ESPECTROFOTOMETRÍA

QUÍMICA PATRICIA MILLAN CRUZ

MSc, PhD
 ESPECTROSCOPIA
• La espectroscopia es el estudio del espectro de la luz
que emiten los cuerpos, sustancias y elementos.

• De este estudio se puede conocer la composición,

temperatura, densidad, velocidad de desplazamiento y
otros factores que les son propios y componen a estos
cuerpos, sustancias o elementos
 Propiedades de la luz
La luz tiene una naturaleza dual:

Como onda

Como una corriente de partículas o paquetes de energía (fotones)

 Longitud de onda
La distancia entre dos picos (o dos valles) de una onda se llama longitud de
onda (λ = lambda).

CARACTERÍSTICAS DE LAS ONDAS

nodo
La longitud y la frecuencia de onda son
inversamente proporcionales y se relacionan
mediante la siguiente ecuación
Luz visible

La luz visible es sólo una

pequeña parte del espectro
electromagnético con longitudes
de onda que van
aproximadamente de 350
nanómetros hasta unos 750
nanómetros
 Luz visible
Cuando se observan objetos, la percepción visual resulta un ente psicológico
complicado que depende tanto de la composición espectral de la luz (Tabla) con que se
iluminan los objetos, como de la reflexión que producen de la misma según sea su
naturaleza.

Espectro de radiación visible por el ojo humano

Colores primarios y secundarios.

 Luz visible
• Cuanto más larga la longitud de onda de la luz visible tanto más rojo el
color.
• Asimismo las longitudes de onda corta están en la zona violeta del
espectro
La luz blanca está compuesta de ondas de diversas frecuencias. Cuando un rayo
de luz blanca pasa por un prisma se separa en sus componentes de acuerdo a la
longitud de onda
Así la luz blanca es una mezcla de todas las longitudes de onda visibles.
En el espectro visible, las diferencias en longitud de onda se manifiestan como
diferencias de color.
Las longitudes de onda mas largas que las del rojo se les conoce como
infrarrojas y las mas cortas que el violeta, ultravioletas.

Ultravioleta Luz visible Infrarrojo

102 -104 ~ 104 104-107

UV Violeta Azul Verde Amarillo Naranja Rojo IR

4000 A Espectro Visible 7500 A
Color de un cuerpo

El color de un cuerpo depende de la luz que Color de una solución

recibe, refleja o transmite. Por ejemplo, el
El color percibido de una solución
color rojo se da cuando absorbe en casi su
depende de la combinación de colores
totalidad, todas las radiaciones menos las
complementarios que la atraviesan
rojas, las cuales refleja o deja pasar
dependiendo su estructura (sólida o
transparente).
Fenómeno de absorción de radiación
Fenómeno de absorción de radiación
 Fenómeno de absorción de radiación

Clorofila

Espectro de absorción de la Clorofila en la región visible.

Obsérvese que absorbe en las regiones del rojo y azul
 Fenómeno de absorción de radiación
Cuando un rayo de luz monocromática con una intensidad I0 pasa a través de una
solución, parte de la luz es absorbida resultando que la luz emergente I es menor
que I0

Absortividad (a) absortividad molar”

(una medida de la radiación absorbida), que es un valor constante para cada sustancia a
cada longitud de onda l y en unas condiciones experimentales determinadas; también se
denomina “coeficiente de extinción molar” si, como es frecuente, la concentración se
expresa en moles por litro.
Ley de Lambert:
cuando un rayo de luz monocromática
(I0) pasa a través de un medio
absorbente, su intensidad disminuye
exponencialmente (I) a medida que la Ley de Beer:
longitud del medio absorbente
Cuando un rayo de luz
aumenta
monocromática pasa a través de un
I = I0e-a medio absorbente, su intensidad
disminuye exponencialmente a
medida que la concentración del
medio absorbente aumenta
I = I0e-ac
Ley de Beer-Lambert
Lo que significa que combinando ambas leyes se crea la Ley de Beer-Lambert donde la
fracción de luz incidente que es absorbida por una solución es proporcional a la
concentración de soluto y al espesor de la sustancia atravesada por la luz.
La relación entre la luz incidente (I0) y la reflejada (I) dará una idea de la cantidad de
radiación que ha sido absorbida por la muestra.

Si se opera, por tanto, a una longitud de onda dada y con una cubeta de un
determinado espesor, l , la absorbancia A, medible directamente, es
proporcional a la concentración molar de la muestra, c, lo que constituye
el fundamento del análisis espectrofotométrico cuantitativo.
Ley de lambert Beer:

I = I0e-abc
Si despejamos: I/I0 = e-abc

Al cociente de las intensidades se denomina Transmitancia

T = I/I0 = e-abc
Sacando logaritmos:
Loge I/I0 = abc

Convirtiendo a log10:
Log10 I/I0 = 2.303 abc
Log10 I/I0 = abc
Absorbancia = Log10 I/I0 = abc
La Transmitancia (T) es la relación entre la intensidad de luz transmitida
por una muestra problema (I) con la intensidad de luz incidente sobre la
muestra (Io):

T = I / I0 Se expresa como % T

La absorbancia es directamente proporcional a la longitud del recorrido b

a través de la solución y la concentración c del color absorbente. Estas
relaciones se dan como:

A = a·b·c

A menudo b es dada en términos de cm. y c en gramos por litro.

Entonces la absortividad tiene unidades de: l·g–1·cm–1.

 ¿Qué relación guardan la transmitancia y la
absorbancia?

De acuerdo a las características de la sustancia

analizada, la luz que no se absorbe atraviesa la
solución

LUZ
A
B
S Luz transmitida
O
I0 R I
B
I
D T = I/I0
A
 Por lo tanto la absorbancia es reciproca de la transmitancia

Absorbancia contra concentración (comportamiento lineal)

Absorbancia

Concentración
% Transmitancia contra concentración (pendiente con signo negativo y
comportamiento exponencial)

% Transmitancia

Concentración
La representación gráfica correspondiente a absorbancia y
transmitancia en un gradiente de concentraciones es la siguiente:

Concen
tración
 Espectrofotometría
Se le llama espectrofotometría a la medición de la cantidad de energía
radiante que absorbe un conjunto de elementos o un elemento en su
estado puro, en función de la longitud de onda de la radiación lumínica y
a las mediciones a una determinada longitud de onda.

¿Cómo se puede medir la radiación que emiten o absorben los cuerpos?

Un aparato capaz de obtener el espectro de una radiación, es decir, de

separar la radiación en sus componentes, se llama un espectroscopio.
Si el aparato es capaz de fotografiarla se llama un espectrógrafo, y
Si es capaz de medirla diremos que se trata de un espectrómetro.
Cuando es capaz de medir también la intensidad de la radiación, se
llama espectrofotómetro.
 Colorimetría y Espectrofotometría como
procedimientos analíticos
Las técnicas colorimétricas se fundamentan con la medición de la absorción de
radiación visible por sustancias coloreadas.

Sin embargo, cuando una muestra a determinar no posee coloración, es

necesario llevar a cabo un tratamiento de color empleando substancias que
reaccionen de forma proporcional con el compuesto de interés
Las diferentes sustancias se analizan
mediante reacciones coloreadas. Cuanto
mayor es la concentración de la sustancia a
analizar mayor es el color de la reacción. También es posible que la
muestra pueda ser “leída”
cuando su espectro de
absorción se encuentra en las
regiones no visibles del
espectro, como las referentes
a las regiones de UV o
visión de las abejas infrarroja
 Colorimetría y espectrometría
La diferencia entre colorimetría y espectrofotometría consiste en el tipo de instrumental
empleado:
El colorímetro es un aparato en los que la longitud de onda se selecciona por medio de
filtros ópticos que son insertados en este.

En el espectrofotómetro la longitud de onda es seleccionada mediante dispositivos

monocromadores los cuales están integrados al equipo.

Monocromador:

Formado por un conjunto de

lentes; espejos; y rendijas para
dispersar y separar, enfocar y
restringir la radiación no
deseada.
 Espectrometría de absorción uv-visible
Es usual que al seguir un método
determinación de la concentración
compuesto en particular se indica una
de onda (l) específica a la que hay que
el espectrofotómetro.
para la
de un ¿Porque leer a diferentes l (longitudes de onda)
longitud compuestos parecidos pero diferentes?
leer con
La explicación radica en el hecho de que cada
producto químico se caracteriza por zonas del
espectro visible o no visible en el cual absorbe con
mayor o menor intensidad conformando en su
conjunto el espectro de absorción de tal sustancia.
Transiciones energéticas en el analito (muestra problema)
 Espectrofotómetro
Un espectrofotómetro es un instrumento que descompone un haz de luz (haz
de radiación electromagnético), separándolo en bandas de longitudes de onda
específicas, formando un espectro atravesado por numerosas líneas oscuras y
claras, semejante a un código de barras del objeto, con el propósito de
identificar, calificar y cuantificar su energía
 Espectrometría UV/Vis
Cubeta para muestra
Fuente luminosa
Lámpara de deuterio: Vidrios silicatos,
Para la región UV (160 – 375 nm) plástico

Lámpara de Tugsteno: Vis (350 – 2000 nm)

Para la región Visible/IR cercano
(350 – 2500 nm)

Lámpara arco de xenón: (200 – 1000nm)

1 cm

Cuarzo o sílice fundida

UV (<350 nm)
 Espectro de absorción
Espectro de absorción: es un gráfico que muestra cómo varía A (є) al variar la
longitud de onda

Cada compuesto (de complejo a simple) presenta un espectro de absorción

característico.

Las longitudes de onda con mayor absorción (picos) corresponderán de forma

general a aquellas con las que se leerá la muestra para determinar su
concentración.
Espectro de absorción de pigmentos
 Espectrometría UV/Vis
La relación entre la absorbancia por
Fundamento una sustancia a una longitud de onda
Los picos de absorción UV/Vis están determinada y su concentración es
estrechamente relacionados con el directamente proporcional es decir:
tipo de enlace. a mayor concentración mayor
proporción de luz absorbida.
Esta restringida a un número
limitado de grupos funcionales
llamados cromóforos
Herramienta útil para identificar
grupos funcionales en una molécula.
Determinación cuantitativa de
compuestos que contienen grupos
absorbentes.
 Curva patrón
El proceso de determinación de una concentración desconocida es:
A partir de concentraciones conocidas de las cuales también se sabe su absorbancia (curva
patrón), es posible interpolar (intercalar) la concentración del problema sabiendo su
absorbancia (línea roja en figura siguiente)

Con base en que la Absorbancia guarda una

relación lineal con la concentración, se
comprende la existencia de una relación de
proporcionalidad entre la Absorbancia y la
concentración:

A1 / A2 = C1 / C2

Donde:

A1 = Absorbancia del problema.

A1 (problema) * Conc estándar
Conc. (problema) =
A2 (estándar)
A2 = Absorbancia de un estándar de
concentración conocida.
C1 = Concentración del problema.
C2 = Concentración del estándar.

Si despejamos C1 = Concentración del problema

 Curva patrón
Ejemplo de curva patrón para la determinación de safranina; donde se
solubiliza este colorante únicamente en agua siendo por tanto el agua misma
el tubo blanco o de referencia para la calibración del equipo (colorímetro o
espectrofotómetro)

TUBO Stock de Safranina Agua Destilada ml

(3 x10 -4 g/ml) ml
1 0 10 blanco de la
curva patrón
2 0.05 9.95
(no tiene
3 0.10 9.9 muestra solo
4 0.20 9.8 solvente)

5 0.40 9.6
6 0.80 9.2
 Resultado de una curva patrón
Absorbancia leída en el
Espectrofotómetro a 490 nm
de la curva de safranina
Tubos Absorbancia
1 0
2 0.135
3 0.253
4 0.417
5 0.658
6 0.574

7 0.768

Curva que no cumple la ley de

Beer- Lambert Curva de calibración
0,8
Existen, sin embargo, distintos factores 0,7
que afectan al cumplimiento de la ley de 0,6
Absorbancia

Beer- Lambert, especialmente a 0,5

concentraciones elevadas. Por ello antes 0,4

de proceder al análisis de una muestra 0,3

0,2 y = 0,1015x - 0,0409
es preciso comprobar experimentalmente R² = 0,8133
0,1
el rango de concentraciones en que
0
dicha ley se cumple, obteniendo la curva 0 1 2 3 4 5 6 7 8
de calibración que relaciona las Tubos
absorbancias con las concentraciones.