INVESTIGACIÓN DE PATÓGENOS

PRÁCTICA 1. DETECCIÓN DE Salmonella sp. ANÁLISIS DE

MAYONESA (ISO 6579)
Material y medios de cultivo
- Muestra de mayonesa
- Balanza
- Cuchara metálica
- Alcohol
- Pipetas de 10 ml
- Asas de platino
- Frasco estéril de 50 ml
- 25 ml de agua de peptona tamponada
- Tubos con 10ml de caldo Rappaport Vassiliadis
- Placas con agar XLD o SS
- Reactivo MUCAP
- Lámpara de luz UV
- Estufa a 43°C
- Estufa a 37°C
Agua de peptona tamponada

Componente Concentración (g/l)

Peptona de caseína 10
Cloruro sódico (NaCl) 5
Hidrógeno fosfato disódico
9
dodecahidratado (Na2HPO4.12H20)
Dihidrógeno fosfato potásico (KH2PO4) 1,5

pH 7,0
Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15min.
Caldo Rappaport Vassiliadis

Componente Concentración (g/l)

Peptona de caseína 4
Peptona de soja 1
Cloruro magnésico hexahidratado (MgCl.6 H20) 29
Cloruro sódico (NaCl) 8
Hidrógeno fosfato dipotásico (K2HPO4) 0,4
Dihidrógeno fosfato potásico(KH2PO4) 0,6
Verde malaquita 0,036

pH 5,5
Esterilizar en autoclave a 115°C durante 15min.

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Agar SS

Componente Concentración (g/l)

Peptona 10

Lactosa 10

Sales biliares 8,5

Citrato sódico 10
Tiosulfato sódico 8,5
Citrato férrico 1
Verde brillante 0,0003

Rojo neutro 0,025

Agar 12

pH 7
Esterilizar en autoclave a 115°C durante 15min.

Métodos
Día 1: Pre-enriquecimiento
Realizar un homogeneizado en agua de peptona tamponada. Pesar 2,5g
asépticamente en un recipiente estéril y añadir 25ml de agua de peptona
tamponada. Incubar a 37°C durante 24h.
Día 2: Enriquecimiento selectivo
Transferir 1ml del homogeneizado a tubos con 10ml de caldo Rappaport-
Vassiliadis (RP). Incubar a 43°C durante 24h.
Día 3: Aislamiento
Sembrar por estrías en placas de agar SS a partir de los tubos con
crecimiento en la fase de enriquecimiento. Incubar a 37°C durante 24h.
Día 4: Confirmación
Las colonias típicas crecidas en agar XLD (rojas con o sin centro negro)
se confirman empleando el reactivo MUCAP (sustrato de la caprilato esterasa).
Añadir una gota del reactivo sobre una colonia típica y observar bajo luz
ultravioleta, las colonias que presentan fluorescencia serán confirmadas como
Salmonella.

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INVESTIGACIÓN DE MICROORGANISMOS INDICADORES

PRÁCTICA 2. RECUENTO DE MICROORGANISMOS MESÓFILOS

TOTALES (ISO 4833)
Material y medios de cultivo
- Muestra de carne picada
- Balanza
- Cuchara metálica
- Alcohol
- Pipetas de 10 ml
- Asas de platino
- Stomacher
- Bolsas estériles de Stomacher
- Tubos con 9 ml de solución salina
- Batería de diluciones en solución salina (10-1, 10-2 y 10-3)
- Tubos con 15 ml de medio de cultivo plate count agar (PCA) en sobrefusión
- Batería para tinción de Gram
- Baños a 45ºC
- Estufa a 37°C

Solución salina
0,85% (p/v) NaCl, pH 7,2
Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15min.

Plate count agar

Componente Concentración (g/l)

Peptona de caseína 5
Extracto de levadura 2,5
Dextrosa 1
Agar 9

pH 7,0
Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15min.

Métodos
Día 1
Preparación de la muestra:
Realizar un homogeneizado en agua de peptona tamponada. Pesar 1 g
asépticamente en una bolsa de plástico estéril (especial para el homogeneizador),
añadir 9 ml de solución salina estéril. El triturado de la muestra se realiza al
menos durante 2 minutos.
Realizar diluciones seriadas decimales (hasta dilución 10-3) en tubos con
9 ml de solución salina. Agitar.

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Siembra:
Pipetear 1 ml/dilución a una serie de tres tubos con medio PCA fundido y
atemperado a 45ºC (10-1, 10-2 y 10-3). Verter en cada placa e incubar durante 24-
72 h a 37ºC. Cálculo de ufc/g. Tinción de Gram de colonias con diferentes
morfologías.
Nota: n=5 (número de unidades que componen la muestra); c=2 (número de
muestras que dan valores entre m y M); m= 5x105 ufc/g; M=5x106 ufc/g.

PRÁCTICA 3. RECUENTO DE Enterobacteriaceae (ISO 21528)

Material y medios de cultivo

- Muestra de leche
- Pipetas de 10 ml
- Asas de platino
- Batería de diluciones de solución salina (10-1, 10-2 y 10-3)
- Tubos con 15 ml de medio de cultivo violeta, rojo, bilis, lactosa (VRBL) en
sobrefusión
- Placas de agar nutritivo
- Baños a 45ºC
- Estufa a 37°C
- Reactivo de oxidasa
- Papel de filtro estéril
- Batería para tinción de Gram
Violeta, rojo, bilis, lactosa

Componente Concentración (g/l)

Peptona de caseína 7
Extracto de levadura 3
Cloruro sódico (NaCl) 5
Sales biliares 1,5
Lactosa 10
Rojo neutro 0,03
Cristal violeta 0,002
Agar 12

pH 7,0

Llevar a ebullición con agitación frecuente. No autoclavar. Enfriar a 45-50ºC,

mezclar y verter en tubos estériles.

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Agar nutritivo

Componente Concentración (g/l)

Peptona 10
Extracto de levadura 5
Cloruro sódico (NaCl) 5
Agar 15

pH 7,0

Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15min.

Métodos
Día 1
Realizar diluciones seriadas decimales (hasta dilución 10-3) en tubos con
9 ml de solución salina. Agitar.
Siembra:
Pipetear 1 ml/dilución a una serie de tres tubos con medio VRBL fundido
y atemperado a 45ºC (10-1, 10-2 y 10-3). Verter en cada placa e incubar durante
24 h a 37ºC.
Día 2
Cálculo de ufc/ml. A partir de una colonia típica sembrar en una placa de
agar nutritivo incubar durante 24 h a 37ºC.
Nota: n=5 (número de unidades que componen la muestra); c=2 (número de
muestras que dan valores entre m y M); m<1 ufc/ml; M=5 ufc/ml.
Día 3
Realizar prueba de oxidasa y tinción de Gram.