PRÁCTICA 3: DIGESTIÓN Y ANÁLISIS DE
DNA BACTERIÓFAGO LAMBDA
Ximena Rodríguez De León | September 3, 2021
A) DIGESTIÓN
1. Obtener microtubos de ensayo que contengan el
aislamiento de cada enzima (PstI, EcoRI y HindIII),
DNA lambda y el buffer de restricción del profesor.
Mantener solución madre en hielo.
2. Etiquetar 4 microtubos de ensayo. L, P, E y H, y
colocar en soporte de tubos de esponja o en gradilla.
- L = Lambda sin cortar DNA (amarillo)
- P = PstI digestión de restricción de lambda DNA
(violeta)
- E = EcoRI digestión de restricción de lambda DNA
(verde)
- H = HindIII digestión de restricción de lambda DNA
(naranja)
3. Preparar digestiones en microtubos de ensayo. A
cada tubo agregar 2 uL de DNA lambda sin cortar, 5
uL de buffer de restricción y 1 uL de enzima. Agregar
solo 1 tipo de enzima a c/tubo. No agregar enzima al
tubo ?L?.
4. Tapar bien cada tubo. Mezclar todos los reactivos
con un golpecito en la parte inferior del tubo. Golpear
suavemente la parte inferior del tubo sobre la mesa
para recolectar el líquido.
5. Colocar los tubos de muestra en el termociclador
(termoblock) a 37 ºC x 30 min. Después de la
incubación, colocar las muestras en hielo o refri (4
ºC) hasta que el gel de agarosa esté listo.
METODOLOGÍA
B) ELECTROFORESIS C) VISUALIZACIÓN
1. Preparar un gel de agarosa 1% con el buffer TAE
1. Poner gel en el transiluminador, y
1X. Agregar 1 µl de EtBr a la agarosa derretida antes
encender luz UV. Poner la regla en la parte
de verter el gel.
superior del gel.
2. Después de la incubación, obtener los 4
microtubos de ensayo L, P, E y H, y colocar en el
soporte del tubo de espuma.
2. Con una regla de acetato, medir la
distancia (en mm) que corrió cada uno de
los fragmentos o bandas de DNA desde el
pozo hasta la base de cada banda de DNA
3. Colocar la micropipeta en 2uL y transferir esta y registrar números en una tabla.
cantidad de colorante de carga de muestra a cada
tubo. Utilizar punta nueva con cada muestra para
evitar contaminación.
4. Mezclar bien las muestras de DNA y el colorante 3. Estimar los tamaños, en pb de cada
en cada tubo antes de colocar las muestras en los fragmento de restricción (comparar la
pocillos del gel para la electroforesis. distancia que migraron las bandas
desconocidas con las del marcador).
5. Pipetear 10 uL del marcador del DNA (M) y de
cada tubo de muestra (L, P, E y H) en pocillos
separados del gel. Usar punta nueva para c/tubo.
Cargar el gel de izquierda a derecha. 4. Analizar el apéndice del handout para
crear la curva estándar.
6. Electroforesis a 100 V por 30 - 40 min.