EXAMEN DE BIOTECNOLOGIA DE ALIMENTOS

Enero 2021.
NOMBRE APELLIDOS

Clonaje de una Endo-poligalacturonasa D (pgaD) del basidiomiceto Lachnellula hialina en una

cepa industrial Saccharomyces cerevisiae con paso previo por una cepa E. coli de laboratorio
para comprobar la construcción. Dicha enzima inicia el corte hidrolítico por el extremo no
reductor del polímero de pectina, su sustrato, especialmente la de bajo metoxilo. Se
encuentra en algunas bacterias, hongos y levaduras, fundamentalmente fitopatógenos, y
es de aplicación en la industria del zumo ya que causa la rotura de la lámina media de las
paredes celulares del fruto lo que se traduce en un aumento significativo de la extracción
de jugo. El proyecto consiste en la transformación de una cepa industrial de
Saccharomyces cerevisiae con dicho gen para producir el enzima. El proceso secuencial
de clonaje en dos etapas incluye, en una primera, la transformación de una cepa de
laboratorio E. coli con la construcción deseada del gen (1466pb) (ver a continuación) y que
el alumn@ deberá resolver chequeando si una de sus secuencias parciales amplificada
por PCR contiene alguna mutación y si esta tiene lugar en una región codificante (ORF o
exón) o no.

atgcttccct ctccttcaaa gatctctaca ttctatctca ttgccctata atcccttgtc

ccaccagcca cttccacaaa caccacttcc gcccccatat ccactcccac atccacaaat
acaacaacac catgcttctg cacaacatac ccgcaaatcg cccccgcaat ttcagcctgc
ccctccctaa ccctgcacaa catccacgct cccgctcaca gcgccatcgc tctcacgtcc
ctcgtccccg gcacaacgat cacgttttcc ggcacgacga cgtttgcgta tactccggat
tcgcagtttc gcccgatcca aatctcggga tcgggtgtta gcattctggg tgcgccggga
tcggttattg atggaggggg ggagatgtat tgggatgggc tggggagtaa tgggggatta
gctaagtagg ttcttaattt taatttctga agagaagagt aaaagcaaag gggacggaga
aacaataagg gacattatag gtagaaaagg gtatttggct aatgataact ggagaatctg
ttcaggccgg gtcagtttat gaaagtacag attacaaatc attctacgat gagcgatttg
tatatacgga attatccatc ccatggtata aatctcgctg gtgttaagga ctcaatcatt
gaaaatatca ttcttgtacg tccgaaattc ccttcacttc ctccaccacc accacaaaat

I. Cuestiones sobre el análisis de secuencia in silico:

Direcciones útiles:
1. Para alinear secuencias (nulceotide blast: basic local alignement search tool):
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

Secuencia putativa del operón del gen pgaD de Lachnellula hialina en:
2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NW_022157357.1?
report=genbank&from=7175&to=8640&strand=true
3. Códigos de traducción RNA o DNA - aminoácido:
https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_codon_table

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 II. Cuestiones sobre el clonaje en pBAC-lacZ

Con el gen putativo insertado en el vector circular pBAC-lacZ (11151 bps)

(https://www.addgene.org/13422/sequences/) se procederá a la trasformación de una cepa E.
coli de laboratorio. Dicho vector consta de dos genes marcadores de selección: uno que
confiere resistencia a cloramfenicol (CmR) y otro “semáforo” que confiere color azul y codifica
para una beta-galactosidasa (lacZ). El punto de inserción en el vector mediante extremos
cohesivos de pgaD en pBAC-lacZ ha sido ClaI.
El cultivo resultante de la transformación bacteriana previa dilución, se ha plaqueado en LB+
cloramfenicol+ lactosa+ X-gal y, en caso necesario, se ha efectuado replica platting en LB+
lactosa+ X-gal. La eficiencia de la transformación para este vector en E. coli es del 1/2000.

III. Cuestiones sobre la orientación del inserto

Una vez seleccionadas las colonias con el color adecuado y/o la resistencia o no a
cloramfenicol, no todo está hecho!. El inserto puede entrar en el vector en dos posibles
orientaciones pero, aún con la misma secuencia, solo una es la correcta, y al traducirse dará
lugar a la proteína buscada. Esto es, de 10 colonias con el fenotipo adecuado,
resistencia/sensibilidad y color, probablemente cinco serán portadores del vector con el
inserto bien orientado y las otras cinco no.

En un programa de búsqueda de enzimas de restricción, http://www.restrictionmapper.org/ se

ha visto que EcoRI corta tanto al vector circular pBAC-lacZ como al inserto, pgaD (1466pb), en
un solo punto, dando extremos cohesivos.