Universidad de Guayaquil

Facultad de Ciencias Médicas

Carrera de Medicina

Cátedra: Virología

Docente: Carmen Mosquera

Paralelo: 2

Grupo de exposición: 3

Integrantes:

Rodolfo Andrés Herrera Pimbo

Daniel Alfredo Jiménez Ochoa

Niza Gizeh Lozano Peñafiel

Andrea Verónica Narváez Jara

Tema: DETECCIÓN DE LA INFECTIVIDAD VIRAL

2019 – 2020 CI
 Contenido
Métodos de estudio de los virus ............................................................................................ 1
Animales de laboratorio ..................................................................................................... 1
Huevos embrionados .......................................................................................................... 4
Cultivos de células .............................................................................................................. 5
Cultivos de órganos ........................................................................................................ 7
Cultivo de tejidos ............................................................................................................ 7
Cultivo celular ................................................................................................................. 8
Reconocimiento del crecimiento viral en cultivos celulares ................................................ 11
Efecto Citopático (EPC) ..................................................................................................... 11
Hemadsorción................................................................................................................... 13
Interferencia ..................................................................................................................... 13
Ensayo de la infeccion viral .................................................................................................. 14
Ensayos cuantitativos ....................................................................................................... 14
Ensayo de placas ........................................................................................................... 14
Ensayo de transformación ............................................................................................ 15
Ensayo de pústulas ....................................................................................................... 15
Ensayos cualitativos .......................................................................................................... 16
Consideraciones estadísticas ........................................................................................ 16
Ácidos nucleicos infecciosos ......................................................................................... 17
Liberación del virus: purificación de las partículas virales ................................................... 17
Centrifugación diferencial ................................................................................................ 18
Centrifugación por gradiente de densidades ................................................................... 18
Centrifugación zonal ......................................................................................................... 18
Centrifugación isopícnica.................................................................................................. 18
Cromatografía en columna ............................................................................................... 18
Electroforesis en zona ...................................................................................................... 19
Métodos de contaje viral ...................................................................................................... 19
Hemaglutinación............................................................................................................... 19
Método de recuento de placas bajo agarosa (plaqueo) .................................................. 22
Método de Reed y Muench .............................................................................................. 22
 Detección de la infectividad viral
Además de los procedimientos
fisicoquímicos para el estudio de
la morfología viral, la detección de
infectividad es un importante
método de estudio de los virus.

Los virus al ser parásitos

intracelulares obligados no
pueden ser cultivados en ningún
medio carente de células, por muy complejo que esta sea. Algunos virus son muy estrictos
con respecto a los tipos de células que infectan, pero la mayoría pueden crecer en cultivos
celulares, animales de laboratorio y huevos embrionados.

Métodos de estudio de los virus

Animales de laboratorio

Es el procedimiento más antiguo para aislar y conservar virus. Puede producir desde una
enfermedad con lesiones típicas hasta la muerte. No tan utilizados en la actualidad ya que
los cultivos celulares son más fáciles de manejar y más versátiles. Además, tienen un alto

1
costo de mantenimiento, sus bioterios son complejos, existe riesgo de manipulación de
animales infectados y presencia de virus latentes en los mismos.

Sin embargo, son indispensables para: la investigación de patogenia, oncogenicidad e

inmunidad a virus; desarrollo de vacunas; y preparación de antisueros con fines
diagnósticos.

El primer experimentador biológico del que tengamos noticia histórica: es Acmaeon de

Crotona, el cual demostró la función del nervio óptico al seccionarlo provocando la ceguera
de un animal, en el año 450 a.C.

BREVE HISTORIA DE LOS ANIMALES DE LABORATORIO EN LA BIOMEDICINA

2
A continuación, se presenta una lista de los animales de laboratorio utilizados para el
aislamiento de diversos virus. La cantidad de inóculo es de 100 a 150 microlitros:

Primates: virus de la Ratones: virus rábico, Hámsteres: en virología

hepatitis, virus de la flavivirus, arenavirus, tumoral porque son muy
encefalopatía algunos virus Coxsackie y susceptibles a virus
espongiforme subaguda arbovirus. Togavirus y oncogénicos y pueden
arenavirus por inoculación eliminar antisueros valiosos
cerebral en lactantes

3
 Conejos: producción de
antisueros
Hurones: por instalación Primates, hamsters,
nasal, mixovirus conejos, ratones: para
experimentos sobre
mecanismos patogénicos y
sobre el papel de la
respuesta inmune

Huevos embrionados
Técnica descubierta por
Goodpasture, 1931y
desarrollada por Burnet
en años siguiente. Los
virus pueden inocularse
en diferentes
estructuras de huevos
de pollo o pato: en el
saco vitelino de
embriones de 5 días, en
la cavidad amniótica y
alantoidea en
embriones de 10 días, y
por vía corioalantoidea
en embriones de 11 o
12 días,
aproximadamente.

Los pasos para la

inoculación son los
siguientes:

1. Antisepsia 4. Tapar con tela adhesiva

2. Realizar un orificio en la cáscara 5. Incubar a 37º C por 5-7 días
3. Inyectar el inóculo viral 6. Observar los signos de crecimiento

4
Los signos de crecimiento pueden ser: la muerte por herpesvirus, parotiditis y algunos
Orthomyxovirus; detectación antígenos (hemaglutininas) sin lesiones aparentes; pústulas
(pocks) por poxvirus y herpesvirus.

MEMBRANA VIRUS SIGNOS DE

CRECIMIENTO
Saco vitelino  Herpes simple Muerte

Corion  Herpes simple Pústulas

 Poxvirus
 Sarcoma de
Rous

Alantoides  Influenza Hemaglutinación

 Viruela
 Sarampión
 Mixovirus

Anmios  Parotiditis Muerte

 Paramixovirus
 Mixovirus

VENTAJAS DEL USO DE HUEVOS EMBRIONADOS PARA EL CULTIVO DE VIRUS

 Son bacteriológicamente estériles

 Poseen escasos virus latentes
 Carecen de respuesta inmune
 De fácil manipulación
 Su uso está restringido a la producción de vacunas para la influenza y aislamiento de
orthomyxovirus y poxvirus

Cultivos de células

Historia

5
El cultivo de tejidos se desarrolló a partir de los últimos
años del siglo XIX como una continuación de las
técnicas de la embriología. En el año 1885, Wilhem
Roux mantuvo células de embrión de pollo en solución
salina durante unos días.

En 1907, Harrison fue el primer científico que empleó

técnicas in vitro para el estudio de fenómenos in vivo,
realizando cultivos de médula espinal embrionaria de
anfibios.

 Burrows (1910) empleó plasma de pollo para

nutrir los explantes de tejidos embrionarios de
pollo. Este medio se reveló mucho mejor que los
anteriormente probados, lo que le permitió observar el crecimiento del tejido
nervioso, corazón y piel.
 Rous y Jones (1916) emplearon por vez primera extractos enriquecidos en tripsina
para disociar las células de embriones de pollo, estableciendo el primer cultivo
celular.
 En 1913 Carrel demostró la posibilidad de mantener en cultivo células extraídas de
un animal, embrión de pollo, durante un periodo de tiempo superior al de la vida de
éste.
 Mantuvo en cultivo células de pollo durante 34 años. Gran parte del éxito en el
mantenimiento de los cultivos se debió al desarrollo del denominado frasco de
Carrel.
 Entre los años 1920 y 1940 se desarrollaron diferentes estrategias de obtención de
cultivos y de mantenimiento de las condiciones estériles, pero sin grandes avances
 En 1948, Earle y col. aislaron células de la línea celular L y mostraron que eran
capaces de formar clones en el cultivo de tejidos.
 En 1952, Gry y col. establecen la primera línea celular humana, las células HeLa. El
medio empleado era extremadamente complejo y poco definido: plasma de pollo,
extracto de embrión bovino y suero de cordón umbilical humano.
 En 1954, Rita Levi-Montalcini y col. establecen que el factor de crecimiento nervioso
estimula el crecimiento de los axones en tejidos en cultivo. Este trabajo supuso el
 En 1955, Eagle realiza la primera investigación sistemática de los requerimientos
nutritivos de las células en cultivo.

6
  En 1961, Hayflick y Moorhead establecieron que la duración de los cultivos de
fibroblastos era finita: podían mantener estos cultivos durante 12 pases. No
consiguieron establecer líneas estables.
 En 1965, Ham introduce el primer medio definido libre de suero capaz de mantener
algunas células de mamífero en cultivo indefinidamente.
 En 1969, Augusti-Tocco y Sato establecen la primera línea celular estable de
neuroblastoma aislando clones que establecían procesos nerviosos y que eran
eléctricamente excitables. Se empiezan a establecer las primeras líneas celulares
diferenciadas.
 En 1975, Kohler y Milstein establecen la primera línea celular productora de
anticuerpos monoclonales. El establecimiento de la tecnología de obtención de
anticuerpos monoclonales les valió el Premio Nobel

Métodos de cultivo celular

Cultivos de órganos

Pueden mantenerse IN VITRO por varios DIAS o durante SEMANAS antes de que pierdan su
arquitectura original y su función.

Muy útil para el aislamiento de infecciones persistentes tales como:

 El virus de la Artritis-Encefalitis-Caprina (Retroviridae: Género:Lentivirus

 explantes traqueales como los Coronavirus

Cultivo de tejidos

Cultivo IN VITRO de fragmentos en suspensión de tejidos desmenuzados o a los explantes

de tejidos embebidos en plasma coagulo.

7
Cultivo celular

El tejido se disocia hasta obtener una suspensión de células aisladas, ya sea mecánica o mas
fácilmente con la ayuda de enzimas proteolíticas.

Medios de cultivo celular

Solución isotónica de sales simples,

glucosa, vitaminas, coenzimas y
aminoácidos.

Amortiguada a PH 7.4

Tiene antibióticos para inhibir el

crecimiento de bacterias.

8
Tipos de células cultivadas

Cultivos primarios

 Pequeños trozos de tejido se tratan con tripsina

 Se lavan las células y se cuentan las células en cámaras
cuenta globos (tipo Nerbauer)
 Se siembran en tubos, en condiciones estériles. Se
añade medio nutritivo con antibióticos y antimicoticos
y se incuban en estufa a 37º C
 Las células se adhieren a la superficie
 Se dividen (5 o 10), formando con el tiempo una
monocapa con aspecto de células epiteliales o
fibroblásticas
 Inhibición por contacto

Los cultivos primarios mas utilizados son: Fibroblastos de

riñón de primates, pollo, raton, riñón embrionario o amnios
humanos, células embrionarias de distinto origen,
fibroblastos de prepucio humano: amplio espectro de
sensibilidad a los virus.

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Líneas celulares continuas

 Luego de varios pasajes puede ocurrir una transformación

 Crecimiento ilimitado in vitro –líneas inmortales
 Aneuploidía
 Origen normal
 Sensibilidad limitada
 Bajo costo

Líneas celulares diploides

 Tratar las células de la monocapa con tripsina

 Seleccionar del cultivo primario, células que conserven morfología intacta, número
normal de cromosomas, capacidad de crecimiento durante un número limitado de
subcultivos
 Pueden duplicarse hasta 50-80 veces
 Alta sensibilidad a muchos virus
 Aptas para la producción de vacunas humanas

Células Provenientes de

MRC-5 Riñón del mono

WI-38 Ser humano

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Reconocimiento del crecimiento viral en cultivos celulares
Efecto Citopático (EPC)

La mayoría de los virus, pero no todos, matan a las células en las que se multiplican y el
Efecto Citopatico o EPC es cuando las capas celulares infectadas desarrollan pruebas
histológicas de daño celular y los viriones recién formados se diseminan para involucrar
cada vez más células en el cultivo del virus responsable, el virus responsable de estos
cambios se denomina citopatógeno.

La mayoría de los EPC pueden ser observados aun en cultivos celulares sin necesidad de
fijar, ni teñir. Un observador experimentado puede distinguir varios tipos de EPC en cultivos
vivos, pero la fijación y tinción de las capas celulares es necesaria para la demostración de
detalles aún más finos como:

 Cuerpos de inclusión
 Los sincicios

La tinción de anticuerpos fluorescentes es usada para la observación de estos tejidos ya que

esta ayuda a reconocer los antígenos virales en los cultivos celulares.

EFECTO CITOPÁTICO DE LOS VIRUS EN LOS CULTIVOS CELULARES

11
La observación. - Es una técnica muy importante en el EPC ya que ayuda al diagnóstico
virológico, cuando se trata de aislar virus, el tiempo necesario para que este comience a
hacer manifiesto depende de:

 Número de viriones
 Velocidad del crecimiento del virus

Ejemplo. -

1. Enterovirus y virus de herpes simple, tienen un periodo latente corto y un alto grado
de réplica, con frecuencia muestran un ECP detectable después de 24 y 48 horas de
haber sido sembrados, destruyendo completamente la monocapa en el curso de 3
días.
2. Los citomegalovirus, los virus de la rubeola, el respiratorio sincicial y algunos
adenovirus de crecimiento más lento no pueden producir ECP detectable durante
semanas

Puesto que los cultivos celulares pueden demostrar una degeneración inespecífica es
necesario subcultivar estas células y los líquidos sobrenadantes de estos cultivos
pasándolos del cultivo infectado a monocapas frescas. Con frecuencia el ECP aparece
poco después de hacer estos “pases ciegos”, ya sea porque el procedimiento
incrementa el título del virus o porque han surgido variantes seleccionadas a crecer
mejor en los cultivos celulares.

12
 EFECTO CITOPÁTICO PRODUCIDOS POR DIERENTES VIRUS EN CULTIVOS CELULARES

Hemadsorción

La propiedad de absorber los eritrocitos agregados al

medio de cultivo, se debe a la incorporación de
proteínas virales que tienen afinidad por los eritrocitos
en la membrana plasmática. Las células cultivadas
infectadas con ortomixovirus, paramixovirus y
togavirus producen hemadsorción.

Interferencia

La multiplicación de un virus en la célula inhibe la

multiplicación de otros virus que penetran
posteriormente.

13
Ensayo de la infeccion viral
Dentro de estas pruebas están los ensayos cuantitativos y cualitativos

Ensayos cuantitativos

 Ensayo de placas
 Ensayos de transformación
 Ensayos de pústula

Ensayo de placas

Se agrega una suspensión viral a una capa de células cultivadas, los virus se adhieren a las
células, El medio se reemplaza por un gel sólido, La propagación de las partículas de la
progenie queda restringida a la vecindad inmediata de la célula infectada, Cada partícula
infectada origina un foco localizado de células infectadas que puede ser observado a simple
vista.

El ensayo de formación de placas es la metodología más utilizada para cuantificar virus.

Luego de la infección de una célula, la multiplicación viral resulta en la liberación de la
progenie que propaga la infección hacia las células vecinas. Sucesivas rondas de
propagación forman una zona circular de infección en la monocapa celular llamada placa.
Este ensayo utiliza un medio de cultivo semisólido que confina la propagación de la
infección y la formación de placas se revela mediante tinción de las células infectadas.

14
Cuando la infección viral provoca la lisis de las células infectadas se podrán distinguir placas
de lisis en la monocapa de células. Cuando las placas de lisis son lo suficientemente grande
se pueden ver a simple vista.

La idea del ensayo es poder identificar la dilución viral en la que se puedan contar entre 20
y 100 placas. Se realizan aproximadamente 4 a 6 diluciones para poder abarcar el rango en
el cual se pueden contar las placas.

En general, para la mayoría de los virus animales hay una relación lineal entre el número de
partículas infectivas y la cuantificación de placas. En otras palabras, una partícula infectiva
es suficiente para iniciar una infección y formar una placa.

Ensayo de transformación

Los virus oncogénicos interactúan con algunas células cultivadas en forma citocida,
Transforman otras células haciendo que adquieran propiedades malignas: Muestran poca
inhibición por contacto y Crecen de forma irrestricta y producen microtumores.

Ejemplos:

 Virus del sarcoma de rous la transformación es su método básico de ensayo de

infectividad.
 Virus tumorales ADN la transformación es un procedimiento relativamente
ineficiente

Ensayo de pústulas

El virus sintetizado se escapa de las células infectadas se disemina en la adyacentes de modo

que cada partícula infectante da a lugar lesiones localizadas, se usa para los poxvirus.

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Ensayos cualitativos
Registra si hay o no partículas virales infecciosas en el inoculo. Ensayo de todo o nada. No
tan preciso como los ensayos cuantitativos, se usa únicamente ahora para los virus en los
cuales no puede ser empleado satisfactoriamente el método de placa.
Consideraciones estadísticas
Muestran “Cinética de dos golpes” más que de un golpe indicando que dos diferentes tipos
de partícula viral deben de infectar a una sola célula con el fin de que una o dos
ocasionalmente pueda replicarse. Los virus adeno-asociados, algunos adenovirus-SV40
híbridos, y el virus del sarcoma murino, no pueden multiplicarse excepto en células
coinfectadas con un virus auxiliar. Se vera que en una dilución alta del inoculo, todos los
huéspedes permanecen sin afectar porque fallaron en recibir siquiera una unidad
infecciosa.

COMPARACIÓN ENTRE LAS TITULACIONES CUANTITATIVA Y CUALITATIVA DE INFECTIVIDAD

Dilución del virus Ensayo cuantitativo Ensayo cualitativo

(Conteo de placa) (ECP)

10-2 C, C, C, C, C ++++++++++
10-3 50, 42, 54, 59, 45 ++++++++++
10 -4 5, 7, 3, 6, 4 ++-+++++++
10-5 0, 0, 1, 0, 1 -++-+--+-+
10-6 0, 0, 0, 0, 0 ------+---
10-7 0, 0, 0, 0, 0 ----------

C = confluente (incontable)

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Ácidos nucleicos infecciosos
Una demostración espectacular de las diferencias básicas entre los microorganismos
celulares y los virus es que el ácido nucleico purificado, extraído de algunos virus, es
infecciosos, es decir, tales virus son capaces de reproducirse a partir de su solo genoma.
Resultados positivos se obtienen regularmente solo con virus cuyo genoma consiste de una
sola molécula de ácido nucleico y cuyos viriones no contienen transcriptasa.
La demostración de que algunos ácidos nucleicos virales son infecciones es importante.
Células “resistentes” son en realidad capaces de soportar el crecimiento viral si se puede
encontrar un mecanismo que facilite la entrada del ARN viral no degradado en la célula. Con
algunos virus, en especial el SV40 el uso del ADN infecciosos ha sido de gran ayuda en la
disección de las funciones del genoma. Los ácidos nucleicos virales infecciosos proporcionan
un modelo conveniente para estudiar el problema más general de introducir ácidos
nucleicos funcionales en las células de vertebrados. Cada respuesta de todo o nada equivale
a la muerte supervivencia de un cultivo o de un animal de laboratorio.

Liberación del virus: purificación de las partículas virales

Debe contarse con virus puros a fin de estudiar ciertos tipos de propiedades y aspectos de
biología molecular del agente.

Primero se procede a la concentración de partículas virales mediante

• Precipitación con sulfato de amonio, etano o polietilenglicol,

• Ultrafiltración

Luego debe separarse al virus de las los materiales del huésped por medio de :

Centrifugación
Cromatografía de columnas

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 Electroforesis

La purificación preliminar elimina la mayor parte de material no viral

Centrifugación diferencial

También se le conoce con los nombres de frontera móvil, de velocidad diferencial o de

pellets. Es el método de separación más común utilizado hoy en día para fraccionar las
células. Su resultado es la obtención de un sobrenadante y un material sedimentado.

Centrifugación por gradiente de densidades

Sistema donde se separan las partículas en función de su densidad de flotación. La muestra

se mezcla en un medio con un gradiente de densidad más pronunciado o se pone por
encima de éste; siendo la base un perfil incremental de sustancias como: sacarosa

centrifugación por gradiente de sacarosa es un tipo de centrifugación comúnmente

utilizado para purificar virus encapsulados.

Centrifugación zonal

Se deposita un muestra del virus concentrado sobre un gradiente lineal de densidad,

previamente formado por sacarosa o glicerol, y durante la centrifugación el virus sedimenta
para formar una banda a cierta velocidad, determinada por el tamaño y peso de la partícula
viral.

Centrifugación isopícnica

Recibe su nombre de la palabra iso, que significa igual; y pícnico, que se refiere a la densidad
de las sustancias. Separa cada componente de la muestra, según su densidad. Se toma una
muestra y se coloca sobre una solución con cambios incrementales en densidad; es decir,
con un gradiente de densidad; el cual va disminuyendo su densidad desde fondo, hacia la
parte superior.

Cromatografía en columna

El virus se une a una sustancia como dietilaminoetilo o fosfocelulosa y después se eluye

mediante cambios de pH o de la concentración salina.

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Electroforesis en zona

Permite separar partículas virales de contaminantes con base en la carga eléctrica. También
se pueden emplear antisueros específicos para retirar partículas virales de los materiales
del huésped

Métodos de contaje viral

Hemaglutinación

La mayoría Muchos virus humanos contienen en su envoltura externas proteínas virus-

codificadas capaces de unirse con los eritrocitos. Tales virus pueden formar puentes entre
los glóbulos rojos para construir una red.

La capacidad de aglutinar glóbulos

rojos fue descubierta en 1941 por Hirst,
McClelland y Harc para el virus
influenza. Muchos virus de las familias
Orthomyxoviridae y Paramyxoviridae
poseen glicoproteínas en las espículas
de su envoltura que pueden aglutinar
eritrocitos a diferencia de la familia
Adenoviridae que aglutinan eritrocitos
mediante los constituyentes de su
cápside.

Los glóbulos rojos normales se asientan formando un “botón” mientras que los glóbulos
aglutinados forman un escudo o retículo.

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Los receptores presentes en los glóbulos rojos son mucoproteínas que contienen ácido N-
acetil-neuromínico (NANA), estos son inactivados por la enzima neurominidasa que separa
los viriones del eritrocito. Este fenómeno se denomina Elución y ocurre a 37ºC. Por el
contrario, a 4ºC la enzima no actúa y
la unión del virión a los glóbulos rojos
es estable. Los virus eluidos pueden
volver aglutinar otros eritrocitos,
pero los eritrocitos eluidos no pueden
volver a ser aglutinados ya que su
receptor a sido destruido por la
neuraminidasa. Por esta razón, esta
enzima se denomina enzima
destructora de receptores.

PROTEINAS VIRUS CODIFICADAS

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 Reacción de inhibición de la Hemaglutinación

Si se hace reaccionar un virus con capacidad hemaglutinante con su anticuerpo especifico,

este anulara su capacidad de hemaglutinación por bloqueo de las hemaglutininas presentes
en la envoltura del virión. Este fenómeno se denomina inhibición de la hemaglutinación y
es utilizado para identificar y tipificar virus como para determinar la presencia de
anticuerpos específicos inhibidores de la hemaglutinación en los sueros de los pacientes.

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Método de recuento de placas bajo agarosa (plaqueo)

Cuantifica cantidad
de viriones en un
inoculo. Se basa en
el recuento de
lesiones
localizadas:

• Focos en
membrana
corioalantoidea
de embrión de
pollo (pocks)
• Placas de lisis
en monocapas
de células
• Focos de
proliferación
en cultivos
celulares

Puede utilizarse para cuantificar bacteriófagos.

Método de Reed y Muench

Se basa en la propuesta de que, si una unidad de prueba dio un resultado positivo en una
dosis alta de virus, también dará positivo en dosis mayores. La unidad de prueba que dio
resultado negativo con ciertas dosis dará negativo con dosis más bajas.

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Bibliografía
Carballal, G., & Oubiña, J. R. (2014). Virología Médica. Buenos Aires: Corpus.
White, D. O., & Fenner, F. J. (1994). Medical Virology. San Diego: Academic Press.

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