Tecnológico de Monterrey

Laboratorio de Ingeniería Genética

Ximena Rodríguez De León

A01704448

Act. Online 2: Lisis alcalina para extracción de ADN bacteriano

a) Self-evaluation de la plataforma:

https://vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=77&sim=314&cnt=1
b) Pasos para el aislamiento del ADN plasmídico

1. Inocular 2 mL de medio rico (LB, YT o TB) que contenga el antibiótico apropiado

con una sola colonia de bacterias transformadas (de las cuales se busca extraer
el ADN plasmídico), e incubar el cultivo durante la noche a 37°C con agitamiento
vigoroso.
2. Verter 1.5 mL del cultivo en un tubo para microcentrífuga y centrifugarlo a
máxima velocidad por 30 segundos a 4°C. Guardar la porción que no fue utilizada
del cultivo original y conservarla a 4°C.
3. Retirar el medio por aspiración, dejando el sedimento de bacterias lo más seco
posible.
4. Re suspender el sedimento bacteriano en 100 μL de Solución Alcalina I (50 mM
glucosa + 25 mM Tris-Cl + 10 mM EDTA) a temperatura helada, con ayuda de
agitación vigorosa en el vórtex.
5. Añadir 200 μl de Solución Alcalina II (0.2 N NaOH + 1% p/v SDS) recién preparada
a cada suspensión bacteriana. Cerrar bien el tubo y mezclar bien el contenido
invirtiendo el tubo. No agitar. Guardar el tubo en hielo.
6. Añadir 150 μl de Solución Alcalina III (5 M acetato de potasio – 60 mL + Ácido
acético glacial – 11.5 mL + Agua – 28.5 mL) a temperatura helada. Cerrar el tubo
y dispersar la solución a través del lisado bacteriano invirtiendo el tubo varias
veces. Guardar el tubo en hielo por entre 3 y 5 minutos.
7. Centrifugar el lisado bacteriano durante 5 minutos a velocidad máxima a 4 °C en
una microcentrífuga, y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo.
8. Agregar opcionalmente un volumen igual de fenol:cloroformo. Mezclar las fases
agitando con vórtex y luego centrifugar a velocidad máxima durante 2 minutos
a 4 °C en una microcentrífuga. Transferir la capa superior acuosa a un tubo
nuevo.
9. Precipitar los ácidos nucleicos del sobrenadante agregando 2 volúmenes de
etanol a temperatura ambiente. Mezclar la solución agitando con ayuda del
vórtex y dejar reposar durante 2 minutos a temperatura ambiente.
10. Recoger los ácidos nucleicos precipitados por centrifugación a la velocidad
máxima durante 5 minutos a 4 °C en una microcentrífuga.
11. Desechar el sobrenadante por aspiración. Colocar el tubo en posición invertida
sobre una toalla de papel para drenar todo el líquido. Utilizar una punta de
pipeta desechable para eliminar las gotas de líquido adheridas a las paredes del
tubo.
 12. Agregar 1 mL de etanol al 70% al sedimento e invertir el tubo cerrado varias
veces. Recuperar el ADN por centrifugación a máxima velocidad durante 2
minutos a 4 °C en una microcentrífuga.
13. Eliminar, con cuidado, todo el sobrenadante por aspiración.
14. Retirar cualquier gota de etanol del tubo. Guardar el tubo abierto a temperatura
ambiente hasta que el etanol se haya evaporado y no haya líquido visible en el
tubo (toma entre 5 y 10 minutos).
15. Disolver los ácidos nucleicos en 50 μl de TE que contenga 20 μg/mL de ARNasa
A libre de ADNasa (ARNasa pancreática). Agitar la solución en vórtex durante
unos segundos y almacenar el ADN a -20 ° C.

(Virtual Amrita Laboratories Universalizing Education, 2011)

c) Investigación:

a. ¿Qué se requiere para asegurar la extracción de plásmido y evitar la

contaminación con ADN genómico o ARN?

El uso de ciertas sustancias ayuda a extraer exclusivamente el ADN plasmídico y no otros

componentes genéticos que se pueden encontrar en las células. Los procedimientos utilizan
NaOH para alcalinizar en presencia de un detergente fuertemente aniónico como lo es el
SDS para provocar la lisis celular, la desnaturalización del ADN cromosómico y de las
proteínas, y la liberación de los plásmidos. (Prieto et. al., s.f.).

Esta desnaturalización es posible gracias al tratamiento con detergente, pero la separación

se debe a la precipitación que ocurre al neutralizar el medio añadiendo una alta
concentración de sal (acetato de potasio) que hace que el ADN cromosómico se re
naturalice parcialmente para quedar “atrapado” en el precipitado que se obtiene al
centrifugar la muestra, el cual podemos decir que es un método mecánico que también es
requerido para asegurar la extracción del plásmido. El precipitado mencionado también
contendrá SDS, proteínas y lípidos. (Lara y Cuevas, 2020).

Esta precipitación permite que el sobrenadante contenga únicamente ADN plasmídico y

ARN. Por su parte, el ARN es degradado de la muestra con ayuda de una enzima llamada
ARNasa que descompone esta molécula, separándola del plásmido para así obtener el ADN
plasmídico puro, listo para almacenar o trabajar directamente con él. (Damián et.al., 2013).
 b. ¿Cuál crees que sea la importancia de mantener al plásmido libre de este
tipo de ácidos nucleicos?

El purificar la muestra de ADN plasmídico de otros ácidos nucleicos como el ARN y el ADN
cromosómico permite que ésta sea manipulable y que se pueda estudiar con exactitud,
pues no poseen las mismas propiedades y puede ocurrir alguna interacción que afecte los
resultados de la investigación, estudio o experimento que se esté realizando y que
exclusivamente requiera del plásmido. (Rojas, 2018).

Referencias

Damián, P. et. al. (2013). Técnicas Básicas de Biología Molecular. Universidad Autónoma
Metropolitana. Recuperado de: http://publicacionescbs.izt.uam.mx/DOCS/biomolec.pdf

Lara, A. y Cuevas, C. (2020). Transferencia de material genético II. Recuperado de:

https://bqexperimental.files.wordpress.com/2010/01/lisis-alcalina4.pdf

Prieto, M. et. al. (s.f.) Purificación de ácidos nucleicos. Universidad de Córdoba. Recuperado
de: https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/37%20PURIFICACION%20ACS%20NUCLEICOS.pdf

Rojas, A. (2018). Extracción de ADN. Conogasi. Recuperado de:

http://conogasi.org/articulos/extraccion-de-adn-2/

Virtual Amrita Laboratories Universalizing Education. (2011). Plasmid Isolation (Mini prep).
Recuperado de: https://vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=77&sim=314&cnt=2.