DOBLE SELECCION

Detección de colonias bacterianas con X-gal e IPTG: a-Complementation

La eficiencia de transformación es ligeramente mayor cuando las bacterias se colocan en placas de
agar superior en lugar de en la superficie de las placas de agar. Quizás las bacterias transformadas
prefieren el estado ligeramente anaeróbico dentro del agar blando o la isosmolaridad proporcionada
por el medio de agar. El reactivo isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido, o abreviadamente IPTG, es
una molécula de uso común en investigación en biología molecular. Se usa como análogo no
hidrolizable de la alolactosa para inducir la expresión génica en el laboratorio. X-Gal de es un pilar
en aplicaciones de clonación de biología molecular en el que se usa para detectar la actividad de la
ß-galactosidasa. X-Gal se usa para detectar la inserción de ADN extraño en la región de lacZ de un
ADN plasmídico.
Este protocolo presenta métodos para identificar plásmidos recombinantes mediante α-
complementación. El sustrato cromogénico X-gal se mezcla con el cultivo bacteriano, se combina
con agar superior fundido y luego se esparce en placas de selección. Si los recursos son limitados,
el volumen requerido de X-gal puede ser esparcido sobre una placa de agar.

PARTIDA ZAZUETA
CAROLINA
19322755
3-2
INGENIERÍA GENÉTICA
Detección de colonias bacterianas con X-gal e IPTG: a-Complementation

PREPARACION DEL
MEDIO
Dispensar alicuitas de agar superior
fundido en tubos, colocarlos en un FIN DE PROTOCOLO
bloque calefactor y retirar el primer tubo
del bloque.

Identificar colonias con plasmidos

ADICION DE MUESTRA recombinantes y seleccionas y cultivar
colonias que lleven plasmidos
recombinandtes
Agregar o.1 ml de suspensión bacteriana
para cajas de Petri de 90mm y 150mm y
cerrar la parte superior del tubo e invertir FASE DE INCUBACION
varias veces

ADICION DE Se repiten los pasos 2-4 luego dejar

SUSTRATOS
Abrir tubo y se agrega en cantidades
adecuadas de X-gal e IPTG, cerrar tubo e
invertir, verter agar superior en centro de
placa que contenga el antibiotico y
distribuir mediante rotacion
endurecer el agar blando a temperatura
ambiente e incubar en posición invertida,
retirar placas de incubadora para
guardarlas y desarrollar el color azul
FASE DE INCUBACION