Efecto inhibidor de mangle colorado (Rhizophora mangle) y mangle caballero

(Rhizophora harrisonii) en polifenol oxidasa de plátano (Musa acuminata colla)

RESUMEN
La postcosecha del plátano está acompañada de múltiples reacciones enzimáticas causantes
de la degradación de almidones y clorofila, de la síntesis de azúcares y carotenos, y de los
cambios en la acidez, ablandamiento de tejidos y pardeamiento enzimático.
El color es una característica de valoración física y de calidad en los alimentos; en
innumerables pruebas se ha comprobado que cuando el color de un alimento cambia sin
alterar su forma, aroma u otros atributos de textura, se obtienen una respuesta de rechazo
por parte de los consumidores.
Se estudiarán los efectos inhibidores de dos plantas costeras Mangle colorado (Rhizophora
mangle) y Mangle caballero (Rhizophora harrisonii) sobre la polifenol oxidasa del plátano
morado (Musa acuminata colla) basados en la oxidación del pirocatecol. Esperando una
mejor inhibición por Mangle colorado debido a sus características antioxidantes.
JUSTIFICACIÓN
Han sido detectadas cinco reacciones como las responsables del cambio de color en frutas y
vegetales frescos: Pardeamiento u oxidación enzimática de polifenoles, reacciones de
Maillard, oxidación de ácido ascórbico, caramelización y formación de polímeros oscurecidos
por la acción oxidativa de lípidos. Siendo de interés la reacción del pardeamiento u oxidación
enzimática.
El objetivo de este trabajo consiste en la evaluación de la inhibición del pardeamiento
enzimático en musa acuminata colla usando Rhizophora mangle y Rhizophora harrisoni,
comparándolos con ácido ascórbico y dopamina que en la literatura se ha reportado como
inhibidor parcial sobre la pulpa de plátano.
OBJETIVOS
Estudiar los efectos inhibidores de dos plantas costeras Mangle colorado (Rhizophora
mangle) y Mangle caballero (Rhizophora harrisonii) sobre la polifenol oxidasa del plátano
morado (Musa acuminata colla) basados en la oxidación del pirocatecol.
MARCO TEÓRICO
Han sido detectadas cinco reacciones como las responsables del cambio de color en frutas y
vegetales frescos: Pardeamiento u oxidación enzimática de polifenoles, reacciones de
Maillard, oxidación de ácido ascórbico, caramelización y formación de polímeros oscurecidos
por la acción oxidativa de lípidos. Siendo de interés la reacción del pardeamiento u oxidación
enzimática.
Las enzimas catalíticas del pardeamiento enzimático pertenecen a las óxido-reductasas,
conocidas como: monofenol oxidasa, tirosinasa y fenolasa. La fenolasa es la más aceptada,
su nombre es o-difenol-óxido-reductasa y se conoce como PPO.
La intensidad de oscurecimiento actúa en función de la actividad de la fenolasa y de la
concentración de los polifenoles que sirven de sustrato.
La PPO cataliza el paso inicial de la oxidación de o-fenoles a o-quinonas, en los cuales la
polimerización producirá pigmentos insolubles y oscuros llamadas melaninas de color.
Los inhibidores del pardeamiento son clasificados según su modo se acción en seis
categorías: agentes reductores, quelantes y acomplejantes, inhibidores de enzimas,
tratamientos enzimáticos y atrapadores de oxígeno singulete.
REACCIONES ÓXIDO-REDUCCIÓN
Las reacciones de óxido-reducción son comunes en los sistemas biológicos y también en los
alimentos. La oxidación se produce cuando un átomo o grupo de átomos ceden electrones.
De forma simultánea, se produce la correspondiente reacción de reducción que implica la
captación de electrones por otro átomo diferente o grupo de átomos.
PARDEAMIENTO ENZIMÁTICO
El pardeamiento enzimático está relacionado con la oxidación de compuestos fenólicos en
presencia de oxígeno, dichos compuestos se encuentran localizados principalmente en las
vacuolas y son catalizados por la enzima polifenol oxidasa (PPO) localizada en el citoplasma.
La tendencia de plantas a cambiar de color (oscurecerse) resulta de la acción de diversos
factores, tales como, la actividad enzimática, la naturaleza y el contenido del sustrato
oxidable. Todos estos factores varían con el tiempo de maduración de las frutas y vegetales,
su estado fisiológico, la variedad y los tratamientos a los que son sometidos.
PPO
Dependiendo su especifidad sobre sus sustratos, se pueden agrupar en tres tipos de enzimas:

• Cresolasa
• Catecolasa o fenolasa
• p-difenoloxidasa o laccasa
Dependiendo del sustrato sobre el que actúa, hay dos clases de actividades enzimáticas:

• Cresolasa. Cuando hidroxila monofenoles

• Catecolasa. Cuando oxida difenoles a quinonas.
La característica estructural más importante de esta enzima es la presencia de dos iones de
cobre (Cu+1), en su centro activo, unidos cada uno de ellos a dos o tres histidinas. En su
entorno se sitúa una serie de aminoácidos hidrofóbicos, con anillos aromáticos importantes
para la unión de los sustratos.
La actividad enzimática de la PPO puede variar dependiendo: pH óptimo, latencia,
especificidad por el sustrato.

MECANISMO DE PARDEAMIENTO ENZIMÁTICO

Las reacciones de formación de quinonas involucran compuestos fenólicos tipo flavonoides
y no fenólicos.
Etapas:
1. Hidroxilación de monofenoles a o-difenoles. La enzima liga primero el oxígeno y
después el monofenol, es la etapa determinante de la reacción.
2. Se produce un cambio de valencia (Cu1+ Cu2+) y se forma un complejo en el que el
enlace O-O está tan polarizado que se produce la hidroxilación hasta o-difenolilos.
3. Oxidación del o-difenol hasta quinonas.
 Mecanismo de oxidación

CONTROL DEL PARDEAMIENTO.

El control del pardeamiento sigue siendo un reto en la industria de frutas y vegetales.
Diferentes métodos para el control del pardeamiento enzimático como los tratamientos
físicos (térmicos, desecación o disminución de la a w, congelación, refrigeración, etc.) y
químicos (adición de inhibidores y otros aditivos) son aún objeto de investigación.
Estas formas de control pueden dividirse en tres clases dependiendo del factor que ataquen,
la enzima, el sustrato o productos de la reacción.

Acción sobre la enzima

Tratamientos frecuentes en frutas: Acidificación, alcalinización y tratamientos térmicos.
La alcalinización no puede ser aplicada a compuestos fenólicos por su alta sensibilidad a la
oxidación a pH alcalinos.

La acidificación resulta sumamente compleja a menos que sea a pH muy bajos. La PPO
muestra su actividad óptima a un pH entre 5 y 7, la enzima parece relativamente sensible a
pH ácidos.
Acción sobre los sustratos

La remoción completa del oxígeno es una forma muy satisfactoria para el control de la
oxidación fenólica catalizada por la PPO, sin embargo, no puede ser aplicado a tejidos vivos
porque causa condiciones anaeróbicas y no son aceptables en productos frescos.
Sustratos fenólicos

1. Eliminación física por adsorbentes específicos como la ciclodextrina

2. Modificación enzimática usando o-metil-transferasa

Acción sobre productos

Las o-quinonas pueden ser reducidas a o-difenoles o pueden reaccionar con otros
compuestos y formar complejos no coloreados.
Compuestos reductores más usados: ácido ascórbico, sulfitos, tioles como la cisteína y los
aminoácidos.

CLASIFICACIÓN DE INHIBIDORES

El uso de inhibidores es restringido teniendo en cuenta la toxicidad, el efecto sobre las

características organolépticas y el costo. Los inhibidores de pardeamiento se clasifican según
el modo de acción en seis categorías:

1. Agentes reductores: agentes sulfhídricos, ácido ascórbico y su análogos, cisteína,

glutatión, etc.
2. Acidulantes: ácido cítrico y fosfórico
3. Agentes quelantes: fosfatos, EDTA, ácidos orgánicos, etc.
4. Agentes acomplejantes: ciclodextrina
5. Inhibidores de enzimas: ácidos carboxílicos aromáticos, alcoholes alifáticos, péptidos,
resorcinol sustituido.
6. Tratamientos enzimáticos: oxigenasas, o-metil transferasas, proteasas.
Agentes reductores
Previenen el pardeamiento enzimático por la reducción de o-quinonas a o-difenoles no
coloreados o al reaccionar irreversiblemente con o-quinonas para formar productos no
coloreados más estables.

• Derivados de azufre (representan riesgo para la salud)

• Ácido ascórbico (permite el pardeamiento posteriormente)
• Cisteína (efectos negativos sobre el sabor)
Acidulantes
Son aplicados para mantener el pH por debajo del punto óptimo de actividad catalítica de la
enzima. Son usados frecuentemente con otros antioxidantes.
 • Ácido cítrico, málico y fosfórico
Agentes quelantes
Los agentes quelantes remueven los iones de metales que poseen las enzimas en su sitio
activo desactivando la enzima.
Agentes acomplejantes

La cavidad central de la ciclodextrina es hidrofóbica y su región externa es hidrofílica, debido

a la presencia de grupos hidroxilos primarios y secundarios.

Tiene la habilidad de la inclusión de moléculas dentro del núcleo hidrofóbico o ligeramente

apolar.

PLANTAS FENÓLICAS COMO ANTIOXIDANTES NATURALES

La mayoría de los antioxidantes naturales se encuentran en plantas, frutas y vegetales.
Los antioxidantes fenólicos de plantas comúnmente incluyen componentes flavonoides,
derivados de ácido cinámico y tocoferoles. Muchos compuestos fenólicos son buenos
sustratos del pardeamiento y buenos antioxidantes como las catequinas; por el contrario, los
flavonoles no son buenos sustratos de pardeamiento, pero sí antioxidantes muy activos.
Las fuentes naturales de las plantas antioxidantes se encuentran en sus diferentes órganos,
tales como las semillas, frutas, hojas, corteza, entre otros.
Las plantas con contenido de fenoles y algunos de sus productos de degradación son
multifuncionales y pueden actuar como agentes reductores, reaccionantes con radicales
libres, quelantes y atrapadores de oxígeno singulete.
MANGLARES
Los manglares son una formación vegetal leñosa, densa, arbórea o arbustiva de 1 a 30 metros
de altura, compuesta de una o varias especies de mangle y con poca presencia de especies
herbáceas y enredaderas.
En México predominan cuatro especies de mangle (Rhizophora mangle, Laguncularia
racemosa, Avicennia germinans y Conocarpus erectus). Aunque existen dos especies más
(Avicennia bicolor y Rhizophora harrisonii) con una distribución restringida en el estado de
Chiapas. Estas especies se pueden encontrar formando asociaciones vegetales o en bosques
monoespecíficos.
ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE
La actividad antioxidante es ampliamente usada como parámetro para caracterizar
diferentes materiales vegetales, está relacionada con compuestos capaces de proteger un
sistema biológico del efecto potencialmente dañino de procesos que causan excesiva
oxidación involucrando especies reactivas del oxígeno, otros se basan en la oxidación-
reducción de iones metálicos y la capacidad de una muestra para atrapar radicales libres.
1. Método TEAC, Trolox Equivalent Antioxidant Capacity Assay. Uno de los más usados
para la determinación de la capacidad antioxidante total. Se basa en la cuantificación
de la decoloración del radical ABTS.
2. Método FRAP, Ferrico Reducing/Antioxidant Power. Evalúa la capacidad antioxidante
de una muestra de acuerdo con su capacidad para reducir el FE+3 presente en un
complejo con un compuesto orgánico: Tripyridyltriazine (TPTZ).
3. Método DPPH,

MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

La medición de la actividad enzimática de la PPO está dada por su cinética; de esta forma se
puede evaluar su disminución o inhibición del pardeamiento enzimático en presencia de los
antioxidantes sintetizados.
Cinética.
La medida de la cinética enzimática es de interés por dos razones principales:

• Para caracterizar una enzima individual y proveer datos acerca del funcionamiento
de la enzima bajo diferentes condiciones fisiológicas.
• Para proveer información acerca del mecanismo de catálisis
Actividad. La velocidad a la cual una enzima cataliza una reacción. Puede ser medida por la
velocidad de formación de productos o desaparición de reactivos en presencia de una
cantidad de enzima dada.
Para el análisis de reacciones enzimáticas, sólo se utiliza la velocidad inicial de reacción, que
es la velocidad ejercida por la enzima, inmediatamente después de que se ha puesto en
contacto con el sustrato y hasta antes de que se haya consumido el 10% de la concentración
inicial del mismo, esto porque la concentración del producto es muy pequeña y su
transformación en el sustrato original puede ser ignorada. Se puede ajustar al modelo de
Michaelis-Menten.
Cinética enzimática en presencia de un inhibidor.
Una gran variedad de compuestos naturales y sintéticos tienen la capacidad de unirse
reversible e irreversiblemente a enzimas específicas y alterar su actividad.
Inhibidores reversibles. Un compuesto que puede estar o no relacionado estructuralmente
con el sustrato natural se une reversiblemente con la enzima en o cerca al sitio activo; la
inhibición será competitiva entre el sustrato y el inhibidor. Los inhibidores competitivos son
comunes en la naturaleza.
Inhibidores no competitivos. Compuestos que se unen reversiblemente con la enzima o el
complejo enzima sustrato. Esta inhibición no es revertida completamente con el aumento de
sustrato, dado que el sitio de unión del inhibidor no es idéntico al sitio activo, ni modifica a
este directamente.
Inhibidores incompetitivos. Compuestos que se combinan reversiblemente solo con el
complejo enzima sustrato, pero no con la enzima libre. Esta inhibición no es superada con
altas concentraciones de sustrato.
MEDICIÓN DEL EFECTO INHIBIDOR
Mediante la medida de la velocidad enzimática para una variedad de concentraciones de
sustrato con presencia y ausencia de un inhibidor. El inhibidor sustancialmente reduce la
velocidad de la enzima a bajas concentraciones de sustrato, pero no la altera mucho a
concentraciones altas.
Inhibidores irreversibles
Un inhibidor irreversible forma un enlace covalente con un grupo funcional específico, por
lo general una cadena lateral de un aminoácido que, de alguna manera, se asocia con la
actividad catalítica de la enzima. No puede ser liberado por dilución o diálisis, sus efectos no
pueden ser revertidos simplemente al aumentar la concentración del sustrato. La velocidad
de reacción disminuye a un nivel que corresponde con la fracción de las moléculas de
enzimas que han sido inactivadas.

MÉTODOS PARA LA MEDICIÓN DEL PARDEAMIENTO ENZIMÁTICO.

Los métodos disponibles para determinar la susceptibilidad de pardeamiento son la
espectrometría de absorción o métodos de reflectancia. Las técnicas de absorción involucran
la medida espectrofotométrica sobre soluciones obtenidas después de separar los tejidos y
remover los sólidos. Tales medidas estiman los pigmentos solubles y suelen estar presentes
cerca de 400 nm, correspondientes a la absorción máxima del catecol. La medida de los
pigmentos polimerizados y solubles unidos a membranas puede ser evaluada por medidas
de reflectancia sobre la fracción insoluble.

• Método Pizzocaro
METODOLOGÍA
La metodología seguida en la síntesis y estudio del efecto inhibidor del pardeamiento
enzimático planeada es:
OBTENCIÓN DE EXTRACTOS (INHIBIDORES)

MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DEL EXTRACTO

Dos métodos productores de un radical orgánico y otro basado e la óxido-reducción de iones
metálicos.
I. DDPH. (Radical 2,2-difenil-1-picril hidrazilo)
Se llevará a cabo según el protocolo de Cavin.
o Muestra de análisis: 10 mL de extracto y 990 mL de la disolución DPPH
(20mg/L).Evaluada por cuadruplicado
o Referencia del reactivo: 10 mL del solvente de la muestra y 990 mL de DPPH
o Blanco: Reemplazar cromóforo por metanol.
o Leer absorbancia a 517 nm, luego de 30 minutos de reacción a temperatura
ambiente y en la oscuridad.
Cálculo del porcentaje de inhibición:
1 − (𝐴𝑏𝑠𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 − 𝐴𝑏𝑠𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 )
%𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 = [ ] × 10
𝐴𝑏𝑠𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 − 𝐴𝑏𝑠𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎

II. ABTS (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato de amonio)

o Radical ABTS: mezcla de reacción ABTS (3.5mM) y persulfato de potasio
(1.25mM) en agua destilada.
o Preparar mezcla de reacción 12hrs antes de su uso y mantener a temperatura
ambiente y ausencia de luz.
o Diluir en buffer fosfato a un pH de 7.4 hasta lograr absorbancia de 0.7
unidades a 734 nm.
o Evaluación de compuestos: 20mL de muestra y 980mL de la solución del
radical ABTS.
o Referencia del reactivo: 10 mL del solvente de la muestra y 990 mL de ABTS
o Medir absorbancia a 734nm, luego de 30 minutos de reacción a temperatura
ambiente y en la oscuridad.
III. FRAP (Ferric Reducing/Antioxidant Power).
o Se lleva a cabo en buffer acético-acetato de sodio 0.3M a un pH de 3.4, que
contiene TPTZ (1mM) y FeC3 (2mM).
o 900mL de solución, 50mL de muestra y 50mL de buffer acetato pH 3.6.
o Determinar la absorbancia a 593nm, después de 30 minutos de reacción.
PLAN DE ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

MEDICIÓN DEL EFECTO INHIBIDOR DEL PARDEAMIENTO ENZIMÁTICO DE LOS

ANTIOXIDANTES SOBRE LA POLIFENOL OXIDASA EN EL EXTRACTO ENZIMÁTICO DE BANANO.

Se utilizará la especie Musa Acuminata Colla comúnmente conocida como platano morado.

• Extracción de la enzima. Con base en el procedimiento Palmer.

• Ensayo de actividad de la PPO. Método de Pizzocaro.
• Parámetros cinéticos. Método gráfico de LINEWEAVER-BURK.
• Efecto de inhibidores. Determinar actividad enzimática mediane el método
colorimétrico a 420nm y 30°C.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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https://www.biodiversidad.gob.mx/ecosistemas/manglares

BADUI, S. 2006. Química de los alimentos. (4th ed.) Pearson Educación. México. p. 345-
Nicolas et al. 1994
Plátano: La fruta tropical más cultivada en México. (s. f.). Gobierno de México. Recuperado
3 de mayo de 2022, de https://www.gob.mx/agricultura/articulos/hoy-dia-del-
platano#:%7E:text=El%20pl%C3%A1tano%20es%20cultivado%20en,Dominico
Mathias-Rettig & Ah-Hen / Agro Sur 42(2): 57-66, 2014.DOI:10.4206/agrosur.2014.v42n2-07