicas de genes agrupados: conjunto de secuencias, relacionadas evolutivamente, que

presentan cierta diversidad y dan lugar a productos génicos distintos. Solo expresan algunas de las secuencias.
Tipos:
- Con homología de secuencia: proteinas con regiones de secuencia y estructura comunes (dominios).
- Con escasa homología de secuencia: proteinas con estructuras comunes (motivos)
- Sin homología de secuencia (superfamilias): proteinas con similitud estructural y relación funcional.
Tipos de secuencias
- Copias o variantes de un gen (distintos tejidos, distintas afinidades por ligando, distintos estadíos
embrionarios, etc).
- Pseudogenes (copia inactiva): vestigio evolutivo
- Genes truncados (copia incompleta): vestigio evolutivo
- Fragmentos de genes (perdida de los extremos del gen): vestigio evolutivo
Ejemplo Superfamilia de Globinas alfa y beta.
Disperso
Familias multigénicas dispersas: ADN repetitivo codificante. Las unidades de repetición se encuentran
dispersas en diferentes cromosomas.
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Ejemplo familia de la Aldolasa: tiene 3 variantes de genes, 2 pseudogenes y están repartidos en 5 cromosomas.
Cada una de las variantes se expresa en un momento distinto del desarrollo o en distintos tejidos. A: embrión
y adulto en músculo, B: hígado adulto, C: cerebro adulto.
No codificante
Altamente repetitivo y agrupado
ADN Satélite: unidad de repetición 2-50 pb en tándem. El numero de repeticiones es de miles a un millón de
veces. Se encuentran en regiones heterocromáticas (centrómeros y telomeros). Tiene menos contenido de
C+G. En las regiones teloméricas, que miden el envejecimiento de la célula, las repeticiones en tándem van
desapareciendo en cada división. Al ser repeticiones no afectan a la funcionalidad hasta que llegan a un punto
en el que el acortamiento de estas regiones es demasiado y la célula muere.
Moderadamente repetitivo no codificante disperso

Copas en tándem: se repiten entre 100 y 10.000 veces. Hay una gran variabilidad entre individuos. Se utiliza
en medicina forense, pruebas de paternidad o en el diagnóstico de enfermedades.
- Minisatélites: ricos en C+G
- Microsatélites como las secuencias STR (short tándem repeats), para criminalística.
Copias dispersas o Elementos nucleares dispersos: ADN repetitivo no codificante y disperso (repartido por
todo el genoma. Una sola secuencia. En función de la longitud diferenciamos dos familias:
- SINE (cortos) como la secuencia Alu, que tiene 300pb y es no codificante. Es la más abundante y
estudiada. Ricos en C+G. Se suelen repetir hasta 20 veces exceptos Alu, que se repite muchas más.
- LINE (largos): hasta 50.000 repeticiones. Kpn es una de las más conocidas.
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3. REPLICACIÓN DEL ADN
La replicación es el proceso mediante el cual se originan dos moléculas de ADN hijas idénticas a partir de una
molecula de DNA progenitora o parental. Sirve para el paso de información genética de célula a célula y de
individuo a individuo. Se relaciona con procesos de mutaciones, reparaciones y recombinaciones. El ADN
nuclear se replica durante la fase S de la interfase. La descondensación del ADN es muy importante para la
replicación.
La replicación es semiconservativa, cada hebra progenitora sirve de molde para la síntesis de su hebra
complementaria. La molecula hija está formada por la hebra progenitora y la hebra nueva. Había 3 hipótesis
hasta que se confirmó que era semiconservativa: conservadora, dispersante y semiconservativa. Se descubrió
que era semiconservativa por Meselson y Stahl (video), que cultivaron bacterias con N15, obtenían una banda
que correspondia al N15. La siguiente generación que ocurria cuando quitaban el medio y se introducía el N14
obtenían una única banda más arriba. Había un hibrido con N15 y N14. Esto tacha la hipótesis conservadora.
En una 2 generación eliminaron la dispersante, ya que habi ADN hibrido y ADN solo con N14.
Tiene un origen multifocal. Hay varios orígenes de replicación en las células eucariotas. Aparecen en puntos
concretos del genoma. Permite la replicación rápida del genoma eucariota, que suele ser grande. El inicio es
no autoiniciador, esto se refiere a que la ADN polimerasa no puede copiar sin un cebador, necesitamos una
secuencia (secuencia corta de ARN) para que la polimerasa continúe la hebra. El cebador aporta la sobre hebra
y el extremo 3’OH libre para que la ADN polimerasa ponga los nucleótidos.
La síntesis es simultanea, secuencial y bidireccional. Las dos hebras se sintetizan simultáneamente y

nucleótidos se sitúan de forma secuencial. En la horquilla de replicación la síntesis es bidireccional. La
replicación es semidiscontinua, se refiere a que una hebra se replica por la ADN polimerasa de forma continua,
pero la otra no (hebra retardada), ya que la ADN polimerasa solo puede sintetizar la cadena en sentido 5’ 3’.
La hebra retardada se compone de fragmentos de Okazaki.
Para replicar el ADN necesitamos dATP, dTTP, dCTP, dTGP (nucleótidos), Mg2+ como cofactor de las
polimerasas, un molde o plantilla que es la hebra de ADN, un cebador formado por oligonucleótidos de ARN,
enzimas ADN polimerasa, proteinas de unión de cadena simple o SSB (que mantienen separadas las dos
cadenas de ADN) y proteinas iniciadoras como las helicasas topoisomerasas, ligasas, nucleasas, abrazaderas,
etc.
Polimerasas
Son las enzimas que llevan a cabo la síntesis de ácidos nucleicos. Todas comparte el mecanismo de acción y la
dirección de síntesis. Las diferencias son el molde, las moléculas que sintetizan, el uso o no de cebador, las
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actividades asociadas, la velocidad de síntesis o procesividad (numero de nucleótidos que es capaz de
incorporar a la hebra nueva sin desacoplarse del complejo de replicación) y la tasa de error.
DNA Polimerasas en Eucariotas
- Alfa: actividad primasa y polimerasa
- Delta y épsilon: actividad polimerasa y exonucleasa

- Beta: polimerasa reparación
- Gamma: polimerasa en mitocondria
Mecanismo de acción y dirección de síntesis (Pregunta Desarrollo)

1. Formación del enlace fosfoéster: Las polimerasas comparten el mecanismo de acción y síntesis. La
polimerasa cataliza un enlace fosfoéster entre el OH libre del extremo 3’ de la cadena que se está sintetizando
o el OH extremo 3’ del cebador con el P en posición alfa del desoxinucleótido di fosfato. Hay un ataque
nucleofílico. El enlace fosfoéster provoca la ruptura del nucleótido di fosfato y se genera PPi (pirofosfato).
2. Ruptura del PPi por la pirofosfatasa y liberar 2Pi.
3. Avance de la polimerasa: La reacción anterior libera la energía necesaria para que la polimerasa avance y
elongue la cadena mediante otro enlace fosfoéster.
El cofactor de la ADN Polimerasa es el Mg2+. La dirección de síntesis es 5’ 3’.
Estructura de la ADN Polimerasa: Tiene forma de mano. Son muy grandes.
Actividades asociadas
Actividad 3’ exonucleasa – Exonucleasa 3’-5’ – Actividad Colectora de Pruebas: eliminación de un nucleótido
mal emparejado, eliminación en dirección 3’-5’, centro activo diferente al centro de polimerización, corrección
de errores.
Actividad 5’ Exonucleasa – Exonucleasa 5’-3’ – Actividad de Reparación: eliminación secuancial de
nucleótidos, eliminación dirección 5’-3’, centro activo diferente al de la polimerización, eliminación de
cebadores, corrección de errores y daños del DNA. Solo aparece en procariotas como la ADN polimerasa I o
reparadora.
Completar con los tipos de polimerasas que realizan cada acción.
Velocidad, Procesividad y Tasa de Error

La velocidad de copia es de 1000 nucleótidos/segundo en múltiples orígenes de replicación. La procesividad
es el numero de nucleótidos incorporados antes de que se separe la ADN polimerasa del molde. Depende de
la polimerasa y de la presencia de abrazaderas. La tasa de error es de 1 error por 10^4-10^5. Si la actividad de
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la polimerasa es exonucleasa 3’ la tasa de error se reduce entre 100 y mil veces (tasa de 1 error por cada 10^2-
10^3 nucleótidos).
ADN Polimerasa alfa: actividad polimerasa 5’-3’. Actividad asociada de primasa para sintetizar el cebador
(ARN).
ADN Polimerasa delta y épsilon: actividad polimerasa 5’-3’. Actividad asociada de corrección exonucleasa 3’-
5’.
ADN Polimerasa beta: exclusivamente reparación. NO interviene en la replicación.
ADN Polimerasa gamma: se encuentra en mitocondrias con actividad polimerasa 5’-3’ y actividad asociada de
exonucleasa 3’-5’.
Además de las polimerasas intervienen en la replicación proteinas iniciadoras, helicasas (apertura de las
hebras), proteinas de replicación a o SSB (mantienen las hebras abiertas), topoisomerasas (alivian tensión de
torsión de los superenrrollamientos), abrazaderas (PCNA asociada a ADN polimerasa delta y épsilon, nucleasas
(eliminan cebadores activada exonucleasas 5’-3’) y ligasas (que unen fragmentos de Okazaki). El replisoma es
el conjunto de proteinas implicadas en la replicación.
APUNTES 2º BACH.
Iniciación (Pregunta Desarrollo)

Apertura de la horquilla de replicación. El replicador es la región del ADN con dos tipos de secuencias: una rica
en A y T y otras que serán reconocidas por proteinas iniciadoras. Estas dos secuencias provocan la apertura
de la doble hélice ya que se forman 2 puentes de H al contrario que entre la C y G (3 puentes de H). Los orígenes
de la replicación son zonas muy especificas. Debemos encontrar ambos tipos de secuencias. Se ha estudiado
que son secuencias palindrómicas (cruciforme) que provocan una flexión de la cadena que ayuda a la apertura
de la burbuja.
Reclutamiento del replisoma.
Elongación
Síntesis del cebador y de las hebras.
A medida que se sintetizan las hebras avanza el replisoma. A medida que avance el replisoma las hebras deben
desenrollarse y enrollarse. Las topoisomerasas liberan la tensión para facilitar en enrollamiento y
desenrollamiento:
- Topoisomerasa I: cortan una de las hebras para liberar la tensión y la vuelve a pegar.
- Topoisomerasa II: corta dos hebras y las vuelve a pegar.
El cebador está formado por nucleótidos de ARN. Lo sintetiza la ADN Polimerasa alfa-primasa. No confundir
con la PCR donde el cebador es de nucleótidos de ADN. El cebador permite que la ADN Polimerasa tenga un
hibrido donde anclarse con un extremos 3’ OH libre.
En la hebra continua el avance de la horquilla de replicación y de la síntesis es el mismo mientras que en la

hebra retardada es al revés. En la hebra retardada hay que incorporar cebadores por la ADN polimerasa alfa
en determinados puntos. En la hebra líder polimerasa épsilon en la retardada delta. En la delta las abrazaderas
son menos importantes. En la hebra líder las abrazaderas ayudan en la procesividad. La hebra retardada se
forma un bucleo para unir los fragmentos de okazaqui. Fen 1 es la nucleasa que elimina el cebador de los
framentos de Okazaki. Los frangmentos de Okazaqui incluyen al cebador y tiene de entre mil y dos mil
nucleótidos. Los fragmentos de Okazaki deben madurar. Tienen el cebador de arn que debemos eliminar. Para
ello actúan las nucleasas que tienen actividad exonucleasa 5’ o 5’-3’. Desde 5 a 3’ se elimina la secuencia del
cebador dejando un espacio libre que debe rellenarse por la ADN polimerasa delta y epsisoln en funcion de la
hebra comletando añadiendo ADN. La mayor parte de los cebadores están en la hebra retardada per tambien
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hay un cebador en la hebra líder. La ADN polimersa coia el ultimo nuckleotido no puede realizar un enlace
fosfodiéster entre el ultimo nucleótido que ha colocado y el que ya estab. Para eso actuann las ligasas que
unen el extremo 3’’ del nuevo nucleótido que ya estaba con su extremo 5’. Formación del ultimo enlace
fosfodiéster entre el grupo Oh del extremo 3’ y del fosfato del extremo 5’.
Terminación
Se alcanzan dos burbujas de replicación. Podemos encontrar secuencias terminadoras. Se eliminan y se
sustituyen los cebadores. Se unen los fragmentos que queden de los procesos anteriores mediante la ligasa.
Supone el alcance de dos orquillas y burbujas diferentes. Cuando se encuentra un replicon con otro hay que
unir el ADN completamente. La solución de relleno es igual que los fragmentos de Okazaki podrían actuar
nucleasas 5’-3’, ADN polimerasa delta y épsilon y ligasas.
El numero de replicones por cromosoma y los mecanismos de control y coordinación del proceso son
desconocidos. Si se conoce la replicación de los terlomeros, que va incluido en la terminación.
Replicación de los Telómeros

Los telomeros son el final del cromosoma. Su replicación es especial. Los telomeros se componen por
secuencias de ADN repetitivo no codificante agrupadas (ADN satélite). La secuencia repetida es una secuencia
de unión de las proteinas ligantes del telomero. La funcion de la secuencia unida a las proteinas (froman la
caperuza protectora) estabilixzan y mantienen el cromosoma. Protege los telomeros de la actividad de otras
enzimas de recombinaciones, tc. Además esto hace que la célula diferencie que ese es el final del cromosoma.
Evita la unión de unos cromosomas con otros y aumente la probablildad de recominacion): diferencuas entre
el extremo natural de la molecula de ADN y un extremoproducido por rotura de la molecula. Esto permite que
entren en funcionamiento maquinarias de replicación
La ribonucleoproteina tiene dentro una seceuncia de RN. A esta secuencia se une la telomerasa. COMPLETAR
URGENTE LO DE LOS TELOMEROS Y LA TELOMERASA ETC.
Replicación del ADN Mitocondrial
Mecanismos de Reparación
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4. TRANSCRIPCIÓN
No confundir las polimerasas que dice en el audio.
Tipos de RNA Polimerasas
RNA Polimerasa I: sintetiza precursores de algunos ARN ribosómicos.
RNA Polimerasa III: sintetiza precursores de rRNA, tRNA y sRNA.
Las RNA Polimerasas no sintetizan RNA maduro, siempre precursores que luego sufren un proceso de
maduración.
RNA Polimerasa II: precursor de mRNA (hnRNA) y precursor de sRNA.
Requerimientos de RNA Polimerasa II

10-15 subunidades para formar proteína de 600 kDa. Hay 3 subunidades comunes. Entre ellas, la subunidad
mayor o cola CTD o dominio C-terminal. Se encuentra cerca del punto de salida del RNA naciente. Es una
secuencia repetida heptapeptídica que en seres humanos se repite hasta 50 veces: Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-
Ser. Las Ser del medio pueden ser fosforiladas y la Thr tambien puede fosforilarse. Esta fosforilación es
reversible que está involucrada en el proceso de inciacion y la elongación de la transcripción. Por otro lado, la
cola CTD es un punto de unión para factores de transcripción.
La RNA Pol II tiene una alta procesividad. Tiene tasa de error y actividad correctora.
Proceso Global de Transcripción

El gen tiene una región reguladora (donde se encuentran los promotores) y una estructural, donde se
encuentra lo que nos interesa transcribir (la secuencia codificante). En la región promotora comienza la
apertura de la doble hélice y donde comienza la transcripción al exponerse el primer nucleótido expuesto
como molde. Al final hay una serie de secuencias terminadoras involucradas en la parada de la RNA Pol II y el
final de la transcripción.
Iniciación: formación de la burbuja de transcripción y complejo de iniciación. Reconocimiento del promotor
por uniones de factores de transcripción. Unión de la RNA Pol II. Apertura de la hebra. Unión de los dos
primeros nucleótidos y síntesis de hasta 12 nucleótidos.
Elongación: fosforilación del CTD (justo antes de la elongación) y liberación del promotor. Movimiento de la
RNA Pol II.
Terminación: aparición de las secuencias de terminación. Parada de la RNA Pol II y liberación de la RNA Pol II y
el hnRNA.
Iniciación
Se forma el complejo de iniciación y la burbuja de iniciación. Para que se forme el complejo de iniciación hay
dos modelo: el modelo secuencial y el modelo holoenzima.
El modelo secuencial comienza con el reconocimiento de la caja TATA mediante la proteína TBP. Esta unión
hace que dos factores de transcripción diferentes se unan a la región promotora. Son TFIID y TFIIB. Estos dos
factores se asocian con la región promotora del ADN y con TBP (que se une de forma especifica a TATA).
Posteriormente se recluta la RNA Pol II, que se une al ADN y a los factores de transcripción. Para formar el
complejo de iniciación se unen tambien TFIIF y TFIIH que tienen actividad helicasa y se encargan de abrir las
hebras. Tambien está implicado TFIIE, que mantienen la apertura de la doble hélice. TFII: Transcription Factor
of Pol II.
El modelo holoenzima dice que todo el complejo de iniciación está organizado y unido y se desplaza y se une
a la región promotora todo a la vez y de golpe.
A continuación, se forma el primer enlace fosfoéster. 2 NTP libres. Emparejamiento al ADN molde y formación
del primer enlace en las posiciones 1 y 2. Sintetiza hasta 12 nucleótidos. Se forma un híbrido DNA-RNA de 12
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nucleótidos. En la fase de iniciación la RNA Pol II participa en su forma no fosforilada (CTD no fosforilado).
Como no está fosforilado, la RNA Pol II no puede desplazarse.
Elongación
Se fosforila CTD y esto permitirá el desplazamiento de RNA Pol II. Se une TFIIH que tiene actividad quinasa
para fosforilar al dominio CTD al igual que P-TEFb. Esto provoca la liberación del promotor. Ya no está unido a
los FT que formaban el complejo de iniciación.
Mientras avanza la RNA Pol II la burbuja de transcripción debe avanzar. Para ello por delante de este avance
se desenrolle el ADN. Están involucradas las topoisomerasas. Tambien debe haber un enrollamiento por detrás
de la burbuja. Dentro de la burbuja hay otros factores de elongación que mantienen el dominio CTD fosforilado
(TFIIH, P-TEFb). Otros factores que participan por su actividad enzimática en la formación de enlaces son ELL,
CSB y SIII y otros que participan en aumentar la procesividad de RNA Pol II son TFIIS y DSIF.
Terminación
La RNA Pol II debe para. Lo hace por la presencia de secuencias en la región terminadora que reconocen las
proteínas terminadoras. Esto causa la desestabilización del híbrido DNA-RNA. Durante la elongación, el
extremo 5’ del RNA sintetizado se sale se la burbuja, por lo que el hibrido no está formado por todo el RNA.
Hay proteinas que se unen a esta RNA naciente y hace que se suelte el híbrido y por tanto la RNA Pol II y
termina la transcripción. Son las proteína parecida a rho (p), que se une al RNA naciente desestabilizando al
hibrido y terminando la transcripción.
La molecula que acaba de sintetizarse en un transcrito primario (en el caso del ARNm es el hnRNA) que debe
madurar.
Procesamiento de RNA: Maduración

Los precursores de RNA necesitan madurar. La maduración consiste en una serie de modificaciones como:
- Modificación covalente de nucleósidos
- Eliminación y/o adicion de nucleótidos en los extremos
- División de la molecula en varios fragmentos
- Eliminación de los intrones. No todos los genes tienen intrones (el gen de las histonas no tiene
intrones).
Estas modificaciones dan estabilidad a la molecula, es decir las protege frente a las nucleasas. También permite
el plegamiento tridimensional en el tRNA y rRNA. Por último, mejora la funcionalidad para la traducción.
Maduración del Pre-mRNA o hnRNA

Las modificaciones principales son:
- Modificación del extremo 5’

Se forma la caperuza de GTP. Es una modificación covalente. Tiene lugar al principio de la transcripción, antes
del nucleótido 30. Participa CTD. Es una posible señal para la transición de la iniciación a la elongación. Es un
enlace trifosfato atípico 5’-5’ (orientación 3’-5’ de la guanosina). Protege a la molecula frente a las 5’-3’
exonucleasas. Es una señal para modificaciones posteriores. La caperuza es un punto de unión al ribosoma y
por eso participa en la traducción, ya que une el ARNm a la subunidad pequeña del ribosoma.
En la caperuza y en los nucleótidos que la suceden hay otra modificación covalente: la metilación.
1. La RNA Trifosfatasa elimina 2 grupos fosfato de la molécula de GTP.

2. Adicion de GTP al extremo 5’ terminal del RNA (guanililación o actividad guanilil transferasa). Cataliza la
reacción entre el fosfato alfa del GTP y el fosfato beta de la cadena de ARN.
3. Metilación por la metilación transferasa. Añadimos un grupo metilo en la posición N7 de la guanosina. Se
ha formado la caperuza 0. Utiliza una Coenzima donadora llamada S-adenosin-L-metionina (SAM).
Distinguimos 2 tipos de caperuza:
2


Caperuza 0: se sitúa en la posición N7 de la guanosina. Se forma mRNA-guanina-N7-metiltransferasa.
Caperuza 1: no solo se metila el N7 del GTP, sino que tambien se metila el OH en posición 2’.
Caperuza 2: se metilan tanto el GTP en N7 y los OH de los puntos 2’ de los dos nucleótidos que siguen a la
caperuza.
Las caperuzas más frecuentes en humanos son la 1 y la 2.
- Modificación del extremo 3’

Es la poliadenilación del extremo 3’. Consiste en unir numerosas molécula de A al final del extremo 3’ de RNA.
Se añaden entre 40 y 250 A. La cola poli A se reconoce por las proteinas de unión de colas poli A que le dan
estabilidad a la molécula. Evitan la degradación de exonucleasas 3’. Esta modificación junto con la caperuza
está relacionado con el transporte del ARNm al citoplasma. Al estabilizar la molécula aumenta su vida media.
1. Escisión del pre-RNA: hay una secuencia consenso que se encuentra al final de RNA. Esta secuencia la
reconocen proteinas como la endonucleasa, que rompe la molécula de RNA que se está sintetizando unos 10
a 30 nucleótidos después de la secuencia consenso.
2. Poliadenilación del extremo 3’: la enzima poliA polimerasa se une al extremo 3’ y utilizando ATP cataliza
la formación de la cola poli A. Esta polimerasa no necesita cebador.
3. Unión a proteinas de estabilización.
- Splicing: eliminación de intrones y empalme de exones

Rodeando los intrones encontramos 2 centros de ayustes (3’ y 5’). Tambien encontramos dentro de los
intrones encontramos centros de ramificaciones. Cada una se caracteriza por una secuencia consenso distinta.
Centro de ayuste 5’: GU; Centro de ayuste 3’: AG y Centro de ramificación: A.
1. Formación de Ayustosoma: asociación de ribonucleoproteinas nucleares pequeñas (snRNP) y mRNA. Estas

proteinas son asociaciones de RNA pequeño y polipéptidos. Los intrones son muy grandes. Los centros de
ayuste deben estar cerca, por lo que se forma un plegamiento o flexión de la cadena gracias a las snRNP para
acercar los centros de ayuste.
2. Reacciones de transesterificación: en primer lugar, un ataque nucleofílico del 2’OH del adenilato del CR al
extremo 5’ del intrón (CA5’). Queda unido el intrón por el enlace fosfodiéster atípico 5’-2’ y se libera el exón
1. En segundo lugar, el extremo 3’OH reacciona con el centro de ayuste en 3’ y se unen los exones y se libera
el intrón (forma de lazo). No se consume ATP. La energía que se libera en una se gasta en la otra.
El splicing alternativo es una variante del splicing. En vez de añadir todos los exones, uno se pierde formando
una variante corta del ARNm. Se eliminan a la vez dos intrones y el exón que está en el medio.
El gen de la troponina T mediante splicing alternativo puede dar lugar a la isoforma alfa (solo en ML) y la beta
en todo el organismo.
3


5. TRADUCCIÓN
Resumen: 32 RNAs transferentes reconoces 61 codones porque este primer nucleótido, que se une con el 3
del codón, puede ser una unión no habitual y puede darse entre inosina con AUG o UG/GU.
Iniciación
Se forma un complejo de pre iniciación. Lo forma la subunidad pequeña del ribosoma, el RNAt iniciador y el
RNAm junto con diferentes factores de traducción. Una vez se ha fomrado, se desplaza hasta la secuencia
Kozak. Por ultimo, se froma el complejo ternario de iniciación 80s, formado por el ribosoma, el RNAt iniciador
y el RNAm.
1. Formación del complejo de pre iniciación. En primer lugar se disocia el ribosoma y se mantiene separado
por la acción de factores de traducción como eIF1, eIF2, eIF3. En segundo lugar se une la subunidad menor del
ribosoma con el RNAm. Esto ocurre gracias al factor de iniciación eIF4 que reconoce Cap (caperuza del RNAm).
Entonces, se unirá el RNAt indicador, que tiene unido Met y otro factor de iniciación: eIF2 junto con GTP que
dará la energía necesaria para este proceso. Se forma el complejo de pre iniciación formado por RNAt
iniciador, subunidad menor del ribosoma, RNAm y factores iniciadores.
2. Desplazamiento hasta el codón AUG (Kozak). Se trata de una secuencia especial y concreta.
3. Formación del complejo ternario de iniciación 80s. Se une la subunidad mayor del ribosoma. Se hidroliza
GTP por eIF5 y se libera energía para separar todos los factores de iniciación dejando en ese punto lo que se
conoce como complejo ternario de iniciación 80s, formado por el ribosoma, RNAt iniciador y RNAm.
En el complejo ternario de iniciación 80 distinguimos un sitio P (peptidido). A la dcha del sitio P se encuentra
el sitio A (aceptor) y a la izq del sitio P se encuentra el sitio E (exit).
Elongación
Ubicación de un nuevo RNAt en el sitio A. El RNAt debe estar previamente unido al factor eEF1A y a GTP. Una
vez se ha unido, se forma el enlace peptídico, proceso conocido como transpeptidación. El ribosoma se mueve
de manera que sitio A sitio P sitio E. Es el proceso de translocación.
1. Incorporación de RNAt nuevo. Este RNAt nuevo debe estar unido a eEF1A. Se unirá por complementariedad
de bases entre el codón y anticodón. Esto sucede si l aunion es correcta. Hay un mecanismo de corrección de
errores si en RNAt no es el correcto.
2. Enlace peptídico o transpeptidación. La peptidil transferasa une el extremo Ct de la Met con el extreno Nt
del siguiente aa. Esta ribozima se encuentra en el RNAr 28s. Dejando el RNAt iniciado sin aa en el sitio P.
3. Translocación. El ribosoma se mueve a la dcha y el sitio A queda libre y el RNAt iniciador queda en el sitio E.
El eEF2 está unido a GTP y da la energía necesaria para que el ribosoma se deslice una posición.
Terminación
Supone que el siguiente codón que se expone es un codón de terminación. Se une el factor de terminación
eRF que se une al sitio A y tambien está unido a GTP. Este factor de terminación provoca que se hidrolice el
GTP y esto a su vez provoca la disociación del péptido y del RNAm del ribosoma y del RNAt.
1


REGULACIÓN EXPRESIÓN GÉNICA
Postranscripcional
Procesamiento y Transporte de RNA

En el procesamiento debemos tener en cuenta que hay ciertas secuencias que se encuentran marcadas de
forma que por el splicing alternativo da lugar a RNAs maduros distintos.
En el transporte se seleccionan mensajeros.
Síntesis Proteica
Es un punto de control de la traducción que podemos dividir en la accesibilidad y estabilidad del RNAm y
mediante la formación del complejo de iniciación.
- Ribointerruptores
Moléculas que se unirán al RNAm. Derivan de compuestos como la rivoflavina. Cuando el RNAm está unido al
ribointerruptor FMN, se impide la traducción de dicho RNAm. Se bloquea el metabolismo de proteínas, en este
caso de la riboflavina.
- Ribointerferencia
Son RNA pequeños como miRNA que regulan la traducción. Inhiben la traducción. Un solo miRNA es capazz de
reprimir la traducción de toda una cascada de señalización. Se calcula que hay más de 500 miRNAs en
humanos. Están evolutivamente conservados. Se emplean en terapia génica. Es un mecanismo de regulación
génica muy eficaz. El mecaniso granscurre mediante una formación de un complejo de silenciamento llamado
RISC que o degradará el mensajero o bloquerá la traducción.
- Horquillas mRNA
Una horquilla es una estructura secundaria del RNA formada por palíndromos. Distinguimos dos casos:
1. Interfiriendo en la accesibilidad del RNAm se interfiere en la traducción. Veremos el efemplo de la ferritina.

El gen puede unirse a IRP de forma que se ihiba la traducción del gen de la ferritina. En presencia de Fe IRP
forma un complejo de sulfuro de Fe y no se une a la horquilla de tal forma que el gen puede transcribirse y
generar ferritina.
2. Interfiriendo en la estabilidad del RNAm. Veremos el ejemplo del receptor de transferrina. IRP se une a
multiples horquillas dándole al RNAm una mayor estabilidad, por lo que se puede reutilizazr para formar más
proteína. En ausencia de Fe la traducción es mayor y se genera más receptor de transferrina. Cuando hay Fe,
se forma un complejo de sulfuro de Fe en IRP. IRP no se une a las horquillas que están en posición 3’ UTR. La
estabilidad del RNAm es baja y se degrada rápidamente. Se traduce en menor medida que si el RNAm es
estable gracias a la estabilidad que le aporta la unión de UTR.
- Formación del Complejo de Iniciación

Para sintetizazr globinas, si no hay grupo hemo, se inhibe eIF2, por lo que no se forma el complejo de iniciación
y se bloquea la traducción. La formación del complejo de iniciación se regula afectando a algún complejo
proteico que forma el complejo de iniciación.
1

Biología Molecular 2019/20 Alejandra González González

7. TÉCNICAS DE BM APLICADAS A LA BIOMEDICINA
Técnicas Básicas y Técnicas Aplicadas al Diagnóstico
Las técnicas de BM sirven para la edición génica como la producción de organismos modificados
genéticamente, ingeniería agroalimentaria, ciencias forenses y judiciales y en medicina y diagnostico clínico de
enfermedades hereditarias o de enfermedades infecciosas.
En primer lugar debemos obtener nuestra muestra de ADN de diversas fuentes y deben tratarla. A la hora de
tratar las muestras debemos tener en cuenta factores como la temperatura (a T ambiente si la extracción es
inmediata, cada vez más baja si vamos a tardar más tiempo). Otro factor a tener en cuenta es la esterilidad
para evitar contaminaciones.
Para extraer la molécula debe suceder la lisis celular. Puede producirse mediante detergentes, soluciones
hipotónicas e incluso mediante la sonitación o llevarlas a ebullición. En estos procesos de extracción se añaden
inhibidores de nucleasas que suelen ser quelantes de cationes divalentes como el Mg2+ que es factor de las
nucleasas (EDTA) o mediante inhibidores de RNAasas (DEPC).
Debemos tener en cuenta las propiedades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos. Si actuamos en medio
alcalino el DNA se desnaturaliza y se degrada RNA por hidrolisis. Si actuamos en medio acido se insolubilizan
en ADN en fase acuosa. Permite la extracción de RNA. Mediante el ajuste de la fuerzas iónica, modificamos la
solubilidad diferencial de DNA, RNA y proteínas. Mediante alcoholes evitamos que el DNA interaccione con el
agua de forma que las moléculas de DNA se agolpen entre sí y precipiten.
También podemos utilizar DNAsas o RNAsas para separa DNA de RNA. También degradamos proteínas
mediante proteasas. La desnaturalización de proteínas mediante detergentes, urea o tiocinato de guanidino
(caótropos) nos permite separarlas del resto de moléculas.
Podemos separar DNA y RNA por cambios en la solubilidad. 1. Nos interesa el DNA: En el SN tenemos DNA y
RNA y en el precipitado el resto de componentes celulares. Incubamos la muestra con fenol cloroformo y un
medio alcalino como NaOH. El DNA se desnaturaliza y el RNA se degrada. Posteriormente añadiremos un
alcohol como el isopropanol y precipitará el DNA, que se resolubilizará posteriormente. 2. Nos interesa el RNA:
Añadiremos un medio ácido, tiocianato de guanidina y DNAsas. En la fase acuosa únicamente tendremos RNA.
Cogemos la fase acuosa e incubamos con un alcohol de forma que precipitará el RNA y se podrá resolubilizar.
La purificación de ADN por precipitación salina diferencial = mediante la fuerza iónica. Si añadimos NaCl, es
decir aumentamos la fuerza iónica, las proteinas precipitan. Posteriormente centrifugaremos y las proteínas
quedarán en el precipitado. En el SN con fuerza iónica alta encontramos el ADN y ARN que son solubles.
Añadimos agua diluyendo de forma que bajaremos la fuerza iónica. En un punto dado, el DNA precipitará,
centrifugaremos y en el SN queda el RNA. Aplicamos alcohol para que precipite el RNA y por centrifugación
tendremos un pellet de RNA. Los precipitados de RNA y DNA debemos redisolverlo con agua destilada sin
proteasas.
Si queremos hacer una purificación directa de AN utilizaremos una serie de soporte sólidos como bolitas
magnéticas, soportes derivados de sílice o membranas porosas. Utilizaremos este método cuando tengamos
poco DNA por que tengamos poco tejido o porque se impuro. Para ello, Se lisa el tejido, se une el DNA al
soporte sólido. Mediante una etapa de lavado separamos el DNA del soporte sólido. Ejemplo: En una
extracción directa de DNA utilizando bolitas magnéticas. Las bolitas las podemos tratar para que tengan una
superficie absorbente y que permita la unión al ADN. Otra opción es unir a las micro esferas magnéticas una
molécula de avidina o estreptaavidina, que provocará que se establezca una unión fuerte con la biotina. Se
une de forma indirecta el ADN a la micro esfera por la unión entre la avidina y la biotina. Si unimos la micro
esfera a una cola poli A, podemos unir el DNA por complementariedad de bases a dicho ARNm. Las micro
esferas deben ser magnéticas porque a través de un imán uniremos todas las micro esferas para que tras una
1


serie de lavados se puedan eliminar el resto de componentes del lisado celular. Lo último es separar el DNA o
RNA de las micro esferas magnéticas mediante algún tipo de reacción química.
Una vez purificado el ADN, en ocasiones debemos cuantificarlo. La cuantificación del ADN se realiza mediante
la medición de la absorbancia a 260 nm (pico de absorbancia de las bases nitrogenadas y de sus anillos
heterocíclicos). Por la Ley de Lambert-Beer podemos calcular la concentración ya que ésta es proporcional a
la absorbancia.
A = ε.d.c
Si queremos evaluar la pureza, podemos hacer una ratio entre la absorbancia a 260nm y a 280nm. Si se
encuentra entre 1,6-2,1 el ADN es puro. Las proteínas debido a aa aromáticos, absorben a 280nm.
La separación de AN se suele hacer por electroforesis. El marcaje de AN se realiza mediante agentes de tinción
intercalantes. Tras iluminarlo con luz de determinada longitud de onda podremos captarlo por un aparato.
Análisis de Restricción
Son estudios genéticos mediados por enzimas de restricción. Son endonucleasas que reconocen secuencias
específicas de ADN y cortan cuando reconocen dicha secuencia. Las enzimas de restricción son propias de las
células procariotas. Suelen ser enzimas destinadas a restringir e secuencias de ADN de virus bacteriófagos.
Suelen ser sustancias palindrómicas que cuando son reconocidas se cortan ambas hebras produciendo
extremos romos (no deja nucleótidos desapareados) o extremos cohesivos (deja nucleótidos desapareados).
Una de las aplicaciones es la inserción de material genético en vectores. Se utiliza par la clonación de genes
y en experimentos de expresión de proteinas. También se utilizan para identificar polimorfismos de una única
base (SNPs). Nos permiten realizar un diagnóstico molecular tras la digestión de las enzimas de restricción.
Muchas de las enfermedades genéticas provocan cambios en las dianas de restricción. Los sitio de restricción
son totalmente específicos. Podemos generar nuevas dianas de restricción. Por electroforesis podemos ver
qué fragmentos han sido cortados por la enzima (tienen la secuencia diana) o no han sido cortados (no tienen
la secuencia diana). Ejemplos de la Presentación Leer y Entender.
PCR
Kary Mullis 1983. Amplificación in vitro de una región del genoma. Aprovecha la capacidad de la DNA
Polimerasa para sintetizar una nueva hebra de DNA a partir de una hebra molde. Las muestras son muy
diversas y no es necesario purificar el ADN. Los segmentos que se replican tienen entre 2,5 y 50 pb.
Los cebadores son fragmentos cortos de DNA monocatenario (20-25 nucleótidos). La secuencia es
complementaria a a que querremos amplificar. Delimitan la región que queremos amplificar. Sirven como
punto de anclaje para que la polimerasa copie y sintetice las nuevas hebras. Deben tener un tamaño y
contenido de C+G (40%-60%) determinada. Debe tener una T de melting, importante porque la T de
anillamiento durante la PCR es muy específica. No debe haber repeticiones en su secuencia, no debe haber
estructuras secundarias como los palíndromos. Programas como primer 3 nos permiten diseñar cebadores.
La Taq Polimerasa es la que utilizamos. Es termo estable. Utiliza Mg2+ como cofactor. No tiene actividad
correctora de errores. En una PCR los errores son más que en una replicación celular eucariota.
Una PCR tiene una etapa previa con una T alta para asegurar la desnaturalización del DNA inicial. Después
suceden los ciclos de la PCR: desnaturalización, anillamiento o hibridación y elongación. Por último hay una
elongación final para que la Pol complete los fragmentos.
En la PCR distinguimos tres regiones en su grafica. El numero de ciclos aumenta de forma exponencial hasta
que llegamos a una meseta por el gasto de alguno de los reactivos. Tiene un rendimiento del 70-80%.
2


N=No(1+R)^x (Moléculas finales = Moléculas iniciales (1+Rendimiento)^número de ciclos). Se puede utilizar
en el diagnostico de enfermedades como la enfermedad de Huntington (autosómica dominante). Se produce
cuando hay más de 37 repeticiones del triplete CAG. Para diagnosticarlo amplificaremos esa región del ADN.
En casos normales tendrá menor tamaño que en el caso de una persona enferma. La longitud de repeticiones
muestra una correlación inversa con la edad del individuo. Cuantas más repeticiones haya, antes aparece la
enfermedad.
El diagnóstico para el paciente 4: no tiene la enfermedad y es homocigoto. El paciente 6: tampoco tiene la
enfermedad, es heterocigoto. Tiene un alelo con 38 pb y el otro alelo es normal. El paciente 9: Tampoco tiene
la enfermedad pero no lo desarrollará nunca porque el número de repeticiones es pequeño.
Variantes de la PCR
La PCR larga genera un producto de gran tamaño (hasta 40.000 pb). Se utilizan polimerasas con una gran
procesividad. Estas polimerasas no tienen capacidad correctora de errores.
La PCR anidad tiene como objetivo aumentar la especificidad. Son dos PCR consecutivas con dos parejas de
PCR distintos. Los primeros cebadores generan un producto más grande para acotar la región que queremos
amplificar. En la segunda PCR utilizamos como molde el producto de PCR de la primera reacción. Los cebadores
son totalmente específicos de la región que queremos amplificar. No partimos de un DNA genómico.
Aumentamos la especificidad de la PCR. Interesa hacerlo cuando las dianas son poco abundantes.
La PCR en caliente o Hot Start tiene como objetivo aumentar la especificidad. Utilizamos una polimerasa unida
a un anticuerpo. Mientras esté unida estará inactiva y esto sucederá a bajas temperaturas. Aumenta la
especificidad porque a bajas T la polimerasa se encuentra inactiva. La polimerasa se activa cuando aumenta T
y cuando llegues a aprox 72 grados copiará perfectamente. Al aumentar T rompemos l enlace entre el
anticuerpo y la polimerasa. De esta forma la polimerasa no copiará productos de PCR inespecíficos.
La PCR multiplex genera muchos productos de PCR distintos. Se coloca una muestra de ADN en un mismo tubo
y añadiendo distintas parejas de cebadores. Esto se utiliza para ahorrar tiempo y recursos.
IMP para Test: qPCR o Reacción de la Polimerasa a Tiempo Real o Cuantitativa

Es una variante de la PCR que permite hacer un seguimiento de la replicación. Ciclo tras ciclo se conoce la
cantidad de producto obtenido. Es una técnica de alta sensibilidad, en comparación con la PCR convencional
podemos conocer la cantidad de DNA de partida. Es importante en estudios de expresión ya que podemos
cuantificar la cantidad de ADN de partida.
Junto con todos los elementos de la PCR habituales, añadiremos un componente fluorescente como SYBR
Green (agente de tinción). Es un fluorocromo que se unirá al ADN bicatenario independientemente de su
secuencia. Cuando excitamos la molécula, producirá fluorescencia si está unido al ADN bicatenario. Conforme
transcurre la PCR aumentará el producto de PCR y más moléculas de SYBER Green unidas al ADN. La
fluorescencia tras cada ciclo será mayor.
En la gráfica vemos la fluorescencia

relacionada con el numero de ciclos.
Al principio la fluorescencia no será
distinguible. Llegará un momento
(fase de iniciación), que entraremos
en la etapa exponencial, fase en la
que la fluorescencia es claramente
distinguible de la de partida. Como
el numero de moléculas de ADN es
exponencial, la fluorescencia
tambien crece de forma
exponencial. Esto sucede hasta que
llegamos una zona de meseta o
plateau en la que se agotará alguno de los reactivos y no se generará más producto de PCR ni fluorescencia.
3


Necesitamos un termociclador especial que tiene un laser que emite luz de una determinada longitud de onda
para excitar al SYBER Green y tendrá otro aparato que detecte la fluorescencia del SYBER Green generando la
gráfica anterior.
Para cuantificar tendremos el cuenta el valor CT (cycle threshold o ciclo umbral) que se define como el número
de ciclos requeridos para que la señal de fluorescencia iguale el umbral marcado. De forma artificial trazamos
una línea que corte en mi grafica en la fase exponencial. Esa es la línea umbral. El punto donde corte es el
punto CT. Tiene un valor será útil para cuantificar el ADN de partida y será inversamente proporcional a esa
cantidad de ADN.
SYBER Green es un agente de tinción de primera generación. Se une al DNA bicatenario y el marcaje no es
selectivo. Estas son las características de los fluorocromos de primera generación. Durante las etapas de PCR,
la fluorescencia varia en funcion de la cantidad de producto. Cuando esta intercalado, la fluorescencia aumenta
significativamente. Si separamos las hebras del producto de PCR, SUBER Green emitirá muy poca florescencia
o nada de fluorescencia, por eso medimos al final de cada elongación.
Hay otro llamados de segunda generación que son sondas de hibridación marcadas con fluorescencia. Son
secuencias de DNA especificas unidas a un fluorocromo, se unen a regiones especificas del ADN. Tenemos dos
sondas especificas marcadas con fluoróforo. Esta molecula si la excitamos con una determinada longitud de
onda y además se une a su receptor, la molécula donante cederá por resonancia electrónica la luz a la molécula
receptora. De este modo la molécula receptora emitirá fluorescencia a una determinada longitud de onda
distinta de la inicial de excitación. Durante el anillamiento, las sondas se unen a la secuencia objetivo por
complementariedad de bases. El donante excita al receptor, que emite a distinta longitud de onda. De esta
forma tenemos dos moléculas unidas a nuestro ADN por complementariedad de bases aumentando la
especificidad de la reacción. Cuanto más producto de PCR tenga, mayor numero de sondas unidas habrá y
mayor fluorescencia veremos. Hay diferentes tipos de sondas:
- Sondas TaqMan o de hidrólisis: Tiene una secuencia de ADN complementaria a la región que queremos
estudiar y unida a ella en el extremo 5’ un reporter ( R ) y en el extremo 3’ un quencher (Q). Durante
el anillamiento, la sonda se unirá a la región deseada pero durante la elongación la DNA polimerasa
(tiene actividad exonucleasa 5’) que copia, se encontrara con la sonda e hidrolizará la secuencia de
ADN separando R de Q. Si esto ocurre, R emitirá fluorescencia. Conforme aumenta el numero de ciclo,
tendremos un mayor producto de PCR, mayor numero de sondas TaqMan se habrán unido y se emitirá
mayor fluorescencia.
- Sonda Molecular BEACON: la sonda se parece a la sonda TaqMan pero la secuencia de DNA forma una
horquilla, ya que tiene una secuencia palindrómicas que genera enlaces intracatenarios. En la fase de
anillamiento, la sonda se unirá por complementariedad de bases a la secuencia especifica que nos
interesa. Esta unión hace que R y Q estén suficientemente separados para que R emita fluorescencia.
En este caso no hace falta que la polimerasa tenga actividad exonucleasa para romper la sonda.
Curvas de Disociación o Melting

Procesamiento post-amplificación que sirve para caracterizar el producto de PCR. Permite detectar
amplificaciones inespecíficas y diferencias entre las secuencias de los productos de PCR (si estos son distintos).
Si aumentamos T, el DNA se desnaturaliza y el agente de tinción como el SYBER Green no emitirá fluorescencia
y decae la gráfica. Este proceso, si se hace de forma lenta y progresiva generara este tipo de grafica, donde la
caída de fluorescencia será de manera progresiva y tendremos un valor intermedio que nos permitirá
caracteriza el producto. Se denomina temperatura de melting o TM. Podemos definirla como la T a la cual la
mitad de mis productos de PCR están en forma de doble cadena y la otra mitad se han separado. Es un valor
concreto. Muchas veces se presenta como su primera derivada. Obtenemos una grafica con un picos que nos
indican las temperaturas de melting. El numero de picos que obtenemos nos indica el número de productos
distintos que obtenemos. Esto lo podemos comprobar mediante una electroforesis, donde veremos dos
bandas diferentes que corresponderán a los dos productos que obtenemos. Completar con HRM
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IMP: saber hacer ejercicio RFLP del campus virtual.
Aplicaciones
El DNA puede cuantificarse de manera absoluta o relativa. En la cuantificación absoluta obtenemos un
numero, un valor concreto. Para obtener dicho valor, necesitamos hacer una recta de calibrado, que se
consigue añadiendo a la reacción tubitos con ADN de concentración conocida. Estos tubitos más los tubitos
nuestros serán sometidos a una qPCR. El CT obtenido para mi muestra lo podremos interpolar en la muestra y
obtener una concentración de DNA. Suele utilizarse en experimentos de virología o microbiología.
La cuantificación relativa consiste en comparar la expresión de un determinado gen en grupos experimentales
distintos. No necesitamos rectas de calibrado, pero debes introducir en as muestras un gen de referencia
(housekeeping), se expresa igual en todas las células, por lo que será como una relación o ratio. Este gen no
variará en funcion de la muestra, sino que se mantendrá “cte”. Tendremos 2 cebadores, uno para el gen que
nos interesa y otro para el gen de referencia. Podemos observar cambios en el patrón de expresión (sano-
enfermo / tratamiento-no tratamiento). Veremos cuantas veces se expresa más en un grupo que en otro.
Obtenemos una relación, no un valor concreto de concentración de ADN.
Otro tipo de aplicación es el análisis cualitativo, que requiere realizar una curva de melting o de fusión tras la
amplificación. La monitorización es continua. Cada producto tiene un punto o T de melting característico. Suele
aplicare en el genotipado y cambios de una base (SNPs y mutaciones puntuales).
Repasar viendo el video de la presentación.
Ejemplo 1: Hemocromatosis
Es una enfermedad autosómica recesiva. Tiene numerosas variantes alélicas. La mas frecuenta en los que
padecen la enfermedad. Este alelo consiste en la abundancia de Tyr, específicamente la sustitución de Cys por
Tyr en la posición 282.
En la curva de disociación veremos un solo pico que corresponde a una T de melting concreta. Si en ve de este
caso tenemos ambos alelos mutados, obtenemos un único producto de amplificado pero con una secuencia
distinta al anterior y tendrá un T de melting diferente. El ultimo caso es un heterocigoto, donde amplificaremos
os productos de PCR diferentes. Generaremos dos picos uno para cada alelo y con una T de melting distinta
para cada alelo. La amplitud de la grafica será menor que en los homocigotos.
Secuenciación
Consiste en la determinación de secuencias de bases en un AN. Nos centraremos en el método de Sanger, que
es un método enzimático. Consiste en la interrupción controlada de la síntesis enzimática de una hebra
complementaria durante la replicación in vitro.
Necesitaremos: DNA Pol, cebador diseñado para que hibride con el extremo3’ de la región de interés y
nucleótidos terminadores o ddNTPs, que carecen de Oh en el extremo 3’.
El fundamento de los métodos de secuenciación es marcar con fluorocromos lo ddNTPs o con radiactividad el
cebador. Si marcamos el cebador con radiactividad y lo incubamos con el DNA monocatenario, se unirá por
complementariedad de bases. Estas muestras las introduciremos en tubos con diferentes ddNTPs. Completar.
Hoy en día no se marca el cebador, sino que se marcan con fluorocromos los ddNTPs. Esto nos permite
automatizar el proceso.
Automatización
Utilizamos una electroforesis capilar donde se juntan las electroforesis en un tubo y se separan en el mismo
tubo los diferentes fragmentos. Obtendremos un cromatograma que nos indicará las secuencias.
Propiedades de los fluorocromos

Deben ser excitados por una longitud de onda común. Posibilidad de usar reactivos comunes. Emisión a
longitudes de onda suficientemente separadas para permitir su detección independiente y sin interferencia.
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Para determinar un SNPs iríamos directamente a una posición y veríamos en cada alelo que nucleótido
tenemos y nos permitiría ver si esta mutado o no. Podremos diferenciar si es homocigoto o heterocigoto.
Debemos conocer la secuencia de partida.
PCR SNaPshot
Combina PCR con una secuenciación capilar. Diseñamos un cebador que se pare antes del nucleótido que
sabemos que puede cambiar. Tendremos que conocer la secuencia. Añadiremos ddNTPs. La polimerasa
añadirá un único nucleótido marcado con fluorescencia.
Métodos de Nueva Generación o NGS

Permiten llevar a cabo la secuenciación de forma más barata, fiable y en mayor volumen. Permiten identificar
variantes de gentes, aportan información sobre splicing alternativo, etc. Permiten secuenciar el genoma
humano y detectar qué variaciones en la secuencia aportan susceptibilidad frente al desarrollo de
enfermedades. Hacen una secuenciación masiva. En funcion de la plataforma serán diferentes la preparación
de la hebra molde y el método de secuenciación y captura de imagen. Los resultados varían en calidad y
cantidad con el método de Sanger.
Hibridación
Unión entre AN que puede dar lugar a híbridos de DNA-DNA, RNA-DNA o RNA-RNA. Es un proceso reversible.
Nos permite identificar una región concreta del genoma o un AN en concreto. Utilizaremos sondas, que es a
su vez un ADN unido a algún fluorocromo o a la biotina por ejemplo.
Cuando hablamos de técnicas de hibridación, se hablaba de técnicas Southern blot (DNA) y Northern blot
(RNA). Estas técnicas ya no se utilizan, se usan técnicas derivadas de la PCR. Estas técnicas consisten en la
separación por electroforesis de los fragmentos y posteriormente transferir el AN separado a un soporte sólido
que incubaremos con la sonda, permitiendo la hibridación del ADN con la sonda en condiciones
desnaturalizantes, necesitamos AN monocatenarios. Como la sonda está marcada podremos hacer un
revelado.
Las técnicas de hibridación reversa o en tira y dot blot son las que utilizamos hoy en día. Se diferencian en la
forma de la hibridación, uno en línea y otro en circulo respectivamente.
Otra técnica de hibridación es FISH, que consiste en incubar una célula o tejido con una sonda. Lo que se marca
con fluorescencia es la sonda, que cuando hibrida emite fluorescencia. Permite detectar virus, células
cancerígenas, cambios en la expresión génica, marcar cromosomas para diagnosticar cromosomatopatías y la
organización cromosómica mediante un cariotipo espectral.
Chips de Genotipado: Microarrays

Técnica basada en la hibridación. Permite estudiar la expresión génica en diferentes muestras. Extraemos en
RNA para determinar qué RNA es el que se expresa. A partir del RNA sintetizaremos el DNA copia (no es DNA
genómico). El DNA copia complementario a los DNA del microchip se unirá en dicha región. El chip nos indicará
qué genes han hibridado. El chip tiene segmentos de ADN representando a todos los genes humanos. Podemos
identificar qué genes están activos en nuestra muestra.
Edición Génica
Es la alteración deliberada de secuencias de ADN determinadas en una célula viva. Son modificaciones del DNA
es un organismo vivo. Podemos utilizarlo como terapia génica y para cambiar la línea germinal.
Para editar el genoma existen tecnologías como CRISPR, que ha sustituido a otras como ZFM (método caro y
tenia efectos colaterales citotóxicos) o TALEN (disminuía las limitaciones pero era un método laborioso y caro).
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CRISPR es muy precisa y muy rápida. Recientemente se ha experimentando con esta técnica en la modificación
de embriones.
Se basa en un proceso de protección frente a patógenos propio de bacterias. El sistema requiere un complejo
Cas9 (RNA guía y endonucleasa Cas9). El complejo Cas 9, cuando se incube con un determinado DNA, se unirá
a regiones PAM. Para que la unión sea completa, el RNA guía debe ser complementario a una secuencia del
ADN. Podemos unir el complejo a la región de ADN que queramos porque el RNA guía se diseña en el
laboratorio. Una vez haya hibridado el DNA con el RNA guía, Cas9 cortará ese fragmento de DNA y la célula
intentará reparar el daño. Nosotros introduciremos una secuencia donante de DNA, que podrán introducirse
y entonces será una homología directa y crearemos un knocked-in DNA. Existe otro mecanismo de no
homología que producirá el silenciamiento del gen por la inserción de mutaciones al azar. Existen variantes de
Cas9 para mejorar la técnica.
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8. FUNDAMENTOS MOLECULARES DE LA COMUNICACIÓN
INTER E INTRACELULAR
Introducción
La transducción de señales consiste en la unión de un ligando con un receptor y lo que provoca en la célula.
Genera una señal bioquímica que activará el receptor para que este active a segundo mensajeros o para que se
induzca una reacción especifica.
Se produce una rápida y coordinada amplificación de estos procesos. La unión de un único ligando produce la
síntesis de muchos segundos mensajeros y estos de forma amplificado la activación de determinados procesos.
La molecula que es secretada por una célula secretora y llega a un receptor de la célula objetivo donde se
desencadenará una reacción. Para frenar la señal existen mecanismos que degradan la molecula señalizadora.
Comunicación
Tipos de Moléculas de Señalización

En su mayor parte serán hormonas. Pero es sistema nervioso genera también NT. Una hormona e una sustancia
química de acción especializada que actua como mensajero en aquellas células que responden al estimulo que
provocan (receptores. Se sintetizan en órganos específicos y regulan casi todas las funciones orgánicas. Hay
varios tipos de hormonas. En funcion de su naturaleza química distinguimos:
1. Hormonas peptídicas: naturaleza proteica. Se caracterizan por un procesamiento intracelular concreto.

Ocurre mediante un transporte de vesiculas donde se genera una pre pro hormona. Una vez se sintetiza la
proteina en el ribosoma, en el RER encontramos pre pro hormona que no está activa donde la pre pro insulina
se elimina la señal. A través de vesículas se transporta al AG donde sufrirá un segundo procesamiento. Como ya
no tiene la secuencia señal, tenemos la pro hormona (pro insulina). Se elimina el péptido C una región de la pro
insulina y quedan dos cadenas ( A y B) unidas por puentes disulfuro y forma la insulina activa que se transportara
al exterior mediante vesiculas. Este proceso ocurre de forma similar en el resto de hormonas peptídicas. Pre pro
hormona RE pro hormona AG hormona activa.
Podemos hablar tambien de las hormonas del hipotálamo e hipófisis como ACTH. La pre pro hormona es la
proopiomelanocortina. Mediante hidrólisis de este precursor obtenemos diferentes hormonas como ACTH
(secreción de cortisol), MSH (hormona estimuladora de melanocitos pigmentación) o delta endorfina (reduce
la percepción del dolor). Las conversatas se encargan de la hidrólisis. Se pueden generar entre 8 y 10 péptidos
distintos.
Resumen: la síntesis de hormonas es en vesiculas. Se secretan de forma pulsátil con subidas y bajadas rápidas.
Se transportan de forma soluble en plasma. Tienen una vida media corta, por lo que su efecto es rápido y no
duradero. Su receptor se encuentra en la membrana de la célula diana. La señalización terminará por la
degradación por mecanismos intracelulares.
2. Hormonas lipídicas: derivados lipídicos. Receptores intracelulares en el citoplasma o en el núcleo ya que las
hormonas son liposolubles y podrán atravesar la membrana plasmática. Hay distintos tipos:
- Hormonas esteroideas: derivan del colesterol. Distinguimos entre:
o Hormonas adrenocorticales: glucocorticoides y mineralocorticoides.
o Hormonas sexuales: andrógenos y estrógenos.
o Vitamina D
- Hormonas retinoides: derivados del beta caroteno como el acido retinoico (derivado de la vitamina A o
retinol).
1


- Hormonas eicosanoides: derivan del araquidonato. Ejemplos: prostaglandinas, tromboxanos y
leucotrienos.
A diferencia de las hormonas peptídicas el tipo de síntesis es continuo o directo. La secreción es continuada (no
se almacenan) se transforman unidas a proteinas como albumina o pro albúmina o globinas enlazantes de
hormonas. Su vida media es larga y por tanto el efecto es lento y duradero. Su receptor es intracelular. Se
degradan en el hígado mediante la formación de conjugados solubles que se pueden eliminar como el acido
glucurónico y el sulfato.
3. Hormonas dipeptídicas y amina: derivados de aa.

Derivados de péptidos y aa. Comparten características con las hormonas peptídicas y lipídicas. Las hormonas
dipeptídicas destacamos las hormonas tiroideas T3 (triyodotironina) y T4 (tiroxina) que están yodadas. Las
hormonas aminas destacamos las catecolaminas que es una derivada de la tirosina. Destacamos tambien la
adrenalina noradrenalina y dopamina.
Tipos de Señalización
Endocrina (neuroendocrina): efecto de la hormona en un tejido o lugar distinto al que fue secretado. Ej: células
que liberan insulina. Viajan por torrente sanguíneo.
Paracrina: efecto de la hormona sobre una célula vecina. No hay secreción al torrente sanguíneo sino al espacio
extracelular.
Autocrina: efecto de la hormona sobre la misma célula que la secreta.
Yuxtacrina: no hay secreción. La molecula queda expuesta en la célula que la sintetiza y es reconocida por una
célula vecina mediante contacto directo. Un ejemplo es el reconocimiento celular.
Tipos de Receptores
1. Receptores de Membrana: a ellos se unen hormonas peptídicas. Son más numerosos y mejor caracterizados.
Son proteinas integrales de membrana. Podemos diferenciar 3 regiones: región extracelular, que es el dominio
al que se unirá la hormona, región transmembrana y región intracelular, que está en contacto con el citosol. La
unión entre la receptor y el ligando tiene una afinidad, se refiere a la fuerza de unión entre el ligando y el
receptor y se define por la naturaleza química de ambos, su secuencia de aa y su forma. La unión del ligando
con el receptor provoca un cambio conformacional en el receptor desencadenando la señal. También depende
de el numero de sitios de unión del receptor, el receptor puede unirse a más de un ligando y a veces necesita
unirse a más de uno para el cambio conformacional.
2. Receptores Intracelulares: están en el citoplasma y en el núcleo. Se unirán a hormonas lipídicas que

atraviesan la membrana y se unen a los receptores dentro de la célula. La unión entre la hormona y receptor
forma el complejo hormona-receptor intracelular, que puede viajar al núcleo y unirse al ADN actuando como
factor de transcripción de determinados genes.
Vías de Transducción de la Señal

Se forma una cascada de señalización. Receptores efectores 2º mensajero proteinas adaptadoras
mecanismos y moléculas que finalizan la señal.
2


Las vías de transducción dependen del tipo celular, hormona, receptor, pero comparten características y
elementos. Una cascada es el numero alto de reacciones que se activan de forma secuencial. Le producto de
una reacción activa o es sustrato de la siguiente y así sucesivamente.
Los efectores son moléculas normalmente unidas al receptor y responsables de generar el segundo mensajero.
Ej: Proteína G.
Los segundos mensajeros son moléculas que se producen por la activación de un receptor. Es la internalización
de la señal en la célula y activan la cascada de señalización. Existen pocos segundos mensajeros: AMPc, GMPc,
inositol trifosfato, diacilglicerol y Ca2+.
Las proteinas adaptadoras son proteinas que permiten el acercamiento entre el receptor activado y las
proteinas efectores y productoras de 2 mensajeros o los segundos mensajeros. Tiene dominios importantes
como PTB (dominio de unión a fosfotirosina) PH (dominio de unión a lípidos de membrana), SH2 y SH3 (son de
homología a SRC que es una quinasa).
Por ultimo, tenemos los mecanismo y moléculas que finalizan la señal. La señal se bloquea. El cólera provoca
la activación continua de las proteinas G y esto provoca esta patología. Vemos la importancia de la finalización
de la señal.
3


9. MECANISMOS DE TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES A TRAVÉS DE
RECEPTORES DE MEMBRANA
Introducción
KD constante de disociación: es la concentración de ligando en la cual la mitad de los sitios de unión de un
receptor están ocupados. Describe la afinidad entre receptor y ligando. Una KD alta implica poca afinidad. Se
necesitarán concentraciones altas de ligando para activar al receptor.
Receptores acoplados a Canales Iónicos

Su respuesta es muy rápida. Están casi siempre cerrados. Se abrirán durante un tiempo corto pero suficiente
para provocar un intercambio iónico. Los ligandos son moléculas orgánicas pequeñas como NT. La unión es de
micro o milimolar, la afinidad será baja. Cuando el ligando activa al receptor, provocará un cambio
conformacional que permitirá el paso de iones. La señal se produce por el paso de iones a favor de gradiente.
Inactivación por disociación del NT, que provocará el cierre del receptor. Modulan otros canales dependientes
de voltaje. Distinguimos entre catiónicos (excitatoria) y aniónicos (inhibitorios). Los ligandos podrían ser Ach,
ATP o GABA y glicina respectivamente.
Ejemplo: ACh canal nicotínico

El receptor nicotínico tiene 5 subunidades transmembrana. Cada subunidad tiene un polipéptido que atraviesa
4 veces la membrana (tiene 4 dominios en alfa hélice transmembrana). Tiene residuos de leucina en alfa hélices
(hidrofóbico). Cuando la Leu se orienta hacia el interior, impide el paso de agua e iones cerrado.
Receptores acoplados a Proteínas G
Receptores muy abundantes, se encuentra en todas las células. Tienen varios tipos de señalización: paracrina,
autocrina y endocrina. Son diana de numerosos fármacos.
- Tipo de señalización: Lenta.
- Ligando: Gran variedad de moléculas de distintos tamaños.
- Unión KD: nano, micromolar (afinidad media).
- Activación: Cambio conformacional.
- Transmisión de Señal: Cambio conformacional de la proteina G, que activará al efector.
- Inactivación: en cuanto se activa el efector.
- Efectos y funciones: modulación de numerosos procesos (sentidos, contracción cardiaca, metabolismo).
Ejemplo: Receptor beta adrenérgico.
Estructura
Es una proteina con 7 elementos transmembrana. Tiene una región extracelular para interaccionar con el
ligando, y otra citosólica donde interaccionará con la proteina G. Podemos decir que el sistema efector está
formado por la proteína G + una enzima o canal iónico transmembrana.
Las proteinas G son proteinas heterotriméricas. Tienen 3 subunidades distintas.

- Alfa: dominio de unión a GDP y GTP. Si está unido a GTP está activa. Si está unido a GDP está inactiva.
- Beta y Gamma: involucradas en acción y regulación de la proteina G.
En función de los efectores que activen las podemos clasificar en:
1


Ciclo de las Proteinas G (NO va a caer como desarrollo, cayo el año pasado)
1. Llegada del ligando al receptor acoplado a proteina G. Provoca un cambio conformacional del receptor de tal
modo que activará a la proteina G.
2. El cambio conformacional en la proteina G provoca el intercambio de GDP por GTP activando a la proteína G.
3. Separación de subunidades beta y gamma activando totalmente a la proteina G.
4. Activación del efector. Se hidroliza el GTP, liberando energía y activando al efector.
5. La proteína G inactiva con GDP tiene más afinidad por las subunidades beta y gamma.
6. Proteina G unida a sus subunidades beta y gamma regresa al estado basal.
7. Unión del receptor con la proteína G y fosforilación de un dominio del receptor de manera que se inactiva el
receptor y se finaliza completamente la señal.
Principales Segundos Mensajeros
1. AMPc (G alfa s): aumento de la concentración de AMPc.

Activa una cascada de señalización de la proteina kinasa A, que genera una respuesta celular variada en funcion
del ligando:
- Adrenalina: degradación de glucógeno/grasas (hepatocitos, musculo, adipocitos)
- Glucagón: movilización de ácidos grasos almacenados (adipocitos)
- ACTH: síntesis de cortisol y hormonas esteroideas (córtex suprarrenal).
2. AMPc (G alfa i): inhibición de la adenilato ciclasa y disminución de AMPc. Se inhibe la cascada de señalización
de PKA mediante:
- Somatostatina: contrarresta los efectos del glucagón.
2


- Prostaglandina E1: contrarresta efectos de adrenalina y glucagón.
3. IP3 y DAG (G alfa q): activación de la fosfolipasa C y aumento del IP3 y DAG (liberación de Ca2+9. Se activa la
cascada de señalización de la PKC mediante:
- Metabolismo: hígado vasopresina-glucogenolisis.
- Modulación de la funcion neuronal e inmune: mastocitos antígenos – histamina
- Regulación de la proliferación celular: factores de proliferación celular
- Regulación de numerosas enzimas: secreción, contracción, reordenamientos del citoesqueleto.
- Contraccion del ML: ACh.
Receptor Beta Adrenérgico (Hígado)

- Ligando: adrenalina
- Proteina G acoplada: G alfa s aumento AMPc activación de PKA
- Cascada de señalización: fosforilación.
- Respuesta: liberación de glucosa.
Receptores acoplados a Enzimas

Tienen intrínsecamente actividad enzimática.
- Tipo de Respuesta: Largo, duradero.
o Activación de una enzima: minutos
o Activación de la transcripción: horas
- Ligandos: hormonas peptídicas
- Unión: KD picomolar (afinidad alta).
- Activación del receptor: activación de enzimas
- Transmisión de señal e inactivación: depende
- Actividades enzimáticas más frecuentes:
o Quinasas: tirosina y guanilil ciclasa.
o Fosfatasas
o Proteasas
o Fosfodiesterasa de nucleótidos
- Efectos y funciones: activación /inhibición de expresión génica, división celular, diferenciación celular,
procesos apoptóticos. Regulación del metabolismo (receptor de insulina).
Receptores Tirosina Quinasa – Completar Juani
Ejemplo de receptor tirosina quinasa: Receptor de Insulina

Tiene dos subunidades alfa extracelulares y dos subunidades beta que son transmembrana y tienen el extremo
Ct intracelular.
El receptor se activa de la siguiente forma:

1. Unión de Insulina
2. Autofosforilación de 3 residuos de tirosina de cada subunidad beta.
3. Fosforilación de IRS – 1 (sustrato 1 del receptor de insulina).
4. Dos vías de principales de transducción son activadas por acción de la insulina:
- Vía de la fosfatidilinositol 3-kinasa (PI3K)

En situaciones normales, la glucógeno sintasa sintetiza glucógeno y la quinasa GSK3 la inhibe mediante la
fosforilación. Cuando llega la insulina, PKB fosforila a GSK3 inactivándola, activando de forma indirecta la
glucógeno sintasa. PKB provoca la translocación de GLUT 4 en la membrana, por lo que más glucógeno entra
3


a la célula. La via de fosforilación de la GSK3 sucede principalmente en hígado y músculo, mientras que la vía
de translocación de GLUT 4 sucede principalmente en músculo y TA.
- Vía de las kinasas activadas por mitógenos (MAPK).

Activación de una cascada de quinasas por RAS.
Receptores Guanilil Ciclasa

Tienen actividad intrínseca guanilil ciclasa, genera AMPc. Se activa de la siguiente forma:
1. Unión del ligando.
2. Transformación de GTP en GMPc (guanilil ciclasa).
3. Activación de la cascada de fosforilación de PKG.
En riñón e intestino: transporte iónico y retención de agua.

En musculo cardiaco: relajación.
Cerebro: desarrollo y funcionamiento.
Ejemplo: péptido nautriurétrico auricular (PNA), que reduce la presión arterial, al reducir el volumen de liquido
extracelular. Respuesta vascular a los vasoconstrictores.
En la activación participa PDE, una Fosfodiesterasa que pasa GMPc a GMP para para el proceso de activación
de PKG.
Receptores de Citoquinas
- Tipo de respuesta: larga y duradera (auto y paracrino)
-

Biología Molecular

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BIOLOGÍA MOLECULAR

UNIVERSIDAD CEU SAN PABLO

Alejandra González González

Purinas: A y G. Doble anillo.

Completar propiedades, estructura y modelos conformacionales.

Niveles de organización del ADN de orden superior

Nivel 2 de empaquetamiento: tiene lugar el superenrrollamiento. El ratio de empaquetado es de 40 veces. 6

Nivel 3 de empaquetamiento: se forma la eucromatina, es la forma en la que se suele encontrar el ADN en el

La eucromatina puede continuar condensándose formando heterocromatina, que es transcripcionalmente

Familias multigénicas de genes agrupados: conjunto de secuencias, relacionadas evolutivamente, que

Moderadamente repetitivo no codificante disperso

La síntesis es simultanea, secuencial y bidireccional. Las dos hebras se sintetizan simultáneamente y

- Delta y épsilon: actividad polimerasa y exonucleasa

Mecanismo de acción y dirección de síntesis (Pregunta Desarrollo)

El cofactor de la ADN Polimerasa es el Mg2+. La dirección de síntesis es 5’ 3’.

Estructura de la ADN Polimerasa: Tiene forma de mano. Son muy grandes.

Velocidad, Procesividad y Tasa de Error

Iniciación (Pregunta Desarrollo)

Reclutamiento del replisoma.

En la hebra continua el avance de la horquilla de replicación y de la síntesis es el mismo mientras que en la

Replicación de los Telómeros

Replicación del ADN Mitocondrial

Requerimientos de RNA Polimerasa II

Proceso Global de Transcripción

Procesamiento de RNA: Maduración

Maduración del Pre-mRNA o hnRNA

- Modificación del extremo 5’

1. La RNA Trifosfatasa elimina 2 grupos fosfato de la molécula de GTP.

- Modificación del extremo 3’

- Splicing: eliminación de intrones y empalme de exones

1. Formación de Ayustosoma: asociación de ribonucleoproteinas nucleares pequeñas (snRNP) y mRNA. Estas

Procesamiento y Transporte de RNA

1. Interfiriendo en la accesibilidad del RNAm se interfiere en la traducción. Veremos el efemplo de la ferritina.

- Formación del Complejo de Iniciación

IMP para Test: qPCR o Reacción de la Polimerasa a Tiempo Real o Cuantitativa

En la gráfica vemos la fluorescencia

Curvas de Disociación o Melting

Repasar viendo el video de la presentación.

Propiedades de los fluorocromos

Métodos de Nueva Generación o NGS

Chips de Genotipado: Microarrays

Tipos de Moléculas de Señalización

1. Hormonas peptídicas: naturaleza proteica. Se caracterizan por un procesamiento intracelular concreto.

3. Hormonas dipeptídicas y amina: derivados de aa.

2. Receptores Intracelulares: están en el citoplasma y en el núcleo. Se unirán a hormonas lipídicas que

Vías de Transducción de la Señal

Receptores acoplados a Canales Iónicos

Ejemplo: ACh canal nicotínico

Receptores acoplados a Proteínas G

Ejemplo: Receptor beta adrenérgico.

Las proteinas G son proteinas heterotriméricas. Tienen 3 subunidades distintas.

En función de los efectores que activen las podemos clasificar en:

Principales Segundos Mensajeros

1. AMPc (G alfa s): aumento de la concentración de AMPc.

Receptor Beta Adrenérgico (Hígado)

Receptores acoplados a Enzimas

Receptores Tirosina Quinasa – Completar Juani

Ejemplo de receptor tirosina quinasa: Receptor de Insulina

El receptor se activa de la siguiente forma:

- Vía de la fosfatidilinositol 3-kinasa (PI3K)

- Vía de las kinasas activadas por mitógenos (MAPK).

Receptores Guanilil Ciclasa

En riñón e intestino: transporte iónico y retención de agua.