República Bolivariana de Venezuela

Ministerio del Poder Popular para la Educación

Universidad Nacional Experimental “Rómulo Gallegos”
Área de Medicina Veterinaria; Núcleo Zaraza – Estado Guárico

Trabajo Práctico Microbiología. 1 parte

enterobacterias

Profesor: Integrantes:
Solimer Salazar. Adrian Leal 30.218.207
Carlos Rengifo 28.442.608
Endel Rodríguez 28.001.210
Luis Medina 28.001.673
Las enterobacterias se definen bacteriológicamente como microorganismos de forma bacilar Gram
negativos aerobios o anaerobios facultativos con capacidad de desplazamiento o motilidad por
flagelación petrificada, aunque haya excepciones donde no tengan motilidad catalasa positiva con
diferentes características bioquímicas por lo tanto se deben diferenciar a través de la serie IMVIC,
que permite diferenciar las capacidades bioquímicas de cada género.

Se estará trabajando con:

 E. Coli.
 Klebsiella.
 Proteus.
 Shigella.

Se abordarán estos cuatro a fines de que E. Coli y Klebsiella sean estudiados como géneros
fermentadores de lactosa y el género Proteus y Shigella como géneros no fermentadores de
lactosa.

Se empezará con un frotis del microorganismo donde tomando de una lámina portaobjetos una
muestra de la cepa bacteriana y posteriormente fijándola con calor luego que se realice el frotis, y
luego procediendo a realizar la tinción de Grahm.

Luego de esto, se puede realizar al microscopio la observación de la morfología del organismo;

tamaño, forma, si son bacilos largos y delgados, o si son bacilos cortos, y se podrá establecer un
cuadro comparativo de la morfología de bacilo en los cuatro géneros bacterianos.

Por otro lado, realizando la tinción de Grahm, se puede observar su agrupación, si quedan los
bacilos una vez que se dividió el microorganismo quedan solitarios como células unitarias o
quedan agrupadas, en parejas, en cadenas, se puede observar la agrupación y como punto central
de la tinción de Grahm ver como se tiñen la pared, si retiene el cristal violeta o retiene el colorante
safranina en su pared. Es decir, se observan bacilos rojos (Teñidos de color rojo).

La segunda prueba a ser realizada será poner en evidencia la capacidad de producción la la enzima
catalasa; La enzima catalasa le da capacidad a la cepa de patogenicidad, de manera que, tiene la
capacidad de disociar el óxido de hidrógeno en agua y oxígeno porque estas son sustancias tóxicas
para la membrana de la bacteria y si ella tiene la capacidad de producir esta enzima, como se sabe
que es capaz de producirlo los cuatro géneros (E.Coli, Klebsiella, Proteus y Shigella) que son
anaerobios facultativos, pues, ella podrá evadir la acción tóxica del peróxido de hidrógeno.

Se puede, entonces, tomar una muestra en una lámina portaobjetos de la cepa bacteriana y
ponerla en contacto con peróxido de hidrógeno. Al instante se podrá observar cómo se transforma
el peróxido en agua y oxígeno, emitiendo burbujas de oxígeno que se pueden fácilmente
evidenciar.

Para los cuatro géneros deberán obtenerse resultados positivos a catalasa.

Posteriormente se estará sembrando en placas a través de las técnicas de siembra por

estiramiento o “Zic-zac”. Se utilizará el agar nutritivo para que después de las 48h del período de
incubación, poder describir cada una de las colonias de los cuatro géneros bacterianos, y realizar
un cuadro comparativo en cuanto a: tamaño, forma, color, bordes, elevación y consistencia.

Se sembrará en agares selectivos y diferenciales como lo son: El agar EMB levine, y el agar
MacConkey. Que son agares selectivos para microorganismos Gram negativos y a su vez,
contienen lactosa. Se observará cómo la lactosa puede ser empleada y a través de los indicadores
de pH que tienen los medios poder observar los virajes de color en los medios, para entender la
fermentación de la lactosa. En estos medios diferenciales, se observarán unas características. En el
caso de los microorganismos fermentadores de lactosa las colonias tomarán una coloración
oscura, rosácea o rojiza (En el caso de E.Coli y Klebsiella). En las colonias de los microorganismos
no fermentadores de lactosa tomará una coloración transparente, blanquizca, (En el caso de
Proteus y Shigella).

Luego se procederá a sembrar las diferentes cepas bacterianas, los diferentes géneros de
enterobacterias, en tubos. También para observar las características de utilización de azúcares, se
sembrará en estos medios líquidos, como en el caldo glucosado, caldo lactosado, a las cuales se les
incorpora un tubo de durham en el interior para poder observar la capacidad que tienen durante
la utilización del azúcar, ver si hay desprendimiento o no de gas. En este caso, para la observación
de estos tubos se puede simplemente determinar por la turbidez la utilización del azúcar, y si
existe un desprendimiento de gas en el tubo, puede ser fácilmente detectado con una burbuja que
se instala, desplaza el medio líquido en el tubo de Durham donde luego aloja la burbuja. En el caso
de E.Coli existirá producción de gas a partir de la glucosa, en el caso de Shigella se observa que no
existe producción de gas durante la utilización de la glucosa. En el caso de Proteus puede que
exista una liberación de gas durante la utilización de la glucosa, y en el caso de la Klebsiella al igual
que E.Coli también puede emitir gas durante la utilización de glucosa.

Luego se tendrán lo medios líquidos como es el caldo bilis verde brillante, que es un medio líquido
selectivo para microorganismos Gram negativos por la bilis que tiene añadida que no permite el
crecimiento de microorganismos Gram positivos y se puede observar la turbidez en todo el tubo,
debido al crecimiento facultativo del microorganismo.

También se realizará la prueba para caldo Urea, en donde se pondrá en evidencia la existencia o
no de la enzima Ureasa para la degradación de la urea. Es primordial resaltar que para la prueba
de Ureasa lo que se pretende poner en evidencia si hubo la liberación de amonio como producto
de la hidrólisis de la urea, gracias a la enzima ureasa, el amonio alcaliniza el medio y el caldo urea
contiene un indicador de pH que es el rojo fenol, como se observará en los resultados, en el caso
de ser positivo a la ureasa en donde habría amonio en el medio alcalinizándolo se tornaría un color
fucsia como en el caso de Proteus que es ureasa positivo, mientras que en el caso de E.Coli no
cambiaría de color porque es ureasa negativo.

Se realizará también la siembra del Agar triple azúcar hierro (TSI). Este agar contiene tres azúcares
en donde habrá una mayor proporción de lactosa con respecto a la glucosa, en el caso del agar TSI
contiene lactosa, glucosa, sacarosa, contiene sales de hierro para poner en evidencia la producción
de ácido sulfhídrico y tiene un indicador de pH que es el rojo fenol. En el agar TSI se pondrá en
evidencia el ácido sulfhídrico. El comportamiento de los azúcares que se podrán poner en
evidencia también será para aquellos microorganismos fermentadores de lactosa como lo son en
el caso de E.Coli y Klebsiella, una vez que se agota la glucosa, ocurre un desprendimiento de ácidos
que acidifican el medio y es captado por el indicador de pH rojo fenol y tiene un viraje de color
rojo a amarillo, pudiéndose observar una mayor concentración de ácidos en el pico de flauta del
agar inclinado, tornándose todo el tubo en amarillo y cuando se agota la glucosa el
microorganismo empezará a “echar mano” de la lactosa manteniéndose la generación de
productos ácidos, por lo tanto, manteniéndose todo el tubo de color amarillo, este caso se
observará para E.Coli y Klebsiella. Solamente se pudiera observar cómo se revierte todo el tubo
hacia rojo si pasadas las 72h o más, donde ya no hay presencia de glucosa, donde a revertirse el
pH de ácido a neutralizarse y volver a ser el medio rojo, sería la única manera. Pero,
comparativamente poniéndose un lapso de 48h, se puede observar que para E.Coli y Klebsiella
mantenerse todo el tubo de color amarillo por la acidificación constante se utilizan ambos
azúcares. En el caso de Proteus y Shigella se puede observar cómo una vez agotada la glucosa no
pueden “echar mano” de la lactosa por lo tanto el ácido producido por la degradación de la
glucosa es revertido, neutralizado y se vuelve a poner el tubo que se tornó de un color amarillo,
vuelve a ser rojo, viéndose en el pico de flauta la coloración roja y hacia el fondo del tubo todavía
amarillo por no haberse neutralizado el ácido. Entonces, cuando se observa de color rojo intenso,
en el agar TSI para el caso de las no fermentadoras de lactosa, sería una forma de orientarnos, en
la utilización de la lactosa. Entonces, también se podrá poner en evidencia si existe un precipitado
de color negro por la formación del ácido sulfhídrico, esto debe verse en la superficie del agar,
permitiendo que en las sales de hierro haya el atrapamiento de ese gas y pueda precipitarse.

Luego se abordará la serie IMVIC en donde se montan las pruebas de indol, rojo metilo, Voges-
Proskauer y la prueba de citrato. En el caso de la prueba de citrato decimos que queremos saber
cuál es el fundamento si la bacteria es capaz de utilizar el citrato como fuente de carbono si esos
cuatro géneros utilizan el citrato como fuente de carbono, entonces vemos un Agar inclinado con
una coloración inicial verdosa qué es y si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como
fuente de carbono virara el azul de bromotimol qué es el indicador de pH, virara de color verde al
color azul. Entonces la importancia de este medio es que ese citrato de sodio que contiene y si el
microorganismo lo utiliza qué pasará, si habrá un sodio residual en forma de hidróxido de sodio
alcaliniza el medio y esa alcalinización es captada por el indicador de pH, en este caso, el azul de
bromotimol, y permitiendo el viraje de un color verde a un color azul intenso, gracias al pH
alcalino. Entonces se podrá ver como para E.Coli debería dar negativo porque no utiliza el citrato
como fuente de carbono, mientras que para bacterias como la Klebsiella pudiéramos observar el
viraje del color verde al color azul por que se utiliza el citrato como fuente de carbono.

Luego se procederá a hacer la prueba de indol en donde se inocula la cepa en un caldo peptonado
rico en triptófano, a fines de demostrar la presencia de la enzima triptofanasa. Una vez que estos
aminoácidos, el triptófano, puede ser utilizados podrá ser degradado por la enzima triptofanasa lo
que se va a detectar en el medio es la producción de indol y eso se detecta con el dimetilamino
benzaldehído y se verifica una coloración roja en el medio, entonces, como fundamento de la
prueba de indol es la presencia de la enzima triptofanasa que podemos poner en evidencia a
través del reactivo de Kovacs. Recordemos que se agregan después de que se incuban y crece el
microorganismo, allí le damos chance a que exprese esa enzima triptofanasa para utilización del
triptófano que enriquece este caldo peptonado, el indol se pone en evidencia con el reactivo de
Kovacs, añadiéndole 5 gotas al reactivo de Kovacs.
Finalmente se procederá a ver la prueba de rojo metilo Voges- Proskauer, en un mismo medio
donde se inocula, pero, en uno de los medios vamos añadir el reactivo rojo metilo, 5 gotas de
solución. Para saber si las bacterias toman durante la fermentación, la vía ácido mixta y en el caso
de la ruta, utilizar los reactivos de Alfa-Naftol y KOH, es para detectar si esa bacteria toma la ruta
de formación del 2,3-butanodiol en donde se detecta la acetoina como intermediario, en este
caso,el Alfa-Naftol y el KOH son los que ponen en evidencia esta ruta, entonces estas bacterias son
fermentadoras, producen ácidos, tienen diferentes rutas fermentativas. Lo que se quiere saber es
cuál de estos géneros tiene la ruta que ácido mixta o de formación de muchos ácidos como es el
caso del lactato, succinato, ácido acético, que van a permitir que el pH del medio descienda de una
manera tal, por debajo de 4.3 para que sea captado por el rojo metilo, mientras que en el medio
Voges-Proskauer lo que vamos añadir será Alfa-naftol y KOH, para evidenciar la acetoína como
intermediario de esta ruta butanodiólica.

Ahora se procederá a hacer el montaje: Se estará trabajando ahora con la inoculación de las cepas
de enterobacterias , se trabajará con dos géneros fermentadores de lactosa como lo son: E.Coli y
Klebsiella. Y con dos géneros no fermentadores de lactosa comolo son: Proteus y Shigiella.

Se inocula cada uno de los agares en placas (Agar nutritivo, Agar Levine, y el Agar MacConkey).

Igualmente se procederá a inocular todos los caldos nutritivos (Caldo lactosado, caldo glucosado,
caldo peptonado, caldo verde bilis brillante, el rojo metilo, Voges-Proskauer). E inoculando los
agares inclinados de caldo y TSI.