La Fermentación Maloláctica

Ing. Agr. Silvia Paladino

 Ácido málico
Propio de las uvas
La concentración depende de la zona donde se
cultivaron las uvas
Zonas templado- frías
2 a 8 g/L
Zonas cálidas
< de 2 g/L

Bartowsky, 2005
 Conversión de ác.málico en ác. láctico,
catalizada por la enzima maloláctica

COOH
CH2 NAD CH3
CHOH CHOH + CO2
COOH Mn+2 COOH
ác. L(-)Málico ác. L(+)Láctico
 ¿Porqué las bacterias realizan la FML?

Se crea un gradiente de protones (p) a través de la

membrana celular, entre el citoplasma bacteriano y el
medio que lo rodea.

Este gradiente, combinado con una ATP-asa específica

en la membrana celular, facilita la generación de energía
disponible para los procesos en forma de ATP.
 ¿Porqué las bacterias realizan la FML?
Oenococcus oeni puede generar combustible (ATP) en un ambiente tal como el vino a través de la decarboxilación del
ácido málico
 ¿Porqué las bacterias realizan la FML?

Tres etapas diferentes:

1) Por medio de un transportador enzimático específico, ingresa

ácido L- málico a la célula bacteriana.
2) Dentro de la célula, el ácido L- málico es descarboxilado por la
enzima maloláctica. Se produce ácido L- láctico y CO2, lo cual
provoca un aumento del pH intracelular.
3) El ácido L- láctico y el CO2 son expulsados fuera de la célula.
Por cada molécula de ácido L- láctico que sale de la célula,
sale también un protón fuera de ella.
 Función biológica y energética

H+

2
H+
3
3
H+

La FML no proporciona gran cantidad de energía, ni fuentes de

carbono para el crecimiento celular.
Pero aún así, la presencia y utilización de ácido málico estimula la
velocidad inicial de crecimiento de las bacterias lácticas.
 Consecuencias de la FML

Modificación de la acidez
Estabilidad microbiana
Cambios organolépticos
Modificaciones higiénico sanitarias
 Consecuencias de la FML

Cambios organolépticos:
sabor, aroma, color, textura
Modificaciones higiénico sanitarias
Estabilidad microbiana
Modificación de la acidez

Acidez total y pH
Acidez volátil
 Estabilidad microbiana

Consumo de Nutrientes
Producción de Toxinas

Aumento de pH
Desarrollo posible de bacterias acéticas
 Estabilidad microbiana

La FML solo confiere estabilidad ante un nuevo

ataque de bacterias lácticas.

No surgirán problemas en la botella

Consecuencias de la FML
Cambios organolépticos

Aroma

Sabor

Color
 Cambios en el aroma

Modificación del carácter floral ó frutal

Incorporación de aromas lácticos, manteca
(diacetilo), nueces
Mayor complejidad aromática
Potencialmente: Gusto a “ratón”
Gusto a “Geranio”
Descriptores para un vino que ha completado la FML
exitosamente

Manteca Nuez
Levadura Miel
Vainilla Cuero
Especias Tostado

Mayor volumen en boca

Mayor persistencia en boca
Menor astringencia
Reducción de los aromas vegetales,herbáceos
 Descriptores para un vino que ha completado la FML
sin control a pH > 3,5
Aromas lácticos intensos
Yogurt rancio
Notas de sudor
Ac. Acético
Notas animales
Cuero mojado
Fósforo quemado
Fruta en descomposición
Amargo intenso al final de boca
 Producción de glicosidasas

Oenococcus oeni hidroliza precursores aromáticos

glicosilados, por acción de β- glucosidadas.
Ugliano et al. J. A.Food Chem., 2003, 51, 5073-5078
 Producción de glicosidasas
Precursores aromáticos

Depende de la cepa de bacterias y de la variedad de uvas.

Viognier vs Muscat

Azúcar + monoterpenos = inodoro

Azúcar + monoterpenos + β glicosidasa = hidrólisis =

= terpeno libre aromático
Ejemplos: 3 hidroxidamascenona, alfa terpineol, vainillina, metil
vainillato, linalol, nerol y geraniol
 Diacetilo

C H3 1-4 mg/l positivo

C O 5-7 mg/L defecto
C O manteca, manteca rancia
C H3
Catabolismo del ác. Cítrico, una vez que se ha
consumido el ácido málico

Puede combinarse con el SO2,

pierde su aroma una vez combinado.
Ác. cítrico 0,1 a 0,7 g/L (Bauer y Dicks, 2004)
 Diacetilo
Catabolismo del ác. Cítrico

Contenido de ácido málico en mostos

1 a 8 g/L

Contenido de ácido cítrico en mostos

0,1 a 0,7 g/L
 Metabolismo del ácido cítrico en Oenococcus oeni
(Ramos et al, 1995, en Bartowsky & Henshke, 2004)

Citrato liasa
 Diacetilo

Clave del gráfico metabolismo del ácido cítrico

1.Citrato liasa
2. Oxaloacetato
3. Piruvato decarboxilasa
4. Alfa acetolactato sintasa
5. Alfa acetolactato decarboxilasa
6. Diacetil reductasa
7. Acetoina reductasa
8. Lactato deshidrogenasa
9. Complejo Piruvato deshidrogenasa
10. Acetato quinasa
11. Decarboxilación no enzimática del alfa acetolactato
12. Aspartato aminotransferasa, TPP, Tiamina PP
 Diacetilo

Las levaduras pueden formar también diacetilo,

pero debido al ambiente reductor de la FA, es
reducido a acetoina y 2, 3 butilen glicol.

Los productos reducidos son menos tóxicos (para

la levadura) que el diacetilo, y además esta
reducción aumenta la concentración de NADP.
 Diacetilo

El metabolismo del ácido cítrico no se inicia

hasta que se haya metabolizado más de la
mitad del ácido málico.

(Bartowsky & Henshke, 2004)

FML en Cabernet Sauvignon
 Cambios en el sabor

Málico (diácido) Láctico (monoácido)

Málico es un ácido más fuerte que láctico
pK1 = 3,45 pK = 3,78
Málico: duro Láctico: untuoso
FML: cambios organolépticos

Sabor (percepción en boca)

Menor percepción de la astringencia

Mayor untuosidad
(Polisacáridos)
 Sensaciones táctiles asociadas a la producción
de polisacáridos

Pediococcus damnosus

Biosíntesis de polímeros exocelulares

polisacáridos
β -d- Glucanos

Photo: Jeff Broadbent, Utah State University

Sensaciones táctiles asociadas a la producción
de polisacáridos

Consecuencias
Niveles excesivos
Vinos siruposos, desagradables
Dificultades en las filtraciones

Niveles moderados
Mayor cuerpo y volumen en boca
S.Q. Liu, 2002
 Cambios en el color

La intensidad colorante disminuye

un 25% - 30%
El pH aumenta 0,1 a 0,25 unidades
Los antocianos varían su color según el pH
 Perfil organoléptico del vino Malbec
con y sin FML
Color
4
Boca Amargo Nariz Frutado
3
2
Boca Herbáceo Nariz Especias
1
0

Boca Alcohólico Boca Acidez

Boca Untuosidad Boca Astringencia

Boca Frutado

Testigo FML
 Modificaciones higiénico sanitarias
Decarboxilación de los aminoácidos

• Producción de Aminas biógenas : histamina

>1 mg/L provoca reacciones en personas sensibles
Causa picazón, problemas respiratorios, secreción nasal

Vinos de pH alto, más histamina.

Bacterias en contacto con el vino luego del fin de FML, más histamina.

• Producción de etil carbamato

Arginina urea etil carbamato
 Bacterias Lácticas

El vino es un ambiente hostil para las bacterias

Bajo pH
Alta concentración de Etanol
Baja concentración de nutrientes
SO2
 Bacterias causantes de la FML

Oenococcus pH<3,5
Lactobacillus pH>3,5
Pediococccus pH>3,5
 Metabolismo de las bacterias lácticas

Homofermentativo
Azúcares ác. Láctico y CO2
Glicólisis: glucosa piruvato
 Metabolismo de las bacterias lácticas
Heterofermentativo
Azúcares ác. láctico, etanol, glicerol ác.
acético, manitol y CO2
Ácido cítrico ác. acético, CO2 y ác.
láctico
Vía pentosa fosfato para degradar hexosas y
pentosas
 Vía de las pentosas fosfato

Glucose Phospho-6-gluconate
ATP ADP NADP+
NADPH
CO2
Ribulose 5-phosphate
NADP+
NADPH
Xylulose 5-phosphate

Acetyl-phosphate Glyceraldehyde 3- phosphate

NADH
ADP ADP
NAD+ (glycolysis)
ATP ATP
Acetate Acetaldehyde
NADH Pyruate
NAD+
Ethanol Lactate
 Oenococcus oeni
Heterofermentativo: forma ác. Láctico, CO2
y etanol o ácido acético a partir de
azúcares
Resiste pH<3,5
Casi todas las FML espontáneas
Comercialmente disponible
Oenococcus oeni
Oenococcus oeni
Oenococcus oeni
Oenococcus retenido en filtro de 0,45 micrones
 Interacción levadura -bacteria
Levaduras
Negativos
Competencia por nutrientes
• Formación y combinación de SO2
• Formación de ácidos grasos de cadena
larga
Positivos
• Liberación de polisacáridos de la pared y
proteínas (lisis)
Evolución del crecimiento bacteriano
Ciclo de crecimiento de las bacterias lácticas durante la
elaboración y conservación del vino

Wibowo, 1985 citado en Sibylle Krieger, 2005, Lallemand

Fermentación Maloláctica bajo control

Sibylle Krieger, 2005, Lallemand

 Factores que influyen sobre el crecimiento
bacteriano
• pH
• Temperatura
• SO2, Lisozima
• Alcohol
• Nutrientes
• Oxígeno
• Ácidos orgánicos
• Bacteriófagos
 Factores que influyen sobre el crecimiento
bacteriano
• pH
Mínimo pH=3,1
Oenococcus resistente a pH<3,5
Lactobacillus y Pediococcus pH>3,5
Catabolismo: pH 3,2 Ác. Málico
pH 3,5 Azúcares
Velocidad de FML
 Factores que influyen sobre el crecimiento
bacteriano

• Temperatura
<15ºC FML no progresa
20-25ºC óptimo
Efecto de la temperatura sobre la duración de la
fermentación maloláctica

Isolation and evaluation of South African lactic acid bacteria

Heinrich du Plessis, ARC Infruitec-Nietvoorbij, Stellenbosch, Wynboer 2007
 Factores que influyen sobre el crecimiento
bacteriano

• SO2
<30 mg/L SO2 Total
Hasta 0,5 mg/L SO2 Molecular

Ataque al acetaldehído y ác. pirúvico

 Factores que influyen sobre el crecimiento
bacteriano

• Lisozima
Autorizada por INV Res.33/2009
Dosis máxima acumulada: 500 mg/L
Controla bacterias Gram (+), ataca la pared celular.
No controla levaduras ni bacterias acéticas.
Efectiva a pH alto.
No modifica características organolépticas.
Problemas: blancos (proteínas); tintos (taninos y color)
Factores que influyen sobre el crecimiento bacteriano: Lisozima

Yun Cai Gao et al, AJGWR, 8, 76-83, 2002

 Factores que influyen sobre el crecimiento
bacteriano
• Alcohol
13,5% limitante
Mayor cont. Alcohol, FML más lenta
• Nutrientes
Requerimientos complejos
Autólisis de levaduras
 Factores que influyen sobre el crecimiento
bacteriano
• Oxígeno
Las bacterias lácticas son Microaerófilas
Aireación moderada: estimula FML
Aireación intensa: ácido acético
• Acidos orgánicos
Malato: estimulante
Fumarato y ác. Grasos: inhibidores
 Factores que influyen sobre el crecimiento
bacteriano
• Bacteriófagos
Partículas semejantes a virus , que infectan y
lisan bacterias
Encontrados sobre bacterias de la FML
Posible responsabilidad en FML problemáticas
 Manejo de la FML
• FML ¿Si ó No?
• ¿Cómo evitar FML?
• ¿FML espontánea o inoculada?
• ¿Cuándo inocular?
• ¿Cómo controlar FML?
• ¿Cómo terminar FML?
• ¿Otras formas de reducir acidez málica?
 FML ¿Si o No?

Vinos de alta acidez

Complejidad sensorial (con corrección de la
acidez posterior a FML)
Cuidado con málico D-L
Estabilidad microbiológica
 FML ¿Si o No?

Vinos de baja acidez

Vinos de alta volátil
Vinos frutados
Vinos elaborados con uvas enfermas
 ¿Cómo evitar FML espontánea?
• SO2 molecular 0,8 mg/L
• 1º trasiego 7-10 días después fin FA
• Temperatura <15ºC
• pH: corregir para asegurar 0,8 mg/L SO2
molecular
• Peligro en los cortes
• Lisozima 300 a 500 mg/L
 ¿FML espontánea o inoculada?

FML Espontánea
No se puede controlar el momento de
ocurrencia
Riesgo de bact. lácticas no deseadas
Riesgo de caracteres organolépticos
desagradables
 ¿FML espontánea o inoculada?
FML Inoculada
Se puede decidir el momento de ocurrencia
de FML
Se puede elegir la bacteria
Se obtiene mejor calidad sensorial
Se minimiza el riesgo de esperar FML
Hay que comprar bacterias
(75 U$A/2500 L)
 Duración de la FML
espontánea versus inoculada
¿Cómo estimular FML espontánea?
SO2 total < 30 mg/L
SO2 molecular: no más 0,5 mg/L
No ajustar SO2 después de la FA
Retrasar el 1º trasiego (autólisis)
Alcohol < 13,5%
Temperatura 18 a 23ºC
Encubados largos, desborres suaves
Si pH<3,1, desacidificación química previa
 ¿Cuándo inocular FML?

• Previa a FA
• Simultánea con la siembra de levaduras
• Hacia la mitad de la FA
• Una vez finalizada la FA
Inoculando bacterias
 Inoculación previa a la FA
Abundantes nutrientes
No hay alcohol

Carencias nutritivas para las levaduras

FA lentas o detenidas
Alto acético (oxígeno)
Riesgo de picadura láctica
 Inoculación simultánea con siembra de las
levaduras
Abundantes nutrientes
No hay alcohol

Alta producción de acético

Competencia entre las dos poblaciones
Las levaduras se recuperan
Riesgo de fermentaciones detenidas
 Inoculación hacia la mitad de FA
Carencia de nutrientes
Contenido alcohólico medio
Máximo SO2 producido por las levaduras

Riesgo de FA detenidas
Bacterias consumen esteroles y oxígeno
 Inoculación después del fin de FA
Alcohol alto
ácidos grasos

Autólisis
Mínimo riesgo picadura láctica (Az. 1,8g/L)
Mejor manejo temperatura
Óptimo
Situación en Mendoza
¿Cómo se controla la FML?
Cromatografía de papel
Cromatografía de papel
Cromatografía de papel
 Método Enzimático

L-Malato + NAD+ Oxaloacetato + NADH++H+

L- MDH

Oxaloacetato + L-Glutamato L-aspartato + 2- oxoglutarato

GOT

El aumento de la concentración de NADH se mide

por medio de la absorbancia a 334 nm.

GOT: glutamato-oxaloacetato transaminasa

L- MDH: L- malato deshidrogenasa
 ¿Cómo se pone fin a la FML?
Verificar analíticamente la desaparición del
ác. Málico
Trasegar
Ajustar SO2 molecular a 0,8 mg/L (SO2
variable según el pH)
Temperatura <15ºC
Lisozima 250 a 300 mg/L
Fuente: Boido, Eduardo. 2008
 Método alternativos de reducción de la acidez
málica

Enzima maloláctica (EM) inmovilizada

Bacterias lácticas inmovilizadas
Conversión de malato en etanol (Levaduras)
Schizosaccharomyces pombe (SH2)
Saccharomyces cerevisiae modif. Genétic.
Expresión EM Saccharomyces cerevisiae
No aplicables industrialmente
Desacidif. Química (CO3Ca, CO3K2) Permitido en Argentina sólo
en mostos (Resolución INV Nº281/85).
 FML en Botella
• Enturbiamiento por aumento Nº células
• Producción de gas
• Producción de polisacáridos
aspecto siruposo, precipitaciones
• Aumento de pH: desarrollo de otros
microrganismos
• Cambios organolépticos fuera de control
Muchas Gracias
Bartowsky, E. Aust. J. of Grape and Wine Research, 11,174-187,2005