INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

“Verificación del funcionamiento de un espectrofotómetro”

ALUMNA:
Herrera Hernández Linyu

PROFESOR:
Q.B.P Victor Manuel Macías Martínez
GRUPO: 5QV2

SECCIÓN:3

7/Octubre/2019
 “Verificación del funcionamiento de un espectrofotómetro”

FUNDAMENTO

La espectrofotometría es un método científico utilizado para cuantificar la cantidad de energía radiante

absorbida por las moléculas de una muestra en función de las longitudes de onda específicas,
basándose en la ley de Bouguer-Lambert-Beer, ésta establece que hay una relación lineal entre la
absorbancia de luz a través de una sustancia y la concentración de dicha sustancia. A = a· b · c
Dónde: A = absorbancia, a = Absortividad molar, C= concentración molar y b = paso de celda (cm).
Un espectrofotómetro se compone principalmente de una fuente de luz, generalmente lámparas de
tungsteno o tungsteno-halógeno para proveer de una radiación contínua adecuada del espectro visible
al infrarrojo cercano. Para la capacidad de radiar con los UV se necesita una lampara de H 2 o D2, la
de D2 es generalmente preferida que una lámpara de H2 por que emite una radiación tres veces mayor.
Un monocromador donde una porción de la radiación emitida por la fuente es colectada y dirigida al
selector de longitud o a la muestra con algunos lentes o espejos. El prisma que va a descomponer la
luz para difractarla a diferentes ángulos que posteriormente llegan a la portacelda donde se coloca la
muestra. Los fototubos de vacío, fotodiodos, detectores fotónicos, fotomultiplicadores, arreglos
lineares de fotodiodos y sistemas de transferencia de carga son utilizados como detectores en muchos
fotómetros y espectrofotómetros de amplio espectro. El detector da una señal que contiene información
sobre el poder de radiación trasmitido por una solución de muestras o referencia. La señal puede ser
procesada por un hardware o software para extraer la información deseada y para convertirla a una
forma conveniente y desplegarla en un dispositivo de lectura, como lo es el galvanómetro.

Partes de un espectrofotómetro

OBJETIVO

 Verificar el funcionamiento de un espectrofotómetro por medio de la evaluación del

monocromador (exactitud de la escala de longitud de onda), detector (luz dispersa), escala de
absorbancia, ancho de banda y linealidad fotométrica.

RESULTADOS

Exactitud de la escala de longitud de onda

Tabla 1: % de T para espectro de transmisión de filtro de didimio

λ (nm) %T λ (nm) %T λ (nm) %T λ (nm) %T

400 105.3 500 44 400 100 500 44.06
410 104 510 7.2 410 100 510 6.38
420 93.1 520 4.2 420 93.54 520 4.32
430 43 530 1.3 430 36.96 530 2.46
440 12.6 540 44.1 440 10.91 540 47.1
450 9.6 550 82.4 450 11.02 550 85.11
460 14.8 560 74.7 460 15.24 560 73.45
470 9.2 570 2.5 470 9.08 570 2.33
480 13.3 580 0.1 480 14.16 580 0.64
490 44.9 590 0.2 490 47.75 590 0.59
Experimental Teórico

97

77
%Transmitancia

57

37

17

-3
390 440 490 540 590
Experimental Teórico
λ (nm)
Figura 1: Espectros de transmitancia del filtro de didimio, obtenidos experimentalmente y teórico

Tabla 2: % de T para espectro de transmisión de solución de NiSO4.6H2O al 20%

λ (nm) %T λ (nm) %T λ (nm) %T λ (nm) %T

380 0.4 490 89.4 380 - 490 87.50
390 0.2 500 92 390 0.10 500 90.78
400 0.2 510 91.2 400 0.10 510 89.54
410 0.3 520 88.6 410 0.10 520 85.90
420 1.6 530 84.1 420 0.10 530 82.04
430 10.3 540 80 430 7.82 540 78.34
440 29.5 550 77.1 440 28.51 550 75.51
450 51 560 72.3 450 44.46 560 70.15
460 54.1 570 64.8 460 51.88 570 62.95
470 69.5 580 57.6 470 62.52 580 52.24
480 78.3 590 43.6 480 77.80 590 41.02
Experimental Teórico
400, 0.2 Relacionar con luz dispersa 500, 92 Relacionar con ancho de banda
“negritas” Relacionar con Tabla 3
 88
78
68
% Transmitancia

58
48
38
28
18
8
-2
370 420 470 520 570
λ (nm) Experimental Teórico

Figura 2: Espectros de transmitancia de NiSO4.6H2O al 20%, obtenidos experimentalmente y teórico

Proporcionalidad fotométrica

Tabla 3: Proporcionalidad entre A y λ para el NiSO4.6H2O al 20%

0.25
y = 0.0027x - 1.3828
λ (nm) Absorbancia % Transmitancia
0.2 R² = 0.9483
530 0.079 83.5
Absorbancia

540 0.093 80.7 0.15

550 0.115 76.7 0.1

560 0.143 71.9
0.05
570 0.191 64.4
Figura 3: Regresión lineal para la 0
520 530 540 550 560 570 580
proporcionalidad de A vs λ λ (nm)

83

78 y = -0.463x + 330.31
R² = 0.9684
%Transmitancia

73 y = -0.4637x + 328.83
R² = 0.9665

68
y = -0.47x + 333.94
R² = 0.9662
63

58
530 535 540 545 550 555 560 565 570
% Transmitancia-Proporcionalidad λ (nm) %Transmitancia-Exp. Tabla 2
%Transmitancia teórica Linear (% Transmitancia-Proporcionalidad)
Linear (%Transmitancia-Exp. Tabla 2 ) Linear (%Transmitancia teórica)

Figura 4: Proporcionalidad fotométrica de λ vs %Transmitancia de NiSO4.6H2O al 20%, con datos de

Tabla 2, Tabla 3 y valores teóricos
Luz dispersa Ancho de banda

NiSO4.6H2O al 20%
NiSO4.6H2O al 20%
%Transmitancia a 500 nm = 91.7
A400= 2.663
Comparación con %T a 500 nm de Tabla 2= 92
%Transmitancia = 0.2
Comparación con %T a 400 nm de Tabla 2= 0.2

Exactitud fotométrica

Cálculos para conversión de Absorbancia a transmitancia

Ejemplo a 400 nm
%Transmitancia= Transmitancia x 100 T= %T/100
A=-logT A= -log(%T/100) A= -log (0.10/100) A= -log (0.002) A= 2.698
Así se realizó para 500 nm

Tabla 4: Exactitud fotométrica, método del NiSO4.6H2O al 20%

λ (nm) 400 500 nm

Parámetro nm
Absorbancia esperada 2.698 0.036
Tolerancia aceptada 5% 0.134 0.0018
Absorbancia medida 2.673 0.038

Intervalo dinámico lineal de la concentración

Cálculo para la concentración de NiSO4.6H2O en cada tubo: Ejemplo tubo 1

Vol (ml) de NiSO4.6H2O 0.19 M= 0.2 Vol total (mL)= 4
Factor de dilución= 4/0.2 Factor de dilución= 20---------1:20
[NiSO4.6H2O]= 0.19/20 [NiSO4.6H2O]= 0.0095 M
Así se realizó el cálculo para los demás tubos

Tabla 5: Curva de calibración de NiSO4.6H2O

Tubo Concentración de A400

NiSO4.6H2O (M) Serie A Serie B
1 Blanco
2 0.0095 0.060 0.062
3 0.028 0.145 0.154
4 0.066 0.339 0.327
5 0.1045 0.505 0.526
6 0.1428 0.706 0.695
7 0.152 0.731 0.740
8 0.1711 0.819 0.841
9 0.180 0.874 0.890
10 0.19 0.900 0.900
 1
0.9 y = 4.7291x + 0.0189
R² = 0.9989
0.8
0.7
0.6
A400

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2
Concentración de NiSO4.6H2O (M)

Figura 5: Curva de calibración de NiSO4.6H2O

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Mediante la escala de longitud de onda se evalúa el monocromador, que consiste de una rendija de
entrada, un elemento dispersor (rejilla de difracción o prisma) lentes y/o espejos y la rendija de salida,
su función principal es la de separar el espectro de la fuente de iluminación, por ello se muestran los
espectros de transmisión del filtro de didimio y del NiSO4.6H2O al 20% (Figura 1 y 2 respectivamente)
tanto teóricos como experimentales. Se empleó el espectrofotómetro D-Lab en la obtención de % de
transmitancia. Como se observan en las figuras 1 y 2, ambos espectros obtenidos experimentalmente
(NiSO4.6H2O al 20% y filtro de didimio) coinciden en gran medida con los picos y valles de los espectros
teóricos, en particular el espectro del NiSO4.6H2O al 20% presenta un pico a 450 nm que no coincide
con el teórico, aunque en general siguen una misma tendencia.
La proporcionalidad fotométrica evalúa la parte del detector, en la Tabla 3 se muestran transmitancias
y absorbancias de NiSO4.6H2O al 20% en el intervalo de 530- 570 nm, mismo intervalo de lectura leído
en la Tabla 1, se observa que los datos de % de Transmitancia son muy cercanos a los obtenidos en
dicha Tabla (1). En la Figura 3 se muestra la recta de dichas longitudes de onda contra absorbancia,
nos muestran un coeficiente de correlación de 0.94 clasificado como bueno pero no siendo el mejor.
La Figura 4 se tienen las rectas de λ vs %Transmitancia de NiSO4.6H2O al 20% obtenidas
experimentalmente y datos teóricos, al comparar las 3 ecuaciones denotan una gran similitud entre sí,
corroborando que realmente el detector se encuentra en el estado adecuado de funcionamiento.
La luz dispersa hace referencia a la luz que llega al detector sin pasar por la muestra, para ello se leyó
absorbancia y transmitancia del NiSO4.6H2O al 20% a 400 nm, y se comparó el resultado con el dato
obtenido de transmitancia a esa misma longitud de onda en la Tabla 2, obteniéndose datos de 0.2%
en ambas lecturas y corroborando que no hubo la presencia de luz dispersa durante la lectura.
El ancho de banda es el intervalo de longitudes de onda de radiación saliente de la rendija de salida
de un monocromador medido en la mitad de un pico del flujo radiante detectado. Para esta prueba se
leyó transmitancia a 500 nm de NiSO4.6H2O al 20%, obteniendo un valor de 91.7%, que al compararse
con el dato de % de transmitancia del mismo analito a la misma longitud de onda, presente en la Tabla
2, de 92% de igual manera se corroboró que el ancho de banda realmente es el que indica el equipo.
La exactitud fotométrica se determina comparando la absorbancia de una solución de referencia con
la lectura de ésta obtenida en el espectrofotómetro, la solución estándar utilizada es NiSO4.6H2O al
20%, con una lectura de absorbancia de 2.673 a 400 nm y de 0.038 a 500 nm, se observa que a 400
nm el NiSO4.6H2O al 20% absorbe mucho, pero transmite poco, por l contrario a 500 nm absorbe poco
y transmite mucho. Al comparar estos valores con las absorbancias esperadas de la Tabla 4 podemos
decir que las diferencias son centésimas y por lo tanto hay una buena exactitud fotométrica.
El intervalo lineal de la concentración es un parámetro para determinar que se sigue la Ley de Bouguer-
Lambert-Beer, como se muestra en la Tabla y Figura 5, a mayor concentración aumenta la
absorbancia, es decir, la absorbancia es directamente proporcional a la concentración. Presentándose
una recta, con un coeficiente de correlación de 0.998, valor adecuado y muy permisible.

CONCLUSIONES

 Los analitos medidos en el espectrofotómetro D-Lab siguen la ey de Buoguer-Lambert-Beer

 El funcionamiento del espectrofotómetro D-Lab es el adecuado para el trabajo de los alumnos
de la ENCB
BIBLIOGRAFÍA
 De la Torre F. (2011) “Espectrofotometría” disponible en:
http://www.bioquimica.ucv.cl/paginas/central/bioquimica%20clinica/apuntes%20de%20espectr
ofotometria.pdf
 Rubbinson, K. (2001) Análisis instrumental. Introducción a la espectrometría. Espectrometría
de absorción. Pags 300-305
 Arenas, I. (2004) Espectrofotometría de absorción. Universidad Nacional Autónoma de
México.
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/espectrometria_de_absorcion.pdf
 Juárez, J. (2012) El concepto de ancho de banda en espectrofotómetros de barrido y una
propuesta de su determinación instrumental.
https://www.cenam.mx/memorias/descarga/simposio%202002/doctos/te015.pdf

PREGUNTA EXTRA
Señale 2 causas que originen luz extraña, cambio en el ancho de banda y alteración de la respuesta
relativa o rendimiento instrumental
Cuando se trabaja con un volumen inferior al volumen mínimo, el rayo de luz incidente puede pasar
por los costados del tubo o cubeta por afuera, cuando el espesor del tubo o cubeta es menor al que le
corresponde de acuerdo con el portatubo del instrumento. Otra situación ocurre cuando hay un
inapropiado cierre del compartimento donde se ubica el tubo con la muestra.