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Universidad Particular de Chiclayo Facultad de Medicina Escuela Profesional de Medicina Humana

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Mtodos de bandeo cromosmico

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INTRODUCCION
Se entiende el conjunto de bandas transversales de tamao e intensidad de tincin diferentes que aparecen sobre cromosomas determinados segn un modelo de distribucin que depende del tinte utilizado. Como norma general se admite que el patrn de bandeo es el mismo para cualquier tejido dentro de una misma especie y que no cambie durante el desarrollo. El bandeo cromosmico es, esencialmente, un fenmeno del cromosoma fijado. Aunque las tcnicas de bandeo son muy variadas, todas ellas pueden agruparse en seis clases principales. La clasificacin inicialmente propuesta por la conferencia de pars, que presupone que en todos los casos hay una fijacin con fluidos que contiene acido actico, es la siguiente: Bandas Q, G, C, R, T y feulgen. A estos tipos de bandas habra que aadir las bandas de replicacin y las bandas de restriccin.

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Objetivos

Conocer los mtodos de Bandeos Cromosmicos

Identificar las nomenclaturas y grupos Cromosmicos.

El objetivo de esta ciencia ha sido el estudio de las bases citolgicas que pudiesen explicar satisfactoriamente los fenmenos hereditarios.

Tambin para poder saber en que podemos utilizar el mtodo de bandeo y sobre todo que resultados podemos tener de ese mtodo empleado..

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Bandeo Cromosmico

La heterogeneidad de la cromatina, las caractersticas qumicas de la misma hacen que al aplicar tratamientos diferenciales se resalte uno u otro de los tipos de cromatina existente, lo que en citogentica se conoce como Bandeo cromosmico. El advenimiento de las tcnicas de bandeo cromosmico, dotan hoy a la citogentica de una nueva herramienta otorgndole una mayor precisin en la individualizacin de los cromosomas, facilitando su agrupamiento y clasificacin morfolgica: la determinacin de aberraciones cromosmicas de importante Incidencia en animales con problemas de reduccin de la fertilidad: la localizacin de genes que confluyen al mapeo gentico. Los bandeos cromosmicos hacen posible que se tenga un mayor conocimiento acerca de la estructura cromosmica y de los reordenamientos que se producen en las distintas alteraciones tales como: fusiones y fisiones cntricas, translocaciones recprocas y en tandem; inverciones peri y paracntricas; delecciones; duplicaciones; contricciones secundarias.; gapss, fracturas

cromosmicas, etc. Por otro lado permiten realizar estudios evolutivos de especies relacionadas entre s.

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Morfologa de tres tipos principales de cromosomas humanos.

LOS GRUPOS CROMOSMICOS

En Citogentica se conocen los trminos de coloracin selectiva y diferencial cada una de ellas es especfica de un tipo de bandas. Las coloraciones selectivas colorean sitios especficos del mismo, se conocen las bandas C y NORs; las tcnicas de coloraciones diferenciales producen bandas a lo largo de cada uno de los cromosomas de un complemento, en este tipo se encuentran las bandas G y R (Verma y Babu 1989 citado por Henao y Gomez, 1999).

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Los Bandeos Morfolgicos:

se obtienen basndose en tcnicas inherentes a la heterogeneidad de la cromatina. Existe en ellos una relacin con protenas (histnicas y no histnicas) e interacciones ADN. Estos bandeos pueden ser a su vez clasificados en: tcnicas de tincin diferencial, mtodos de tincin selectiva, coloraciones con fluorocromos especficos aislados o combinados con colorantes no fluorescentes, y tinciones con anticuerpos fluorescentes.

Los Bandeos Dinmicos:

Se obtienen basndose en: tcnicas que implican la incorporacin de una base anloga, bromo-desoxiuridina (BrdU), en el ADN durante la fase S del ciclo celular. Se denomina tambin bandeo de replicacin debido a la relacin existente entre el tiempo de incorporacin del BrdU y el patrn de replicacin. Cuando se incorpora BrdU durante la fase de replicacin temprana se obtiene un patrn de bandeo R destacndose las regiones ricas en G-C. Luego de realizada esta tcnica, los cromosomas pueden visualizarse utilizando distintos mtodos de tincin que emplean colorante tales como el Giemsa o el naranja de acridina o utilizando anticuerpos especficos.
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Por otro lado si se incorpora la base anloga durante la fase tarda de replicacin se obtiene un patrn de bandas G, destacndose las zonas de predominio de secuencias A-T. Los cromosomas pueden ser visualizados utilizando diferentes mtodos de tincin. En relacin con la nomenclatura para descubrir los diferentes bandeos cromosmicos, se emplea un cdigo de tres letras: la primera, indica el tipo de bandeo utilizado, la segunda, la tcnica de deteccin empleada y la tercera, el tipo de tincin.

Nomeclatura De Bandeos Morfolgicos.

QFQ: Bandas Q por fluorescencia usando quinacrina.

GTG: Bandas G por tratamiento enzimtico con tripsina utilizando Giemsa.

RFA: Bandas R por fluorescencia usando naranja de acridina.

RHG: Bandas R mediante desnaturalizacin trmica utilizando Giemsa.

THG: Bandas T por desnaturalizacin trmica empleando Giemsa.

CBG: Bandas C por hidrxido de bario utilizando Giemsa. Nomeclatura de bandeos dinmicos.

GBG: Bandas G por incorporacin de BrdU utilizando Giemsa.

RBA: Bandas R por incorporacin de BrdU empleando naranja de acridina.

RBG: Bandas R por incorporacin de BrdU utilizando Giemsa.

GB-AAu: Bandas G por incorporacin de BrdU empleando anticuerpos especficos unidos a partculas de oro coloidal.
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RB-AAu: Bandas R por incorporacin de BrdU usando anticuerpos especficos unidos a partculas de oro coloidal.

En todas las disciplinas siempre existen procedimientos de mayor uso que otros, as que en este mdulo slo hablaremos de las ms bandas cromosmicasms utilizadas en el cotidiano del ejercicio de la Citogentica.

Banda C
La tcnica de Banda C fue descubierta por casualidad y originada en un experimento en donde ADN satlite marcado en ratn fue hibridizado in situ con cromosomas de raton. En este experimento, el ADN del cromosoma fue desnaturalizado con NaOH y renaturalizado en buffer SSC. Los sitios hibridizados fueron detectados por autoradiografa usando coloracin de Giemsa para cromosomas. La prueba de hibridizacin preferencialmente fue en las regiones centromericas de los cromosomas. Sin embargo tambin se noto que el Giemsa coloreo otras regiones en otros cromosomas (Fukui y Nakayama, 1996) Esta banda se caracteriza por teir aquellas regiones ricas en heterocromatina constitutiva que corresponden a secuencias de ADN altamente repetitivas; se encuentran principalmente en centrmero, telmeros y ADN satlite y en ocasiones constricciones secundarias como son los NORs. Despus del descubrimiento de las tcnicas de banda C se desarrolladas tcnicas para cromosomas de mamferos. Mientras en animales se utiliza NaOH para el paso de la desnaturalizacin, el Ba(OH)2 es usado para producir banda C en cromosomas de plantas siguiendo el mtodo de Summer. l fue el primero en sugerir que la coloracin oscura del Giemsa coloreaba heterocromatina constitutiva causada por la preferencia del ADN altamente repetitivo durante la renaturalizacin Los sitios de los cromosomas que presentan heterocromatina constitutiva y que tien Banda C positiva son 1) en la regin del centrmero 2) alrededor de la regin organizadora nucleolar 3) cerca del sitio del RNA para 5S y 4) en la parte final de los cromosomas es decir la heterocromatina telomerica, en general estas
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localizaciones se conocen como centromerica e intercalar y la ltima categora incluye todas las otras posiciones (Yunis y Yasmineh, 1972 citado por Maclean y Vaughan, 1978). En el campo de la investigacin para aclarar qu tipo de elementos son los que se remueven dentro del tratamiento de esta banda, en un estudio en donde se analiz HCl 0.2 N el cual es una de las soluciones utilizadas para realizar tratamiento para banda C se encontr por medio de electroforesis la presencia de las 5 protenas histnicas, la que presentaba una banda de mayor intensidad fue la H3 y H4, estando presentes tambin las otras pero en menor cantidad (Burkhoder&Duezek, 1980). Para cromosomas de plantas, la estandarizacin de las tcnicas en Banda C han mejorado en su resolucin y el mtodo ha sido utilizado para la identificacin de cromosomas. En plantas esta tcnica identifica las secuencias que contienen gran cantidad de ADN repetitivo. Por ejemplo en cultivos de centeno Secalecerealeen hibridizacinin situ es utilizada para detectar zonas de ADN altamente repetitivode las cuales solamente unas pocas colorean Banda C positiva (Fukui y Nakayama, 1996). Por su parte, en muchas especies de animales domsticos se han encontrado complementos cromosmicos que por las tcnicas convencionales de coloracin no pueden ser ordenados completamente, debido a la presencia de cromosomas con rasgos morfolgicos muy similares. Esto sucede, por ejemplo: con los cromosomas 8, 9 y X del cerdo; con el 11 y el 12 de la misma especie; con los cromosomas 14, 15, 16, 17, 18 y 19 del equino; con los cromosomas 23, 24, 25, 26 y 27 tambin del equino; y con gran parte de los cromosomas del bovino, del ovino y del caprino. Lo anterior gener la necesidad de desarrollar tcnicas de coloracin denominadas de bandeo, o sea, aquellas que producen patrones constantes de bandas claras y oscuras, caractersticos de cada cromosoma que permiten identificar los cromosomas sin ambigedades (Henao y Gmez, 1997).

Las tcnicas de bandeo han permitido tanto en animales como en vegetales, tambin, la deteccin de un gran nmero de aberraciones cromosmicas, con la
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correspondiente definicin de los componentes del complemento comprometidos en el problema.

Bandas Ag-NOR
Se conoce como bandas Ag-NOR aquella que colorea las Regiones Organizadoras Nucleares ( de ah la nomenclatura NOR) en ocasiones son tambin llamadas Banda N, su coloracin es debido a la afinidad con el Nitrato de Plata. La Regin Organizadora Nucleolar es el sitio en donde estn localizados los genes de ADNr; el nucleoloesta compuesto por cinco componentes estructurales, el centro fibrilar, el componente fibrilar, el componente granular, el intersticio nucleolar, y la cromatina condensada asociada. (Goessens, 1984) En eucariotas el organizador nucleolar consiste de mltiples repeticiones arregladas en tandem, de las secuencias para ARN-r 18S y 28S intercalado con secuencias espaciadoras. Los espacios pueden ser transcritos, pero su transcripcin nunca incluye un ribosoma maduro. Usualmente se refiere a ADN ribosomal (ADN-r) como una repeticin de genes con secciones en tamdem arregladas y agrupadas dentro de uno o varias regiones del set de cromosomas (Champman y may, 1993) Este tipo de banda se debe especficamente a la presencia de las protenas afines a la actividad transcripcional en los cistronesribosomales (Henao y Gmez, 1997).Durante la metafase estos estn localizados generalmente dentro de laconstriccin secundaria (Howell 1982) Citado por (Fakan y Hernndez-Verdun, 1986). El comportamiento del nucleolo en proliferacin celular es llamado ciclo nucleolar, se considera que el ciclo comienza en el momento en que en interfase este o no la decisin de entrar en proliferacin o diferenciacin, se considera que el ciclo comienza cuando el nucleolo se organiza nuevamente seguido de las fases de la mitosis, es decir el nucleolo no es una entidad nuclear individual (De la Torre y Jimnez-Martn, 1982) .

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Ante todo y de gran importancia es de anotar que esta banda es funcional, es decir, es positiva siempre y cuando las Regiones Organizadoras Nucleolares hayan estado en actividad la interfase inmediatamente anterior al momento de realizar la banda, es decir la banda se expresa en las metafases obtenidas cuando los genes de ADNr hayan sido transcritos.

Un anlisis morfo-funcional de las Regiones Organizadoras Nucleolares teniendo en cuenta los ciclos circadianos demostr la relacin directa de los centro fibrilares ( uno de los componentes del NOR) con la actividad nucleolar. (Fakan y Hernndez-Verdun, 1986 . En un estudio sobre protenas asociadas con los NORs se estableci que estas son no histonicas y son argyrophilic Las proteinas NOR estn estrictamente localizadas dentro del centro fibrilar y el componente fibrilar denso del nucleolointerfasico (Fakan y Hernndez-Verdun, 1986). En general, el nucleolo crece durante la interfase, algunas veces el volumen es proporcional al incremento tanto de el componente fibrilar y el granular, pero en mayor proporcin de la acumulacin del componente granular. La talla final del nucleolo maduro en el ciclo celular aparentemente no es una funcin estrictamente lineal del numero de genes ribosomales que el NOR posee (De la Torre y JimnezMartn, 1982). Son varias las aplicaciones de las bandas NOR entre otras se tiene que: (tomado de Camacho, 1999) con la banda NOR se puede establecer el grado de variabilidad de los patrones inter e intra especficos entre especies y/o poblaciones, pues tanto los cromosomas portadores de NOR como la posicin en el cromosoma son usualmente diversos entre especies (Disney y Wright, 1987; Takai y Ojima, 1986 citado por Oberdorff et al, 1990). La diferencia en talla entre NORs homlogos ha sido descrita en varias especies de vertebrados (Miller et al., 1977; Ruiz el al., 1981; Galetti et al., 1984 citados por Sanchez et al., 1990). Esta variacin interespecfica ha sido utilizada para probar hiptesis filogenticas e inferir otras, antes basadas principalmente en datos morfolgicos (Amemiya yGold, 1990); parece ser que las alteraciones en los NOR ocurren normalmente
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con relacin a la diferenciacin y evolucin de las especies (Oberdorff et al, 1990). La variacin intraespecfica puede ser usada para averiguar el origen maternal y paternal de los cromosomas en un individuo (Mellink et al, 1994) constituyndose la actividad del NOR como una propiedad heredable cuyo tipo de transmisin puede ser mendeliana (Jotterand y Van Melle, 1981); adems los NOR activos muestran variacin de generacin en generacin mientras los inactivos no (Zakharov et al, 1982 citado por Mellink et al, 1994).

En plantas se encontr tambin que el mtodo servia no solo para localizar Regiones Organizadoras Nucleolares sino para identificar cromosomas en cereales, adems de encontrar una relacin entre bandas C y Namda N lo cual fue clarificado por Schlegel y Gill. Tambin se realizo tcnicas de una banda N secuencial con hibridacin in situ para identificar cromosomas con las la posicin especifica de ADN, la metafase primero es identificada en sus patrones de bandas y despus se destina para hibridizacin in situ as se puede recurrir a la misma clula en metafase, de esta manera se permite una asignacin directa de los sitios de hibridizacin con cromosomas individuales (Fukui y Nakayama, 1996).

Bandas GTG
Las bandas G deben su nombre al hecho de que en todas sus modalidades se emplea Giemsa para colorear los cromosomas. Esta tcnica que, en trminos generales, es la ms usada en mamferos, por permitir excelentes preparaciones permanentes sin requerir el uso de microscopio de fluorescencia, se basa en un tratamiento que altera la estructura de las protenas cromosmicas seguido de una coloracin. El mtodo de denaturacin trmica descrito por Sumner et al. (1971), es conocido como ASG (Acid-Saline-Giemsa) y se constituye en la primera tcnica de bandas G conocida. En esta modalidad se logra la denaturacin proteica mediante un tratamiento con 2XSSC (Solucin Salina Citratada) caliente. Sin embargo, el mtodo ms usado en la actualidad es el conocido con el nombre de bandas GTC (bandas G por Tripsina usando Giemsa
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como colorante); fue introducido por Seabright en 1971, y como su nombre lo indica, se basa en una digestin enzimtica con Tripsina. Se asume que el mecanismo por el cual se produce el patrn de bandeo G es porque el colorante interactua con las protenas de cromosoma, al parecer ricas en grupos disulfuro en las bandas positivas (oscuras), y en grupos sulfhidrilo en las negativas (claras) (Verma y Babu, 1989). Se acepta, adems, que la extraccin diferencial de protenas ocurrida durante la fijacin y los

tratamientosde denaturacin, juega un papel muy importante en la obtencin de estas bandas. Rooney y Czepulkowski (1987), consideran que las bandas G oscuras corresponden con las crommeras del paquiteno, que se presentan en segmentos de DNA de replicacin tarda, con alto contenido de Adenina y Timina, y con relativamente pocos genes activos (Henao y Gmez, 1999).

La banda G ha sido reportada en muchos grupos animales pero por ejemplo en varias especies de peces esta banda no resulta positiva pues al parecer muchos de ellos no poseen compartamentalizadin del ADN en isocoros quienes serian los responsables del bandeamiento. su parte en plantas los reportes son pocos, e inclusive su existencia se ha puesto en duda. Sin embargo en un anlisis de centeno, S. cerealeal construir el cariograma despus de tratamiento de banda G, se identificaron los cromosomas homlogos por los patrones de tipo de bandas oscuras y claras, se estableci diferencias con los patrones obtenidos en banda C, mientras banda C positiva produce grandes bandas telomericas y algunas intersticiales Banda G produce ms intersticiales que banda C negativa. Aunque los resultados obtenidos son prometedores en este caso se hace necesario mejorar antes las tcnicas antes de utilizarlas en la identificacin de cromosomas en plantas (Fukui y Nakayama, 1996)

Bandas RHG:

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Este patrn de bandas es, en trminos generales, el inverso (reverse) de las bandas G, o sea, las bandas G-positivas son R-negativas, y las G-negativas son R-positivas; se les denomina bandas RHG para significar que son bandas reversas obtenidas por calor usando Giemsa como colorante. La tcnica original se basa en una denaturacin trmica selectiva en buffers de diversa naturaleza, seguida por una coloracin de cromosomas con Giemsa (Dutrillaux y Lejeune, 1971). Respecto al mecanismo de produccin de este patrn de bandeo, se asume que depende de la denaturacim selectiva que produce el calor en ciertas zonas del cromosoma, al parecer asociadas con segmentos de DNA ricos en Adenina-Timina; en este caso las bandas oscuras son las zonas ricas en Guanina-Citocina, o sea, las que resisten el calor. Verma y Babu (1989) describen el siguiente protocolo para estas bandas: (Henao y Gmez,1999).

Entre las mltiples tcnicas de coloracin diferencial conocidas hoy, es preciso resaltar la importancia de las bandas G y de las bandas R en la definicin de los cariotipos de la mayora de los animales de importancia zootcnica. Entre las tcnicas selectivas, las de mayor importancia son las bandas C y las bandas NOR,por su aporte tanto a la identificacin cromosmica como a los estudios de heteromorfismos.

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ALGUNAS ABREVIATURAS DE LA NOMENCLATURA CROMOSMICA

Ideograma del cromosoma 14 a distintos niveles de resolucin (400, 550 y 850 bandas) ilustrando la nomenclatura de Pars de brazo, regin, banda, subbanda y subsubbanda. Tomado de la revista Human Pathology, V 12, 6:495 (1981). W. B. Saunders Company. (modificado)

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Para designar una banda en particular se acord poner primero el nmero del cromosoma seguido del smbolo del brazo, el nmero de la regin, el nmero de la banda, subbanda, etc., todo seguido y sin dejar espacios. Ejemplo, 14q32.3 es la designacin para la subbanda 3, de la banda 2, de la regin 3, del brazo largo del cromosoma 14. Al leerlo de corrido, los nmeros que corresponden a regin, banda y subbanda deben decirse separadamente y no como decenas. Las bandas permiten tambin el mapeo de genes en el cromosoma, es decir la designacin del locus (pl. loci). Muchos rearreglos cromosmicos han permitido la identificacin de genes debido a los efectos fenotpicos de la disrupcin de estos.

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INTERPRETACIN DE LA NOMENCLATURA DE BANDAS CROMOSMICAS.

Observacin: 7q31.2 es el locus el gen de la Fibrosis Qustica. Cuando de describe la composicin cromosmica, o cariotipo, de un individuo adems del nmero total de cromosomas y el par sexual se puede tambin indicar ganancia o prdida de un cromosoma poniendo +13 o -16 y se interpreta como la presencia de un cromosoma 13 extra o la ausencia de un cromosoma 16 respectivamente, o lo que es lo mismo una trisoma 13 o una monosoma 16. Cuando ocurre una translocacin recproca entre dos cromosomas se pone t(8;14)(q24;q32) que indica que los cromosomas involucrados son el 8 y el 14 y los puntos de ruptura estn en 8q24 y 14q32. Cuando hay aumento del bloque de heterocromatina en los cromosomas que normalmente lo contienen se usa colocar h+ junto al brazo del ese cromosoma, por ejemplo 9qh+, y se interpreta un polimorfismo ya que esta es una variacin frecuente en la poblacin normal. Ejemplos del uso de la nomeclatura en algunas anomalas cromosmicas: a- 47,XX,+21: trisoma 21 en una mujer ( sndrome de Down). b- 47,XY,+18: trisoma 18 en un varn (sndrome de Edwards). c- 45,X:monosoma del X (sndrome de Turner) d- 47,XXY: trisoma de cromosomas sexuales (sndrome de Klinefelter)

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CONCLUSIONES

Se Conoci los diferentes mtodos de Bandeo Cromosmico Se identificacin y reconocieron los diferentes tipos de nomenclatura y los grupos cromosmicos. Pudimos identificar gracias a la ciencia de bases citolgicos a los fenmenos hereditarios en los cromosomas . Logramos saber que los mtodos de bandeo cromosmico son importantes en lo que es citogentica .

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REFERENCIAS BIBLIGRAFICAS

Elsevier-

Espaa-

Emery, elementos de gentica mdica.

Amazon.com. Pag. 33 Juan ramn Lacadena- - citogentica. Editorial complutense. Pag 80 85 (http://www.geocities.com/ResearchTriangle/Lab/2513/bandeos.htm

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