II.

2 INTRODUCCIÓN A LAS OPERACIONES DE SEPARACIÓN

• En la remoción de insolubles de un caldo pueden ser utilizados diversos tipos de equipos.

• La selección depende de varios factores, particularmente del tipo de material a tratar,
disponibilidad, eficiencia y costo de equipo.
• Los principales componentes insolubles son
• Células enteras
• Restos celulares
• Precipitados
• Cuerpos de inclusión
Las operaciones de separación típicas son

a) FILTRACIÓN
• SEPARACIÓN DE HONGOS FILAMENTOS
• CLARIFICACIÓN DE CALDOS

b) CENTRIFUGACIÓN
• SEPARACIÓN DE LEVADURAS, BACTERIAS Y CÉLULAS DE
MAMÍFEROS
• Cuando el producto de interés es intracelular después de que
las células han sido separadas del caldo es necesario
romperlas.

• Las técnicas de ruptura celular dependen de el grado de daño

que se requiere hacerle a la célula
• Disrupción de membrana celular

• Disrupción de todas la membranas

Filtración como parte del sistema de
separación sólido-líquido

Tejeda (2ª. Edición, 2011)

1) Pretratamiento: mejora las propiedades del caldo para facilitar la BS; usa agentes físicos, químicos o enzimáticos.
Físicos:
-Térmico: para reducir viscosidad, volumen o romper estructuras gelatinosas, no adecuada para productos termolábiles).
Químicos: (pueden agregar toxicidad o impurezas)
-Coagulación: añadir sustancias que aumenten el tamaño de partícula, para que puedan sedimentar.
Electrolitos (iones polivalentes positivos de hierro, aluminio y calcio): neutralizan las cargas repulsivas superficiales de los soles,
por lo que aumentan las fuerzas de atracción de Van Der Waals, para precipitarlas.
Acidos o bases que alteren el pH del caldo y la carga superficial de la partícula.
-Floculación: (agregan y flotan): Polielectrólitos aniónicos, neutros o catiónicos (mas usados, p.e. poliacrilamida, polietilenimina,
polisacáridos catiónicos, quitosan, poliamina)
-Ayudas filtro: sustancias que se utilizan como precubierta del medio de filtración, actúan como adsorbentes de las partículas
coloidales, mejorando el tamaño de partícula, aumenta la incomprensibilidad y porosidad y permeabilidad del material sólido).
Retardan el taponamiento, facilita la limpieza, disminuye la caída de presión y mantiene características del filtración uniforme,
minimiza costos de filtración (tierra de diatomeas son restos de esqueletos de pequeñas plantas acuáticas prehistoricas,
perlitas (vidrios volcánicos pulverizados).

2) Concentración: disminuir el volumen a manejar para reducir costos de proceso global, implica una separación gruesa.

3) Separación de sólidos: recuperación de los sólidos.

4) Postratamiento: lavado o secado

Las AF mas grandes facilitan más la
filtración, pero dan turbidez.
 FILTRACIÓN
• La filtración consiste en la separación de un sólido de un fluido por acción de un medio filtrante y un
gradiente de presión.

• En los procesos BT se usan tres mecanismos:

A. Filtración convencional o con formación de torta: los sólidos se

depositan sobre el medio filtrante formando una pasta.

B. Filtración de lecho profundo: los sólidos se depositan dentro del

medio filtrante.

C. Filtración por membranas (Microfiltración y Ultrafiltración:

membrana de tamaño de poro muy pequeño paralela al flujo, los sólidos no se
depositan, el caldo se concentra.
4 TH C O F F E E

La filtración consiste en la separación

de un sólido de un fluido por acción de
un medio filtrante y un gradiente de
presión.
 En los procesos BT se usan tres mecanismos:

A. Filtración convencional o con formación de torta: los sólidos se

depositan sobre el medio filtrante formando una pasta.
4 TH C O F F E E

B. Filtración de lecho profundo: los sólidos se depositan dentro del

medio filtrante.

B. Filtración por membranas (Microfiltración y Ultrafiltración:

membrana de tamaño de poro muy pequeño paralela al flujo, los sólidos no se
depositan, el caldo se concentra.
 TEORÍA DE FILTRACIÓN CONVENCIONAL
• La suspensión pasa a través de un medio permeable que retiene los sólidos utilizando un gradiente de presión y formándose una
torta.
• Se deriva de los estudios de la mecánica de fluidos en medios porosos.
• La ecuación que describe el movimiento de fluidos newtonianos a través de medios porosos, fue formulada en 1856 por el geólogo
Francés D’Arcy.
4 TH C O F F E E

• La aplicación de esta ecuación al caso particular donde se desprecian lo efectos gravitacionales (lechos cortos), puede ser descrita
como

donde:

k P v = Velocidad superficial del líquido (flujo volumétrico por área de filtración) [L/t]

v=
k = Permeabilidad del lecho [L2]
ΔP = Caída de presión a través del lecho [F/L2]
l l = Profundidad del lecho filtrante [L]
μ = Viscosidad del fluido [M/L-t]
 • La velocidad de filtración puede ser descrita en términos del volumen de filtrado y el área de

filtración (dos parámetros más fácilmente medibles) como

1 dV
v= 
A dt
• Combinando las ecuaciones anteriores y expresando la relación l/k como una resistencia R, se

puede obtener la ecuación diferencial básica de la filtración convencional

4 TH C O F F E E

1 dV P
 =
A dt R

• R es la resistencia total a la filtración. Esta resistencia puede expresarse como la suma de dos
resistencias en serie:
R = Rt + Rm

• donde Rt es la resistencia de la torta y Rm es la resistencia del medio filtrante. Combinando

ecuaciones se obtiene:
dV AP
=
dt  ( Rt + Rm )
 Las ecuaciones diferenciales obtenidas de la filtración convencional sólo pueden
ser aplicadas a soluciones diluidas en régimen laminar, cuando el número de
Reynolds modificado es menor a 5, ó

d p v
5
4 TH C O F F E E

 (1 −  )

Donde
dp = diámetro de la partícula o diámetro del poro de la torta
ρ = es la densidad del fluido, y
ε =fracción de espacio vacío del lecho

En general las biofiltraciones cumplen con esta condición

 TEORÍA DE FILTRACIÓN DE LECHO PROFUNDO

-La suspensión generalmente diluida se hace

pasar por un lecho empacado.
4 TH C O F F E E

-Las partículas sólidas se unen a la matríz del

lecho o las ya reteniendo.

-Usados para remoción de bacterías, coloides y

restos celulares, clarificar caldos de
anticuerpos monoclonales, caldos de cultivo,
remoción de DNA, preparer soluciones para
cromatografía, se usan en conjunto con filtros
de esterilización para economizar.
 Diseño de Equipo de Filtración
FACTORES IMPORTANTES EN LA FILTRACIÓN CONVENCIONAL POR LOTES O
INTERMITENTE

- Permeabilidad de la torta

- Tamaño del poro de la torta

4 TH C O F F E E

- Tamaño de la partícula del sólido

- Compresibilidad de la torta: incompresibles a P = cte y compresibles a P = cte

- Parametros de operación:
- Con caída de presión constante:  gradual del flujo al  espesor de la torta.

- Con flujo constante: bombas que producen el mismo flujo a diferentes cabezales.

• En ambos casos la resistencia de la torta varía conforme avanza el tiempo de filtración al irse
acumulando sólidos.

• Sin embargo, la resistencia específica de la torta puede ser variable o no, dependiendo de su
naturaleza.
 FILTRACIÓN POR LOTES:

Tortas incompresibles y ΔP constante

En este caso, la resistencia de la torta puede suponerse directamente proporcional a la cantidad de sólidos (peso
seco) depositados por unidad de área. Esto puede expresarse como:

Rt =  w
4 TH C O F F E E

• donde w es la cantidad de sólidos secos depositados por unidad de área y α es la resistencia.

• En términos más fácilmente medibles, tenemos:

V 
Rt = 0  
 A
• donde ρ0 es la cantidad de masa sólida seca por unidad de volumen libre de sólidos o volumen de filtrado del
caldo a separar.
• Sustituyendo en la ecuación diferencial de filtración: dV AP
=
dt  V  
 0   + Rm
  A 
 La ecuación puede escribirse en forma recíproca, Se integra con las
siguientes condiciones iniciales:
para t = 0,V = 0

 V  
 0   + Rm
dV
=
AP
→
dt
=   A  → A dt = 0  V  +  Rm
 
  AP P  A  P
4 TH C O F F E E

dt  
V dV dV
 0   + Rm 
  A 
y = mx + b

At 0  V   Rm
=  +
V 2P  A  P

Esta ecuación puede ser utilizada para la

obtención de parámetros de filtración en equipos
intermitentes a presión constante, al graficar
 A. Cuando la resistencia del medio filtrante es despreciable, entonces la ordenada al origen toma
el valor de cero y la ecuación se reduce a

At 0 V  y = mx + b
=  
V 2P  A
B. Cuando se desea asegurar una formación uniforme de la torta evitando flujos altos al
inicio de una corrida, que inducen la penetración de sólidos sobre el medio filtrante. En
4 TH C O F F E E

este caso la caída de presión se incrementa gradualmente hasta alcanzar una caída de
presión constante. Bajo estas condiciones la integración de la ecuación de filtración
diferencial se efectúa en el rango de caída de presión constante, con las condiciones
iniciales t = ts, V = Vs

A ( t − ts ) 0  V + Vs   Rm
= +
(V − Vs ) 2P  A 
 P

Esta ecuación nos permite calcular datos experimentales

al graficar

A ( t − ts )  V + Vs 
vs  
(V − Vs )  A 
 FILTRACIÓN POR LOTES:

Tortas compresibles y ΔP constante

La compresibilidad de una torta se caracteriza por un aumento de su resistencia específica al

aumentar el gradiente de presión que actúa sobre la torta.
La mayoría de las tortas de material biológico son compresibles. En estos casos la resistencia
4 TH C O F F E E

específica de la torta puede ser correlacionada con el gradiente de presión mediante la

siguiente ecuación empírica:
 =  ' ( P )
s

donde α’ es una constante relacionada principalmente con el tamaño y forma de las partículas
de la torta, y s es el índice de compresibilidad. Este varía de cero para una torta incompresible
a 0.8 para una torta altamente compresible (la correlación es aceptable para s ≤ 0.6 y ∆P ≥ 0.2
atmósferas)

At  ' 0  V   Rm
=  +
V 2P1− s  A  P
 Filtración continua
• En un filtro continuo el ciclo de filtración consta de tres pasos principales:
o Formación de la torta

o Lavado de la torta
4 TH C O F F E E

o Descarga de la torta
 • Filtración continua
• En los procesos de filtración intermitente el área de filtración es constante y el espesor de la
torta varía con el tiempo de filtrado.
• En la filtración continua se puede suponer que el espesor de la torta es constante y el área de
filtración varía con el tiempo
donde
tf es el tiempo que dura un paso de la formación de la torta
4 TH C O F F E E

Vf es el volumen de filtrado colectado en ese período.

A es el área expuesta de filtración por ciclo o revolución

• La ecuación anterior puede ser expresada en término de los parámetros de diseño: Flujo de filtrado (Q, [L3/t]),
Ángulo de formación de la torta ( φ, [radianes]), Velocidad angular del tambor ( N, [t-1]), Radio del tambor (R,
[L]), y Longitud del tambor (L, [L]).
• Entonces es posible relacionar el volumen de filtrado de un ciclo por unidad de área, con el gasto Q:
 • El tiempo que dura cada etapa de filtración se puede relacionar con el ángulo de filtración y la velocidad de
giro del tambor, mediante la ecuación siguiente:

• Combinando las ecuaciones anteriores se obtiene el flujo de filtración

ó en términos de la
4 TH C O F F E E

velocidad de formación de
la torta, W = ρ0 Q

En la etapa de lavado la cantidad de solutos que puede ser recuperada depende del volumen de líquido de lavado que se emplee. Un
factor de diseño es el tiempo requerido para aplicar el líquido de lavado o tiempo de lavado, el cual depende de la naturaleza de la to
Debido a lo anterior el análisis de la etapa de lavado se efectúa en dos pasos:

1. Cálculo del volumen de lavado en función de la recuperación del soluto que se especifique
2. Cálculo del tiempo de lavado en función del tipo de torta

Cálculo del volumen de líquido de lavado

r = (Soluto retenido en la torta)/(soluto inicial en la torta)
ε = Eficiencia de lavado
n = (Volumen de líquido de lavado)/(volumen de líquido retenido por la torta)
• Filtración continua
• Para el cálculo del tiempo de lavado, se puede suponer que el gasto durante la fase de lavado es constante dado que
el líquido de lavado no tiene sólidos.

• El gasto cuando V = Vf es constante e igual a

4 TH C O F F E E

• Integrando con los límites:

• donde: VL es el volumen de líquido de lavado y tL es el tiempo de lavado requerido, obtenemos:

• Es conveniente expresar la ecuación anterior en términos de parámetros de diseño, como la relación de volumen de lavado a volumen de retenido n, y
a la relación de la fracción del líquido retenido con respecto al volumen de filtrado f, de tal manera que:
 • Combinando la ecuación anterior con la ecuación deformación de la torta se obtiene:
4 TH C O F F E E

• Los volúmenes y tiempos, de filtrado y lavado, se relacionan directamente utilizando la

ecuación anterior y la de formación de la torta, obteniendo:
 SEDIMENTACIÓN
؋Es una operación de separación de fases sólido-líquido
؋Las partículas sólidas de mayor densidad se separan ya que tienden a
sedimentar debido a la gravedad.

؋El fluido puede ser un líquido o gas, aunque en este último caso pasa a ser
fluidización
 Usos
–Clarificación: Obtener una fase líquida clara, sin sólidos en suspensión (ej: tratamiento
de aguas)

–Espesamiento: Obtener una pulpa de densidad adecuada para alguna operación

subsiguiente (ej: pulpa para filtrado)

Variables Otros fenómenos

–Tamaño de partícula –Sedimentación impedida

–Densidad de la partículas –Coagulación
–Forma de las partículas –Floculación
–Propiedades superficiales –Dispersión
 DISPERSIONES
Son sistemas multifásicos, compuestos de dos o tres fases

–Una fase continúa (medio dispersante)

–Una o dos fases discontinúas (fases dispersas)

Clasificación según el tamaño de partícula

–Suspensiones, partículas mayores que 100 nm

–Coloides, desde 1-100 nm
 ESTABILIDAD DE DISPERSIÓN

• La capacidad de un sistema de mantener en el tiempo una concentración

uniforme a través de todo el volumen sin necesidad de agitación mecánica
externa.

• Cuando el sistema no es estable, se separan ambas fases por sedimentación de la fase

sólida debido a la fuerza de gravedad.

• Una suspensión es un sistema naturalmente inestable.

• La velocidad de separación de ambas fases está determinada por la propiedades

físicas de ambas fases y la concentración de la fase sólida
A medida que la partícula es más pequeña, menor es el efecto de la fuerza
de gravedad.

• A este nivel, son significativos factores tales como las fuerzas de atracción y
repulsión entre las partículas.

• Si predominan las fuerzas de repulsión, el sistema se mantiene estable

• En caso contrario, las partículas sedimentan solas o forman agregados.

 El proceso de sedimentación puede mejorarse
incrementando: el tamaño de partícula, la diferencia de
densidades, la aceleración de las partículas.
Se puede distinguir la sedimentación de
partículas esféricas en dos casos límites de
interés:
a) Sedimentación por gravedad
b) Sedimentación por acción de una fuerza
centrífuga
 CENTRIFUGACIÓN
Las centrífugas son instrumentos que permiten someter a las muestras a intensas fuerzas que producen la
sedimentación en poco tiempo de las partículas que tienen una densidad mayor que la del medio que las
rodea.

En general se diferencian en función de los márgenes de aceleración a que someten a las muestras en :
a) centrífugas (de pocas g a aprox. 3,000 g),
b) super-centrífugas (o centrífugas de alta velocidad, rango de 2,000 g a 20,000 g) y
c) ultracentrífugas (de 15,000 g a 600,000 g)

En las centrífugas se suele controlar la temperatura de la cámara para evitar sobrecalentamiento de las
muestras debido a la fricción. En las ultracentrífugas, la velocidad extrema (más de 100,000 rpm), hace que
sea necesario hacer un intenso vacío en la cámara de la centrífuga para evitar el calentamiento de rotor y
muestra.
 ROTOR DE LA CENTRIFUGA
En una centrífuga el elemento determinante es el rotor, dispositivo que gira y
en el que se colocan los tubos.
Existen varios tipos:
•El Rotor de ángulo fijo. Los tubos se
insertan en orificios en el interior de
rotores macizos.
caso extremo es el de los rotores
verticales en los que el tubo se sitúa
paralelo al eje de giro. Este tipo de
rotores es típico de ultracentrífugas.
•Rotor basculante. Los tubos se
colocan en un dispositivos (cestilla)
que, al girar el rotor, se coloca en
disposición perpendicular al eje de
giro.
Así pues los tubos siempre
giran situados perpendicularmente al
eje de giro.
Centrifugación por
gradiente de masa
Centrifugación por
gradiente de
densidades
 CENTRIFUGACIÓN
Proceso de resolver sistemas de multi-componentes, con al
menos una de las fases líquidas, por la aplicación de la fuerza
centrífuga
Simulan y amplifican la Tubular
fuerza de gravedad en
un factor de 2 a 5
ordenes de magnitud en
los tamaños comerciales
Tazón sólido

Centrífugas de Cámara
sedimentación múltiple
Centrifugas
Comerciales
Filtros Decantadoras
centrífuga o de tornillo

Combinan dos principios

Discos
de separación, filtración
y centrifugación
 CENTRIFUGACIÓN
En las separaciones centrífugas sólido-líquido la velocidad de sedimentación es mayor que la sedimentación libre o gravitacional, debido a
que los equipos al girar producen una mayor aceleración de las partículas.

Donde:
w2r = Aceleración centrífuga [L/t2]
w = Velocidad rotacional en radianes [t-1]
r = Distancia radial del eje de rotación a la partícula [L]

a) El diámetro aparente de las bacterias es del orden de diez veces menor que el de las levaduras , por lo que su velocidad de
sedimentación es cien veces menor, ya que ésta es proporcional al cuadrado de la partícula
b) Las células contienen más del 70% de agua por lo que su densidad es muy semejante a la de los caldos, por lo tanto el parámetro Δρ
puede ser muy bajo
c) Algunos caldos biológicos son muy viscosos propiedad que dificulta la sedimentación
d) La velocidad de sedimentación puede ser incrementada en un equipo centrífugo aumentando la velocidad de rotación o la distancia
de sedimentación (diámetro de la centrífuga)
 CENTRIFUGACIÓN – FACTOR G
• En la caracterización y escalamiento de centrífugas frecuentemente se emplea el factor G, que es una
medida relativa de la velocidad de sedimentación de una partícula en un campo centrífugo con respecto
a su velocidad de sedimentación en el campo gravitacional

• G puede ser referida a un radio característico el cual generalmente es el radio exterior del campo
centrífugo. Esto permite desarrollar expresiones prácticas para estimar la G de la siguiente forma

Donde N está en rpm, el diámetro del tazón de la centrífuga (o punto de interés) D en mm y G es

adimensional
CENTRIFUGACIÓN – SUPOSICIONES PARA EL DISEÑO
a) La alimentación es una solución diluida
b) Las partículas se distribuyen uniformemente en la capa anular
c) Las partículas sedimentan de acuerdo a la Ley de Stokes
d) La distancia entre la superficie del líquido y la pared de la centrífuga es constante

Tiempo de residencia
La velocidad del fluido en el sentido axial está dado por:

donde:
Q = Gasto volumétrico [L3/t]
A = Área de flujo [L2]
vz= Velocidad de la partícula en el sentido axial [L/t]
 DISEÑO DE CENTRIFUGA TUBULAR
El área de flujo es igual a la sección transversal de la capa anular del fluido y está dada por:

R1= Distancia radial del eje de giro a la superficie del líquido

R0 = Distancia del eje de giro a la pared del tazón

Con los límites de integración adecuados se puede obtener el tiempo de residencia de las partículas dentro de la centrífuga

L = Longitud de la centrífuga
tr= tiempo de residencia de la partícula

Integrando
 TIEMPO DE SEDIMENTACIÓN Y GASTO VOLUMÉTRICO

a) 100% de sedimentación
El tiempo de sedimentación ts de una partícula localizada en la superficie de la capa anular del fluido en R1
(que es la más alejada de la pared, o más difícil de sedimentar), puede ser obtenida de la Ley de Stokes
considerando el movimiento de la partícula en el sentido radial,

En este caso inicialmente la partícula se localiza en R1 y en el momento ts de alcanzar la pared en R0, de tal
manera que:

Integrando tenemos:
Expresando la ecuación anterior en términos de vg:

La condición de diseño donde el tiempo de sedimentación debe ser menor o igual al tiempo de residencia se
obtiene igualando las ecuaciones respectivas. Este resultado permite obtener una expresión para el gasto
manejable en una centrífuga tubular para producir un líquido claro o lograr un 100% de sedimentación.

Es importante hacer notar que le flujo es función de las propiedades del caldo contenidas en vg, y de las características
de la centrífuga contenidas en el paréntesis cuadrado de la derecha.
 DISEÑO DE CENTRIFUGA TUBULAR
a) 50% de sedimentación
Es una práctica común en las bioseparaciones sólido-líquido, el que los equipos se especifiquen para la remoción del
50% de las partículas de una suspensión de un tamaño dado o tamaño de corte. Haciendo un desarrollo similar
obtenemos el tiempo de sedimentación, t’s

Por lo tanto, el flujo, Q’, es el flujo para sedimentar el 50% de las partículas de diámetro d50 en una centrífuga tubular
 FACTOR SIGMA
Ha sido muy utilizado en el campo de la sedimentación centrífuga desde que éste fue desarrollado. Sigma es un área característica de cada
tipo de centrífuga y se utiliza para efectuar comparaciones y escalamiento de equipo.

En el caso de la centrífuga tubular el valor de Sigma puede ser definido a partir de la ecuación anterior de la siguiente forma:

Donde

Sigma es una constante que contiene sólo parámetros

relacionados a la geometría de la centrífuga y su
velocidad angular (es independiente del tipo de caldo)
Lo s product os biot ec no ló gic os q ue se pueden ex tr ae r de un proceso
p u e de n ser :

Productos Intracelulares
Productos
Extracelulares -Mayoría de proteínas eucarióticas
recombinantes producidas por m.o.
procariotas (pueden estar activas o
-Antibióticos desnaturalizadas –cuerpos de inclusión-)
-Enzimas extracelulares -Lípidos
-Muchos polisacáridos -Algunos antibióticos
-Mayoría de aminoácidos

Esteroides Biomasa
(Se extraen sin romper)
• El proceso de recuperación del producto de los caldos de fermentación empieza generalmente
con la separación de las células.
• La siguiente etapa depende de la localización del producto deseado: intra o extracelular.
• La técnica de ruptura celular determina el tamaño de los desechos resultantes (los cuales influirán
en la purificación-viscosidad) y depende de la estructura externa del tipo de m.o. (membrana y
pared celular).
• Los métodos más drásticos: ruptura completa de la célula.
• Los métodos menos severos: alteración química de la cubierta o permeabilización celular.
 ASP ECTOS F U N DAMEN TALES PAR A L A OP E R ACI ÓN D E R OMPIMIEN TO

• ESTRUCTURA DE LA PARED CELULAR

-Bacterias (gram +, gram -), Levaduras

• SISTEMAS CELULARES DE SECRECIÓN Y MODIFICACIÓN POST-TRADUCCIONAL (células

recombinantes de mamifero)
Movimento de un soluto (proteína) a través de la membrana cellular (célula de ovario de hamster para
obtener activador plasminógeno tisular (agente trombolítico) , conlleva riesgos carcinogénicos, los cuales
se reducen si se usa E.coli, pero con riesgos inmunológicos.

• MÉTODOS DE RUPTURA CELULAR

-Químicos
-Mecánicos
• MÉTODOS DE PERMEABILIZACIÓN CELULAR (igual al anterior, pero mas leves)

-Alterar la estructura de la pared celular y la membrana celular para facilitar la difusión al exterior.

-Liberar proteínas localizadas en espacio periplásmico de Gram negativas mediante presión osmótica
controlada.

-Solubilización (estructura anfotera) de los lípidos de pared cellular proporcional a la concentración: solventes
como toluene 5%, detergentes anionicos (SDS); no iónicos (Triton X-100, formado por un alcohol), agentes
caotrópicos (guanidine y urea), agentes quelantes (EDTA).

- Los jabones (sales de acidos grasos) solo son efectivos a pH altos para que el grupo carboxilo este
ionizado, pero en aguas duras se forman precipitados. Los sulfonatos (unidos a un anillo bencénico) son
mas efectivos que los sulfatos y no son degradados por m.o., biosurfactantes.

-Libera menos proteína por unidad de tiempo, pero es muy económica.

-Ejemplos: Liberar 50% de proteína intracellular de E.coli, usando guanidine 0.1M y Triton 0.5% (ej. Beta-
lactamase)
 EST RU CTU RA DE L A PARED CELU L AR BACTE RIANA
-Son rígidas y porosas debido a su alta presión osmótica interna, ambas tienen un rígido
esqueleto de peptidoglicano o mureína, constituida de un disacárido de N-acetil-D-
glucosamina y el ácido N-acetilmurámico

La capa de peptidoglucano se enlaza

covalentemente a las lipoproteinas de
pared celular.
El peptidoglucano de pared celular
formado por D-aa (ala y glutamine) es
resistente a las enzimas hidrolíticas.
-Molinos de perlas

La lizosima hidroliza enlaces

glucosídicos del peptidoglucano,  la Constituido de un gel de
célula se expande, se rompe la enzimas degradativas y
membrana y libera el contenido celular proteínas de transporte
 ROMPIMIENTO CELU LAR La pared celular de levaduras consta de dos
capas: una externa formada de manano-proteína
y una interna de glicano.

Solo algunas células tienen

mecanismos de secreción
celular del producto de
ínteres
 ROMPIMIENTO CELULAR
Ruptura Celular de Saccharomyces cerevisiae

Antes de la ruptura celular Después de 2 pasos a 1000 bar

ROMPIMIENTO CELULAR
 ROMPIMIENTO CELULAR

Elección del método de ruptura

✓ Naturaleza de la fuente de la enzima
✓ Escala de la operación
✓ Velocidad del método de extracción
✓ Estabilidad del enzima
✓ Pureza requerida
✓ Costo del proceso
(Se en añade 10% en peso de la biomasa. El tolueno es absorbido por los lípidos de la pared celular,
provocando su expansión y ruptura)
-El benceno es más cancerígeno y más volátil.
-Los solventes no deben disolver el producto de interés

(Puede inhibir actividades biológicas)

 MÉTODOS MECÁNICOS
• Gran escala
• Dificultades
- resistencia mecánica de las paredes celulares
-  tamaño de m.o. (1-10 m)
- Requiere dos o más pasos para aumentar la ruptura al 90%.
- Requiere controlar el tamaño de los restos celulares debido al posterior proceso de separación
-Generación de calor, lo cual puede dañar al producto final (ej. Desnaturalizar proteínas)
• Molienda húmeda en molinos de perlas agitados a alta velocidad (esfuerzo de corte sólido)
• Homogeneización a alta presión (esfuerzo de corte líquido)
• Microfluidizadores
RUPTURA CELULAR

CEBI_E8 Angélica Morales

RUPTURA CELULAR

UNIDAD 2

CEBI_E9 Angélica Morales

PROCESO GENERAL

Cual es el Selección del

Que clase de
producto que método de
célula se quiere
queremos disrupción celular
destruir?
extraer? a emplear

Evaluación acerca
Puesta a punto
de los
Conclusiones del método
rendimiento
seleccionado
obtenidos

CEBI_E8 Angélica Morales

MÉTODOS QUÍMICOS Y BIOLÓGICOS

Químicos Biológicos
 Álcalis
 Enzimas
Solventes
 Fagos
Detergentes
 Virus
Ácidos

Sustancias caotrópicas

CEBI_E8 Angélica Morales

MÉTODOS FÍSICOS

No Mecánicos Mecánicos

 Shock osmótico  Sonicado

Congelamiento y descongelamiento Extrusión
Expansión de gas Choque
Secado Agitación con abrasivos
Homogenización de alta presión

CEBI_E8 Angélica Morales

Clasificación de métodos de
ruptura celular….

CEBI_E8 Angélica Morales

Factores que influyen en el método
de ruptura

Dependientes del Dependientes del

microorganismo producto

 Medio de cultivo: Complejos y

 Sensibilidad al calor
resistentes a la ruptura.
Sensibilidad al shear: Fuerza de corte
 Tipo de microorganismo: Ej: Gram +
Localización
 Estado fisiológico.

 Tamaño

 Forma

 Velocidad de crecimiento: Ej: En

estado estacionario son más resistentes

CEBI_E8 Angélica Morales

Composición de la pared celular

BACTERIAS GRAM POSITIVAS:

POSITIVAS:
• Peptidoglicanos.

BACTERIAS GRAM NEGATIVAS:

• Capa Externa: fosfolípidos, lipoproteínas, proteínas → Detergentes, EDTA
• Capa Interna: Pep doglicano → Lisoenzimas

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Composición de la pared celular
LEVADURAS:
LEVADURAS:
• Capa Externa: Proteína manano → Proteasas, manonasas.
• Capa Interna: Glucano → glucanasa.

• Estructura muy gruesa (100-200nm)

• Representa del 15-25% del peso celular en masa seca
• Compuesto por dos capas de polisacáridos, una capa
interna transparente y una amorfa, constituida
principalmente de b-1,3 y b 1,6- glucanos.

HONGOS
• Capa Externa: glicoproteinas y b glucanos.
• Capa Interna: Chitin / microfibrinas

Proteasas : Degradan las proteínas de

interés, pero son específicas de cada
microorganismo.

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Problemas de la ruptura celular
excesiva

 DISMINUCIÓN DEL TAMAÑO DE LOS DESECHOS CELULARES:

CELULARES

• Dificultad en la separación.

 LIBERACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS:

• Aumento en la viscosidad del homogenato.

• Dificultad en la separación de los desechos celulares.

• “Envenenamiento” de matrices cromatográficas.

• Agregación de proteínas: Pueden pptar.

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 Eliminación de ácidos nucleídos

 Degradación:

Nucleasas (Benzonase)

 Precipitación:

Polímeros de carga positiva (PEI)

↓
Igualación de carga → Ppta.

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HOMOGENIZADOR DE ALTA PRESIÓN

Los homogenizadores de alta presión han sido utilizados

como herramientas de disrupción de células microbianas
durante muchos años.

Con la excepción de microorganismos filamentosos, el

método ha sido generalmente usado con éxito en
muchas variedades de bacterias, levaduras y micelas
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Homogenizador de Alta Presión…
Este tipo de homogenizador trabaja forzando las células en suspensión a través de un
canal estrecho o un orificio bajo presión.

Se aplica una elevada presión a una suspensión de células forzándolas a través de una
válvula, sometiéndolas a un alto estrés de corte (shear), rompiendo las membranas.

La disrupción ocurre por la combinación de fuerzas de corte en la región de la válvula,

cavitación (debido a las regiones de baja presión generadas) y al impacto con el anillo
anillo..

Gaulin CD Valve

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Homogenizador de Alta Presión…
Los parámetros de operación con un efecto en la eficiencia de los
homogenizadores de alta presión son :

• Presión
• Temperatura
• Numero de pasajes
• Válvula e anillo de impacto
• Flujo

Rm = Cantidad máxima de producto librado.

R = Cantidad de producto liberado luego de N pasos.
Ln Rm = k . N . Pa K = Cte. de ruptura celular (Depende del T y tipo de mØ)
Rm-R N = No. de pasajes.
P = Presión a la que es sometida la suspensión celular.
a = Depende del estado metabólico del mØ y del mØ.

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 Homogenizador de Alta Presión…

Tolva alimentación

Descarga

Manómetro Intercamb. Presión máxima de funcionamiento 2000 bar

de calor 29000 psi
200 MPa
Conjunto
actuador de Capacidad nominal 11 L/h
la válvula Tamaño mínimo de la muestra 100ml
Volumen retención aproximado 13ml
Pistón tubular Cerámica-
10mm
Válvula homogenizante. Conjunto de válvulas
Aro de choque del homogenizantes 70rpm
asiento de la válvula Asientos de válvulas de bombas Carburo de
tungsteno
Homogenizador de Alta Presión…
Resultados: PRuptura = 800 bar

No. De Flujo Temperatura Concentración de

Muestra t (min) DO600
Pasos (N) (ml/min) Entrada Salida proteína (mg/ml)
0 CRX0 - - - 11,98 0,859
1 CRX1 10 200 10 16 2,26 2,836
2 CRX2 11 205 14 17 1,13 3,086
3 CRX3 11 215 14 20 0,858 3,174
4 CRX4 11 220 15 20 0,808 3,215

Muestra cruda

Pellet SN
(Proteína de Interés)
Influencia de la presión sobre el
porcentaje de ruptura…
Efecto de la presión de operación sobre la eficiencia de la disrupción durante un
proceso en homogenizador de alta presión.

Percentage Disrupted
Microorganism Enzyme
55 MPa 130 MPa
E. Coli Fumarase 79 97
B. Cereus L-Leucine DH 62 91
L. Confusus L-2-hidroxysocaprost DH 52 94
S. Cerevisiae D-glucose-6- phosphate DH 39 89
C. Boidinii Formate DH 32 77

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Homogenizador de Alta Presión…
Los parámetros de operación con un efecto en la eficiencia de
los homogenizadores de alta presión son :

• Presión
• Temperatura
• Numero de pasajes
• Válvula e anillo de impacto
• Flujo

Rm = Cantidad máxima de producto librado.

Ln Rm = k . N . Pa R = Cantidad de producto liberado en N número de
Rm-R pasajes.
k = Cte. de ruptura celular (Depende del T y tipo de mØ).
N = No. de pasajes.
P = Presión a la que es sometida la suspensión celular.
a = Depende del estado metabólico del mØ y del mØ.

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MOLINO DE BOLILLAS

Consiste en un agitador a discos

montado sobre un motor central
que gira en una cámara central, la
cual esta cargada con esferas de
vidrio, metal, cerámica u otro
material.

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Molino de Bolillas (Bead Mill)…
1. Pintura
2. Farmacéutica: hormonas, microcristales
3. Biotech

• Vidrio
Encamisado con líquido • Cerámica
refrigerante
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Molino de Bolillas (Bead Mill)…

Características:
• Un solo pasaje a través del equipo.
• Presión ambiente.

Consideraciones:
• Tamaño de las esferas (0,2-15mm)
• Cantidad y material de las esferas
• Velocidad de agitación
• Temperatura de trabajo
• Velocidad de flujo
• Concentración de la suspensión

Rm = Cantidad máxima de producto librado.

R = Cantidad de producto liberada en t.
Ln Rm = k . t
k = Cte. de ruptura celular (Depende del T y tipo de mØ)
Rm-R
t = tiempo de residencia en función del flujo de la
suspensión celular.

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Dependencia de la constante

Homogenizador de Alta Molino de bolillas

Presión
 Velocidad de agitación:
> u de giro → > probabilidad de choque
 Temperatura
 Concentración de células: 50-60%
 Tipo de microorganismo 70% de la capacidad del equipo.

Concentración de células:  Concentración de bolillas:

Ej : Masa Seca = 10g/L 30% de la capacidad del equipo.

 Diámetro de bolillas:
+ pequeño mejor → Sin perdidas.

 Temperatura

 Tipo de microorganismo
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MÉTODOS QUIMICOS
Tratamiento con solventes orgánicos (Cloroformo, tolueno)
Los solventes orgánicos permeabilizan las membranas celulares disolviendo
componentes hidrofóbicos de la pared, como los fosfolípidos de la membrana interna
en las bacterias Gram (-).

Tratamiento con álcalis (Hidróxido de sodio e hipoclorito)

Se produce la saponificación de los lípidos de las membranas
membranas. Es una técnica severa
pero efectiva y de bajo costo, siempre y cuando el producto de interés sea resistente
a la degradación a pH elevados.

Agentes Caotrópicos (Urea, clorhidrato de guanidina)

Interfieren con los enlaces no covalentes ( puentes de hidrogeno, fuerzas de van der
Wall) desorganizando la estructura del agua haciéndola menos hidrofilia, debilitando
las interacciones soluto-soluto

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Métodos Químicos…
Agentes Quelantes (EDTA)
Este agente quela los iones Ca2+ y Mg2+ que unen a
los LPS adyacentes haciendo que se liberen parte de
los LPS conteniendo proteínas y fosfolípidos de la
membrana (Gram-).

Tratamiento con detergentes

Debido a que son anfipáticos forman micelas con
los lípidos de las membranas
membranas, desestabilizándolas.
Se clasifican en : catiónicos (Sales de tetra-aquil-
amonio, pH básico), aniónicos (SDS, pH ácido) y no-
iónicos (Triton-X)

Antibióticos
Son efectivos contra bacterias Gram (-). Diferentes
antibióticos causan lisis por distintos mecanismos.

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MÉTODOS FÍSICOS

Shock osmótico
El estrés osmótico es generado cuando las
células son situadas en medio
hiper/hipotónico.
hiper/hipotónico

Congelamiento/Descongelamiento
Los cristales de hielo que se forman y crecen
durante el congelamiento, rompen
mecánicamente la integridad del interior de la
membrana celular, haciéndola permeable.

La congelación rápida lesiona más

específicamente las membranas celulares
produciendo la lisis celular.

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Métodos físicos…
Descompresión
Proceso por el cual las células se mezclan con un gas presurizado por un tiempo
específico. El gas entra en las células y luego al liberar la presión aplicada el mismo se
específico
expande causando la disrupción.

Termólisis
Las células son llevadas a mayores temperaturas con el fin de romper o debilitar la
membrana externa

Sonicador
Disruptor Celular
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MÉTODOS ENZIMATICOS
 Método muy preciso

 Requiere del la compresión precisa de la estructura de las

paredes celulares que se desean romper.

 Elevado costo (Técnica muy especifica)

VENTAJAS
No requiere equipos especiales
Liberación más selectiva del producto
Condiciones de operación menos agresivas
La inmovilización puede ser una herramienta
útil para reducción de costos
DESVENTAJAS
Se requiere enzimas diferentes para cada
microorganismo (≠ componentes en la
pared celular)
La enzima que se utiliza se pierde (Costo
adicional)

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Métodos enzimáticos…
Autolisis
Proceso por el cual las células inducen su propia destrucción. Se produce la activación
de señales que activan la liberación de enzimas que degradan las organelas y las
membranas de las mismas células.

El mecanismo es lento, por lo que se transforman las cepas con el fin de hacer los
sistemas autolíticos mucho más activos (Introducción de genes que codifican
antibióticos y enzimas que degraden más rápida mente los componentes celulares) ó
con inductores de la autólisis.

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