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Capítulo 6

Bandas de cromosomas

Huifang Huang y Jiadi Chen

Resumen

La formación de bandas cromosómicas es una técnica esencial utilizada en el cariotipo cromosómico para identificar cromosomas
normales y anormales con fines clínicos y de investigación. Las bandas de Giemsa (G), inversa (R) y de centrómero (C) son las
técnicas de bandas cromosómicas basadas en colorantes más comunes. La banda G implica la tinción de los cromosomas tratados
con tripsina y la banda R implica la desnaturalización en solución salina ácida caliente seguida de tinción con Giemsa. Las bandas C
se utilizan específicamente para identificar la heterocromatina mediante la desnaturalización de los cromosomas en una solución
alcalina saturada seguida de tinción con Giemsa. Se pueden seleccionar diferentes técnicas de bandeo para la identificación de
cromosomas.

Palabras claveBandas cromosómicas, cariotipo, bandas G, bandas R, bandas C

1. Introducción

En 1960, Nowell y Hungerford [1–3] identificaron que el cromosoma Filadelfia

se asoció consistentemente con la leucemia mieloide crónica, marcando el
comienzo de una nueva era en el campo del diagnóstico genético del cáncer.
Como sabemos, la identificación de anomalías cromosómicas es crucial no solo
para el diagnóstico y pronóstico en diferentes tipos de cáncer, sino también
para el seguimiento de la enfermedad residual mínima y/o la recaída.4]. El
cariotipo ahora es obligatorio para las neoplasias malignas hematológicas
recién diagnosticadas, especialmente la leucemia.5]. El cariotipo también es
ampliamente aceptado como el estándar de oro para el análisis genético, ya
que es el método más completo para la caracterización cromosómica en la
actualidad, incluso para los países en desarrollo. Los cromosomas se analizan
en metafase mediante el reconocimiento de patrones de bandas. Una banda
se define como la parte de un cromosoma que se distingue claramente de los
segmentos adyacentes al aparecer oscura o clara después de las técnicas de
bandas. Una banda que se tiñe de oscuro con el método de banda G (Fig.1)
puede teñirse ligeramente con el método de la banda R (Fig.2). Por lo tanto,
una serie continua de bandas claras y oscuras están presentes en los
cromosomas.6]. Las técnicas de bandas se pueden dividir en dos tipos
principales: (1) aquellas que generan bandas

Thomas SK Wan (ed.),Citogenética del cáncer: métodos y protocolos, Métodos en Biología Molecular, vol. 1541,
DOI 10.1007/978-1-4939-6703-2_6, © Springer Science+Business Media LLC 2017

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60 Huifang Huang y Jiadi Chen

Figura 1Cariograma humano con banda G que muestra 22 pares de autosomas, cromosomas sexuales X e Y

Figura 2Cariograma humano con banda R que muestra 22 pares de autosomas, cromosomas sexuales X e Y
 Bandas de cromosomas 61

que se distribuyen a lo largo de todo el cromosoma, como las bandas G y

R, y (2) aquellos que tiñen estructuras cromosómicas específicas con un
número limitado de bandas, como las bandas C (Fig.3).
Las bandas G y R son las técnicas de cariotipo más utilizadas para la
identificación del número de cromosomas, translocaciones, deleciones,
inversiones o amplificaciones de segmentos cromosómicos.7]. La banda G
implica la tinción de cromosomas tripsinizados con Giemsa. Las regiones ricas
en AT aparecerán oscuras, mientras que las regiones ricas en GC aparecerán
claras [8]. La banda R implica la desnaturalización de los cromosomas en una
solución salina ácida caliente seguida de la tinción de Giemsa. Este método
desnaturaliza preferentemente el ADN rico en AT y, en consecuencia, tiñe las
regiones ricas en GC no desnaturalizadas. Por lo tanto, las bandas G y R son en
gran medida complementarias. La banda G es la técnica más utilizada en la
actualidad, mientras que la banda R es la preferida en algunos países
europeos. Aunque la morfología de los cromosomas se visualiza mal en la
banda R, puede identificar anomalías en los extremos de los cromosomas que
a menudo están presentes en la leucemia.4].
Los cromosomas con bandas G generalmente se usan como
referencia estándar para las bandas cromosómicas.9]. Las bandas están
numeradas consecutivamente desde el centrómero en los brazos corto (p)
y largo (q) [10,11]. El número total de bandas o "resolución" en el cariotipo
humano depende de la condensación de los cromosomas y la etapa de la
mitosis. Una resolución de 350 a 500 bandas corresponde a los
cromosomas en la metafase tardía y una resolución alta (alrededor de 850
bandas) corresponde a los cromosomas en la profase media. A

Fig. 3Metafase humana con bandas C que muestra las regiones heterocromáticas constitutivas
de los cromosomas 1, 9, 16 e Y sonoscuramente manchado
62 Huifang Huang y Jiadi Chen

Una banda cromosómica con una resolución de 2000 bandas puede contener
aproximadamente 1,5 Mb de ADN, mientras que un cromosoma con una resolución de
350 bandas puede contener entre 7 y 10 Mb de ADN.12]. Un citogenético experto debería
poder detectar una eliminación de 5 a 10 Mb de ADN.
Las bandas C generalmente se usan para identificar la
heterocromatina. Las principales bandas C están presentes en el brazo
largo del cromosoma Y y cerca de los centrómeros de los cromosomas 1,
9 y 16. Los tamaños de estas bandas C pueden diferir entre individuos.
Las bandas C pueden detectar inversiones pericéntricas de los
cromosomas 1, 9 y 16 e identificar el cromosoma Y.13,14].
En nuestro laboratorio se utiliza el siguiente protocolo de bandas
cromosómicas. Los lectores pueden modificar este protocolo de acuerdo con
sus condiciones experimentales.

2 materiales

Todas las soluciones deben prepararse con agua ultrapura y reactivos de grado
analítico y pueden almacenarse a temperatura ambiente (a menos que se indique lo
contrario). Todos los materiales de desecho deben eliminarse de acuerdo con las
reglamentaciones locales o institucionales.

1. Tripsina al 2,5 %: Añadir 2,5 g de tripsina a 100 ml de solución salina

fisiológica. Mézclalo ligeramente (verNota1). Guarde la solución a 4 °
C durante la noche. Al día siguiente, divida la solución en alícuotas en
tubos de 0,5 ml y guárdelos a -20 °C.
2. Solución amortiguadora de fosfato (pH 6,8): agregue
aproximadamente 100 ml de agua a un cilindro graduado de 1 l o un
vaso de precipitados de vidrio (verNota2). Añadir 19,08 g de Na2HPO4
y 1,82 g de KH2correos4al cilindro y llenar el cilindro con agua
(alrededor de 900 mL). Mezclar bien (verNota3) y enrasar hasta 1 L
con agua destilada. Ajuste el pH a 6,8 con HCl o NaOH.
3. Solución de Earle: Agregue aproximadamente 100 mL de agua a
un cilindro graduado de 1 L o un vaso de precipitados. Añadir 6,8
g de NaCl, 0,4 g de KCl, 0,164 g de NaH2correos4·2H2O, 0,2 g de
MgSO4·7H2O, 1,0 g de glucosa, 0,225 g de Na2HPO4, 0,01 g de rojo
de fenol y 0,2 g de CaCl2al cilindro. Llene el cilindro con agua
destilada (alrededor de 900 ml). Mezclar bien y enrasar hasta 1 L
con agua destilada. Ajuste el pH a 6,8 con HCl o NaOH (verNota4).

4. Ba(OH) al 5 %2solución alcalina: Añadir 25 g de Ba(OH)2en una botella

con 500 mL de agua destilada. Mezcle bien para asegurarse de que el
Ba(OH)2está completamente disuelto (verNota5).
5. 2x Citrato de sodio salino (SSC): Agregar 17,5 g de NaCl y 88,2 g de
citrato de sodio a un cilindro con 100 mL de agua destilada. Agregar
agua destilada a un volumen de aproximadamente 900 mL. Mezclar
bien y enrasar hasta 1 L con agua destilada. Ajuste el pH a 7,0 con HCl
o NaOH.
 Bandas de cromosomas 63

6. Fijador de Carnoy: metanol y ácido acético glacial (3:1, v/v). La

solución debe estar recién preparada y utilizada en unas pocas
horas (verNota6).
7. Portaobjetos de microscopio (verNota7).

8. Tinción de Giemsa.

9. Frascos Coplin.

3 métodos

3.1 Metafase La temperatura y la humedad del aire preferibles para lograr una difusión
Extensión cromosómica óptima son 25 °C y 50–55 %, respectivamente.

1. Los portaobjetos primero se sumergen en ácido sulfúrico concentrado,

luego se lavan con agua destilada y se sumergen en alcohol al 75 %
durante la noche.
2. Cambiar el fijador de Carnoy antes de aplicar. Centrifugar la
suspensión celular a 300×gramodurante 5 min. Deseche el
sobrenadante y agregue unas gotas de solución fijadora de Carnoy
fresca para obtener una suspensión ligeramente turbia (verNota8).
3. Por lo general, se distribuyen cuatro portaobjetos con células para cada paciente. Hay
una variedad de métodos disponibles para esparcir la suspensión celular en
portaobjetos. Este es un método utilizado en nuestro laboratorio. Los portaobjetos
se sumergen primero en alcohol al 20%. Luego, se dejan caer secuencialmente dos
gotas de suspensión celular desde una altura de aproximadamente 30 a 50 cm
sobre el portaobjetos en posiciones de un tercio y dos tercios de la longitud del
portaobjetos, respectivamente (verNota9). El portaobjetos se agita brevemente
sobre una llama para acelerar el proceso de secado. El portaobjetos está etiquetado
con el número de identidad del paciente y el método de preparación con el código D
para preparación directa y el código C para cultivo a corto plazo (verNota10).

4. Compruebe la densidad celular y la distribución de los cromosomas en el primer

portaobjetos preparado con un microscopio bajo el objetivo de 10x.

5. Ajuste la densidad de la suspensión celular en consecuencia si es

necesario.

3.2 Bandas Los portaobjetos para bandas G deben envejecerse durante unos días. Podemos
acelerar el proceso incubando los portaobjetos en un horno a 75 °C durante 2 h (ver
3.2.1 Bandas G
Nota11).

1. Prepare las soluciones en el siguiente orden en una serie de frascos Coplin.

(a) 50 mL de tampón fosfato, pH 6,8 con 0,5 mL de tripsina al

2,5% (verNota12).
(b) 50 mL de solución salina fisiológica.
(c) 50 mL de agua destilada con 5 mL de tinción de Giemsa.
2. Colocar los frascos al baño maría a 37 °C por 15 min.
64 Huifang Huang y Jiadi Chen

3. Sumergir el portaobjetos en la solución de tripsina y agitar suavemente el

portaobjetos en la solución durante 10–15 s (verNota13).

4. Enjuague el portaobjetos con solución salina fisiológica en un frasco de Coplin durante unos
segundos.

5. Tiñe el portaobjetos con tinción de Giemsa en el frasco de Coplin durante 1

min (el tiempo de tinción puede variar según la concentración y la fuerza
de la tinción de Giemsa).
6. Enjuague el portaobjetos brevemente con agua del grifo.

7. Sople el tobogán con un ventilador eléctrico.

8. Explore las metafases para ver si los cromosomas tienen bandas G claras. Si las
bandas G no son lo suficientemente claras, ajuste el tiempo para la digestión
con tripsina y la tinción de Giemsa para los siguientes portaobjetos.

3.2.2 Bandas R 1. Coloque la solución de Earle (verNota14) en el baño de agua en

87,5 ºC (verNota15) durante al menos 30 min.
2. Los portaobjetos se colocan en la solución de Earle durante 100 min (verNotadieciséis).

3. Saque las diapositivas. Enjuáguelos brevemente con agua del grifo.

4. Seque al aire los portaobjetos.

5. Teñir los portaobjetos con 50 ml de solución de tinción de Giemsa al 10 % en un frasco de

Coplin durante 1 h.

6. Saque las diapositivas. Enjuáguelos brevemente con agua del grifo.

7. Seque al aire los portaobjetos. Luego, evalúe las metafases bajo un

microscopio.

3.2.3 Bandas C 1. Incube el portaobjetos en un horno a 75 °C durante 2 h.

2. Preparar 50 mL de Ba(OH) al 5%2solución alcalina (saturada) y 50

mL de solución 2X SSC en dos frascos Coplin.
3. Coloque los frascos en baño de agua a 60 °C durante 0,5 h.

4. Coloque el portaobjetos en solución alcalina durante 10 s a varios min

(verNota17).
5. Saque la diapositiva. Enjuague brevemente con agua del grifo.

6. Incube el portaobjetos con 50 mL de solución 2X SSC en un vaso de Coplin durante 1

hora.

7. Saque la diapositiva. Enjuague brevemente con agua del grifo.

8. Teñir el portaobjetos con 50 ml de solución de tinción de Giemsa al 10 % en un frasco

de Coplin durante 5 a 10 min.

9. Seque al aire el portaobjetos y evalúe las metafases.

4 notas

1. Una mezcla vigorosa dará lugar a burbujas.

2. Agregar una pequeña cantidad de agua primero ayuda a disolver fácilmente.
 Bandas de cromosomas sesenta y cinco

3. Un agitador magnético puede ayudar a mezclar más fácil y

completamente.
4. La solución de Earle debe almacenarse a -20 °C. Evite congelar y descongelar
repetidamente.

5. Los cromosomas deben estar saturados por el Ba(OH)2

Solución alcalina.
6. El fijador de Carnoy debe prepararse en el momento para lograr una buena extensión
de la metafase.

7. Los portaobjetos prelimpiados son esenciales para obtener una buena distribución. Los
portaobjetos deben limpiarse de nuevo antes de su uso.

8. Aún se pueden leer los caracteres o números escritos en el lado

opuesto de los tubos. La densidad celular se puede ajustar
agregando fijador de Carnoy nuevo (para dilución) o
centrifugación (para concentración).
9. La altura de caída debe ser de al menos 30–50 cm para obtener una buena
distribución.
10. Las otras dos formas de esparcir suspensiones celulares en portaobjetos son las
siguientes: (a) Se utilizan portaobjetos fríos. Suelte dos gotas de suspensión celular
desde una altura de aproximadamente 30 a 50 cm en un portaobjetos en posiciones
de un tercio y dos tercios de la longitud del portaobjetos, respectivamente. El
portaobjetos se agita brevemente sobre una llama para acelerar el proceso de
secado. Etiquete la diapositiva en consecuencia. (b) Etiquete los portaobjetos secos y
colóquelos sobre una bandeja para portaobjetos. Agregue una gota de suspensión
celular a cada portaobjetos. Luego, inmediatamente sople suavemente o "resople"
en los portaobjetos.

11. Las formas alternativas de envejecer los portaobjetos son: (a) Incubar los portaobjetos en un
horno a 60 °C durante la noche; (b) Incube los portaobjetos en un horno a 90 °C durante 1
h; (c) Incube los portaobjetos en un horno a 100 °C durante 20 min.

12. La concentración de la solución de trabajo de tripsina es del 0,25 %.

13. El tiempo de pretratamiento con tripsina debe ajustarse para cada caso de
acuerdo con la técnica de aplicación utilizada, la edad del portaobjetos, el
grado de contracción de los cromosomas y la morfología cromosómica. Un
tiempo de pretratamiento demasiado largo o demasiado corto dará como
resultado una resolución de bandas deficiente. A veces, el tiempo de
pretratamiento puede ser de hasta 1 minuto.

14. El pH de la solución de Earle debe ser 6,8; de lo contrario, la

calidad de las bandas R será deficiente.
15. Para bandas R, la temperatura del baño de agua debe ajustarse con
precisión a 87,5 °C.
16. Cada laboratorio debe explorar la temperatura de acuerdo con sus
propias condiciones para obtener la banda R ideal.
17. El tiempo de desnaturalización en solución alcalina depende de la edad del
portaobjetos. Se debe establecer un gradiente de temperatura basado en la
experiencia.
66 Huifang Huang y Jiadi Chen
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