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Diario de
Medicina CLINICA

Artículo

Intermedios del ciclo de Krebs en plasma en la enfermedad del

hígado graso no alcohólico

yana sandlers1,*, Rohan R. Shah1,†, Ryan W. Pearce1,† , Jaividhya Dasarathy2,

Arthur J. McCullough3,4y Srinivasan Dasarathy3,4
1 Departamento de Química, Universidad Estatal de Cleveland, Cleveland, OH 44115, EE. UU.;
rrshah22@vikes.csuohio.edu (RRS); r.pearce52@vikes.csuohio.edu (RWP) Centro Médico MetroHealth,
2 Universidad Case Western Reserve, Cleveland, OH 44139, EE. UU.; Jdasarathy@metrohealth.org

3 Departamento de Inflamación e Inmunidad, Instituto de Investigación Lerner, Clínica Cleveland,

Cleveland, OH 44115, EE. UU.; mcculla@ccf.org (AJM); dasaras@ccf.org (SD)
4 Departamento de Gastroenterología y Hepatología, Instituto de Investigación Lerner, Clínica Cleveland,
Cleveland, OH 44115, EE. UU.
* Correspondencia: y.sandlers@csuohio.edu ; Teléfono: +1-216-687-2421
†Estos autores tienen la misma contribución.
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Recibido: 9 de diciembre de 2019; Aceptado: 20 de enero de 2020; Publicado: 22 enero 2020 ---

Resumen:La enfermedad hepática no alcohólica (NAFLD, por sus siglas en inglés) se manifiesta con un amplio
espectro de síntomas clínicos y está estrechamente asociada con el síndrome metabólico, la inflamación y la
disfunción mitocondrial. Aunque el mecanismo de la disfunción mitocondrial en NAFLD aún no está completamente
dilucidado, múltiples estudios han demostrado evidencia de anomalías mitocondriales moleculares, bioquímicas y
biofísicas en NAFLD. Dada la asociación entre NAFLD y la disfunción mitocondrial, el objetivo de este estudio es
analizar los niveles circulantes de intermediarios del ciclo de Krebs en una cohorte de individuos afectados por
NAFLD y controles sanos equivalentes y correlacionar nuestros hallazgos con las métricas de función hepática. La
bioquímica sérica estándar y los intermedios del ciclo de Krebs se analizaron en NAFLD (norte=22) y control
emparejado (norte=67) cohortes. Los niveles circulantes de isocitrato y citrato fueron significativamente (pags<0,05)
elevada en la cohorte de pacientes con NAFLD. El área bajo la curva (AUROC) de estos dos metabolitos mostró una
utilidad clínica moderada. Las correlaciones entre los intermedios del ciclo de Krebs en plasma y las métricas de
plasma clínicas estándar se exploraron mediante el coeficiente de correlación de Pearson. Los datos obtenidos para
los intermedios del ciclo de Krebs en plasma sugieren conocimientos fisiopatológicos que vinculan la disfunción
mitocondrial con NAFLD. Nuestros hallazgos revelan que el isocitrato y el citrato plasmáticos pueden discriminar
entre cohortes normales y NAFLD y pueden utilizarse como marcadores no invasivos de disfunción mitocondrial en
NAFLD. Se justifican estudios futuros con grandes poblaciones en diferentes etapas de NAFLD.

Palabras clave:intermediarios del ciclo de Krebs en plasma; enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD);
disfunción mitocondrial

1. Introducción

La enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD, por sus siglas en inglés) es el trastorno hepático más
común en los Estados Unidos y puede provocar fibrosis, cirrosis y progresión del carcinoma hepatocelular.1–4]. NAFLD
se manifiesta con un amplio espectro de síntomas clínicos, mientras que la patogénesis de la enfermedad se describe
a través de un "modelo de impacto múltiple". El modelo tiene en cuenta múltiples factores que pueden contribuir al
progreso y la estadificación de la enfermedad.5]. De hecho, NAFLD está estrechamente asociado con el síndrome
metabólico, la inflamación y la disfunción mitocondrial.4,6–8]. Aunque el mecanismo de la disfunción mitocondrial en
NAFLD aún no está completamente dilucidado, múltiples estudios han demostrado evidencia

J. Clin. Medicina.2020,9, 314; doi:10.3390/jcm9020314 www.mdpi.com/journal/jcm

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de anormalidades mitocondriales moleculares, bioquímicas y biofísicas en NAFLD. Las mitocondrias juegan un papel
muy importante en el metabolismo celular hepático. De hecho, los individuos afectados por NAFLD exhiben cambios
morfológicos en las mitocondrias del hígado y una disminución en la producción de ATP.9]. También se encontró una
disminución de la expresión de polipéptidos codificados por mtDNA y una baja actividad de los complejos I, III y V en
pacientes con esteatohepatitis no alcohólica (EHNA).10]. Los estudios en modelos animales demuestran estrés
oxidativo, disminución de la actividad de las proteínas OXPHOS, altos niveles de TNF-α circulante y acumulación de
cardiolipina y ubiquinona hepáticas.9,11]. Independientemente del mecanismo involucrado, estos datos brindan
evidencia convincente de que la disfunción mitocondrial contribuye al fenotipo NAFLD. En el contexto de una función
mitocondrial alterada, se espera que el ciclo de Krebs participe en la patogenia de NAFLD. El ciclo de Krebs es una vía
mitocondrial central que sirve como centro metabólico para la respiración aeróbica, la glucólisis, la lipogénesis, la
gluconeogénesis y la síntesis de aminoácidos. Por cada vuelta del ciclo, hay una reducción simultánea de NAD+y
ubiquinona. Oxidación posterior de NADH y FADH2, seguido de la fosforilación de ADP, conduce a la síntesis de ATP. La
interrupción del ciclo de Krebs puede dar lugar a una amplia gama de trastornos metabólicos y síntomas clínicos.
Dada la asociación entre NAFLD y la disfunción mitocondrial, el objetivo de este estudio es analizar los niveles
circulantes de intermediarios del ciclo de Krebs en una cohorte de individuos afectados por NAFLD y controles sanos
equivalentes, y correlacionar nuestros hallazgos con las métricas clínicas de la función hepática.

2. Sección Experimental

2.1. Asignaturas

HGNA (norte=22) y cohortes de control emparejadas (norte=67) incluía a ambos sexos en el rango de edad
de 23 a 67 años. El diagnóstico de NAFLD se realizó por evidencia clínica y ecográfica y excluyendo otras causas
de pruebas de función hepática anormales. Los hallazgos ecográficos han sido validados en el pasado [12]. Las
muestras de sangre se extrajeron presumiblemente después de un ayuno nocturno, aunque un análisis
posterior de glucosa en plasma reveló que no todos los sujetos cumplían con el protocolo de ayuno. Se obtuvo
el consentimiento informado de todos los sujetos y los procedimientos se realizaron de conformidad con la
Junta de Revisión Institucional del Metro Health Medical Center. En todas las muestras de plasma se analizaron
las transaminasas hepáticas (alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST), fosfatasa
alcalina (ALP), nitrógeno ureico en sangre (BUN), bilirrubina, albúmina, creatinina, glucosa, HbA1C, triglicéridos
(TG), total colesterol, colesterol de lipoproteínas de alta densidad (HDL-C) y marcadores inflamatorios.

2.2. Preparación de muestras para intermedios del ciclo de Krebs

Un total de 350µL de plasma se enriqueció con 50µL de una mezcla 0,2 mM de ácido tricarbalílico,13C4
-malato (Millipore Sigma, Burlington, MA, EE. UU.), d6-succinato (Millipore Sigma), d6-α-cetoglutarato (Millipore
Sigma), y 2 mM de13C6-citrato (Millipore Sigma) seguido de la adición de 25µL de13C-4-fumarato (Millipore
Sigma) en etanol (0,02 mM), luego se añadió 1 mL de HCl 1 N en una mezcla saturada de NaCl y 1 mL de acetato
de etilo. Los tubos se agitaron en vórtice y luego se agitaron durante diez minutos más. La suspensión se
centrifugó a 1000 rpm durante 10 min, luego la fase orgánica superior se transfirió cuidadosamente al tubo de
reacción limpio. La extracción con acetato de etilo se repitió una vez más y los extractos orgánicos se
combinaron en un tubo. Las muestras se secaron completamente bajo una corriente de nitrógeno a
temperatura ambiente y se incubaron con 40µL de metoxiamina en piridina (20 mg/mL) a 80◦C durante 1 h.
Luego los tubos se enfriaron a temperatura ambiente y 60µSe añadió L de bis-trimetilsilitrifluoroacetamida
(BSTFA)/trimetilclorosilano al 1% (Millipore Sigma) después de la incubación a 70ºC.◦C durante 45 min. Las
muestras se transfirieron a los viales del espectrómetro de masas de cromatografía de gases (GCMS).

2.3. Análisis de cromatografía de gases-espectrometría de masas (GCMS)

El análisis GC-MS se realizó con Agilent 5977. Un espectrómetro de masas acoplado a un cromatógrafo de gases
7890 B equipado con un automuestreador 7693 y una columna DB-5ms (Agilent, Santa Clara, CA, EE.
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EE.UU). El GC-MS se operó en modo de impacto de electrones (EI)/monitoreo de iones únicos (SIM). Los iones objetivo y los
tiempos de retención se pueden encontrar en Materiales complementarios. El programa de temperatura fue el siguiente: 80◦C
mantener durante 2 min, aumentar 15◦C/min hasta 305◦C y mantener durante 3 min. Las curvas de calibración con al menos
seis puntos se obtuvieron mediante el gráfico de la relación pico de metabolito/estándar interno frente a las concentraciones
de metabolito en plasma enriquecido, seguido de un análisis de regresión lineal. El criterio de aceptación se fijó como un
coeficiente de correlación r2> 0,99. El arrastre se examinó mediante la extracción de muestras de plasma enriquecidas con un
alto nivel de analitos seguido de análisis de GC-MS de estas muestras y blancos. Los coeficientes de variación interdiaria e
intradiaria y la precisión de las muestras enriquecidas estuvieron dentro de límites aceptables (CV≤20%).

Cuantificación de acónito e isocitrato

Dado que no se encontraron estándares marcados con isótopos estables disponibles comercialmente para
acónito e isocitrato, se utilizó ácido tricarbalílico (material complementario, Figura S2) como estándar interno para
estos metabolitos.

3. Resultados

Se evaluó la bioquímica sérica incluyendo glucosa, HbA1c, creatinina plasmática, BUN, bilirrubina, albúmina,
triglicéridos, colesterol total, HDL-C, ALT y AST, TNF-α y leptina. Mesa1resume las métricas clínicas de sangre estándar
promedio obtenidas para NAFLD (norte=22) y controles coincidentes (norte=67). Algunos de los participantes del
estudio tenían niveles de glucosa sin ayunar, por lo que la Tabla2resume las métricas clínicas para muestras con
glucosa plasmática≤100 mg/dl. Las muestras de glucosa sin ayunas se excluyeron de la Tabla2 independientemente
de los niveles de HbA1c.
HbA1c: aunque el valor promedio de hemoglobina glucosilada (HbA1c) en el grupo NAFLD no
superó el límite del 6,5 %, este valor indica condiciones prediabéticas. En general, el 32 % (7 de 22) de la
cohorte de NAFLD tenía HbA1c≥6,5%.
Albúmina: los niveles reducidos de albúmina se asocian con cirrosis, fibrosis septal intensa y
esteatohepatitis. El análisis de toda la cohorte, incluidas las muestras con glucosa sin ayunas, reveló que el
nivel promedio de albúmina en los individuos afectados disminuyó (3,8±0,4 frente a 4,1±0,2, respectivamente),
pags<0.05 (Tabla1). Después de la exclusión de muestras con niveles de glucosa sin ayuno, no se encontró
diferencia en los valores de albúmina (Tabla2).

Tabla 1.Datos demográficos y métricas de plasma estándar expresadas como promedio±Desviación

Estándar. ALP: fosfatasa alcalina, ALT: alanina transferasa, AST: aspartato transferasa, BUN: nitrógeno
ureico en sangre, HDL-C: colesterol de lipoproteínas de alta densidad, TG: triglicéridos, HSI: índice de
esteatosis hepática.

Control (norte=67) HGNA (norte=22) pags-Valor

Años de edad) 42.25 47.3

Macho femenino 21/67 1/22
IMC (kg/m2) 29.7±7.5 40±7.5 <0.001
Albúmina (g/dL) 4.01±0.22 3.84±0.43 0.02
Bilirrubina (mg/dL) 0.77±0.24 0.72±0.40 0.50
ALP(U/L) 93.6±16.8 95.4±16.37 0.70
ALT (UI/L) 22.12±6.5 30.19±11.53 0.001
AST (UI/L) 21.4±4.54 28.42±11.12 <0.001
AST/ALT 1.00±0.21 0,94±0.23 0.3
BUN (mg/dl) 14.2±3.8 15±6.7 0.49
Creatinina (mg/dL) 0.82±0.22 0.8±0.2 0.70
Glucosa (mg/dL) 90.7±17.45 127.8±77.1 0.005
HbA1c (%) 5.5±0.77 6.5±1.6 0.001
Col total (mg/dL) 201±47 192.3±41.04 0.40
HDL-C (mg/dL) 47±9.95 48±13 0.39
TG (mg/dL) 171±9.2 192.2±123 0.89
TG/HDL-C 3.72±2.22 4.21±2.22 0.38
TNF-α (pg/mL) 1.86±1.62 3.63±2.8 <0.001
Leptina (ng/mL) 23±18.09 63.0±34 <0.001
HSI 39.19±8.07 50.42±14.9 <0.001
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Tabla 2.Datos demográficos y métricas de plasma estándar expresadas como promedio±desviación estándar solo para
muestras con corte de glucosa≤100 mg/dl.

Control (norte=57) HGNA (norte=7) pagsValor

Años de edad) 42.1 46

Macho femenino 16/41 1/8
IMC (kg/m2) 29.5±7.9 32.4±10.5 0.3
Albúmina (g/dL) 3.98±0.21 3.97±0.32 0,92
Bilirrubina (mg/dL) 0.77±0.24 0,62±0.16 0.07
ALP(U/L) 94.8±16.1 95.8±21.4 0.8
ALT (UI/L) 21.7±5.4 29.6±13.3 0.002
AST (UI/L) 21.1±4.5 30.0±13.0 <0.001
BUN (mg/dl) 14.03±3.66 15.0±5.5 0.50
Creatinina (mg/dL) 0.79±0.18 0.75±0.26 0,55
Glucosa (mg/dL) 85.35±9.38 88.88±10.7 0.30
HbA1c (%) 5.45±0.54 5.9±0.4 0.44
Col total (mg/dL) 199.3±48 179.6±26.2 0.23
HDL-C (mg/dL) 47±10 47±12 0.76
TG (mg/dL) 159±84 150±58.1 0.90
TG/HDL-C 3.4±1.7 1.9±0.84 0.84
TNF-α (pg/mL) 1.8±1.1 3.57±3.01 0.01
Leptina (ng/mL) 24.18±18.6 61.68±32.2 <0.001
HSI 38,9±8.35 41.27±11.36 0,45

Transaminasas: la actividad de la alanina aminotransferasa (ALT), un marcador del daño hepático, se elevó
significativamente (pags<0,05) independientemente del estado de ayuno. La diferencia en la actividad de la aspartato
aminotransferasa (AST) entre la cohorte normal y la afectada se hizo más evidente en el grupo con un límite de
glucosa <100 mg/dl. La relación AST/ALT, que a menudo se utiliza como un factor predictivo independiente para la
fibrosis hepática avanzada.13], no fue significativamente diferente entre los dos grupos (Tabla1). Es importante tener
en cuenta que el cincuenta por ciento de la población con NAFLD puede presentar niveles normales de AST y ALT [14,
15].
Bilirrubina: aunque se informó que los niveles de bilirrubina están inversamente asociados con NAFLD [dieciséis], no
observamos una diferencia estadísticamente significativa en nuestras cohortes.
La creatinina plasmática, un marcador común en la cirrosis y la enfermedad renal crónica, tampoco fue
significativamente diferente.
El aumento de los triglicéridos (TG) y la disminución del colesterol de lipoproteínas de alta densidad (HDL-C) están
asociados con el síndrome metabólico.17]. Es interesante notar que la cohorte de NAFLD tenía triglicéridos elevados pero
ninguna diferencia en el nivel de HDL-C. A pesar de esto, la relación triglicéridos/colesterol de lipoproteínas de alta densidad,
reportada en asociación con la resistencia a la insulina, fue elevada en el grupo NAFLD.
El índice de masa corporal (IMC) está asociado con el riesgo de hígado graso.18]. En este sentido, encontramos un
aumento estadísticamente significativo del IMC en la cohorte NAFLD (Tabla1), que se volvió menos evidente cuando solo se
incluyeron para el análisis las muestras con un límite de glucosa <100 mg/dL (Tabla2).
El índice de esteatosis hepática (HSI) se calculó utilizando métricas de plasma estándar y demográficas (Figura S4,
Materiales complementarios) [19]. De acuerdo con un estudio realizado por Lee et al., HSI se correlaciona significativamente
con el grado de hígado graso con un límite de detección de >36,0 y probablemente refleja la presencia de esteatohepatitis no
alcohólica.19].
El ciclo de Krebs tiene un papel central en el metabolismo hepático, conectando los ácidos grasos hepáticos y las vías
relacionadas con la glucosa. celular anormal [20] y circulante [21] Los intermedios del ciclo de Krebs están estrechamente
asociados con la disfunción mitocondrial, como se demostró en numerosos estudios [22–25]. Dada la disminución de la
actividad en los complejos de la cadena respiratoria en NAFLD [4], se esperan perturbaciones en las concentraciones celulares
de los intermedios del ciclo de Krebs.
Se analizaron siete intermediarios circulantes del ciclo de Krebs, incluidos citrato, isocitrato, acónito, α-
cetoglutarato, succinato, fumarato y malato. El oxaloacetato no es químicamente estable y, por lo tanto, se omitió de
los análisis. La succinil-CoA es un metabolito celular y, en consecuencia, no abunda en el plasma humano. Se
detectaron aumentos estadísticamente significativos en los niveles circulantes de citrato e isocitrato
independientemente de los niveles de glucosa en plasma (Figura1).
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Figura 1.Niveles de intermedios del ciclo de Krebs en plasma por GCMS. Enfermedad del hígado graso no alcohólico
(EHGNA) (norte=22) y controles (norte=67). Análisis estadístico realizado por Prism 8 (GraphPad). *pags<0.05.

El rendimiento diagnóstico de isocitrato y citrato en pacientes con NAFLD se analizó más a fondo
estableciendo la curva operativa del receptor (ROC) y analizando el área bajo la curva (AUC) (Figura2). La
precisión tanto del isocitrato como del citrato para discriminar NAFLD de la cohorte de control mostró
áreas bajo la curva (AUROC) similares de 0,74 y 0,75, respectivamente (Tabla3).

Tabla 3.Evaluación de isocitrato y citrato como marcadores de disfunción mitocondrial en NAFLD.

AUC: área bajo la curva.

Marcador ABC pags-Valor Error

Citrato 0.749 pags<0.05 0.097
isocitrato 0.750 pags<0.05 0.102

Figura 2.Una curva característica operativa del receptor (ROC) para citrato e isocitrato por Prism 8 (GraphPad).
HGNA (norte=22) y controles (norte=67).

Las correlaciones entre los intermedios del ciclo de Krebs en plasma y las métricas de plasma clínicas estándar se
exploraron mediante el coeficiente de correlación de Pearson. Las correlaciones más significativas se obtuvieron en el
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Cohorte NAFLD para α-cetoglutarato al BUN (r= −0.7969,pags<0,05). En el grupo de control, el succinato plasmático se
correlacionó positivamente con la albúmina (r=0.353,pags=0.01), malato correlacionado negativamente con AST (r= −
0.332,pags=0,02), el α-cetoglutarato se correlacionó negativamente con la glucosa (r= −0.562,pags<0,001), el acónito
se correlacionó negativamente con la bilirrubina (r= −0.281,pags=0,04), y fumarato se correlacionó negativamente con
AST y ALT (r= −0.315,pags=0,02;r= −0.298,pags=0,03). Cuando se analizó toda la población bajo estudio, el análisis de
correlación reveló que el isocitrato estaba fuertemente correlacionado con la edad y los niveles de bilirrubina (r=0.29,
pags=0,005;r= −0.02,pags=0,04, respectivamente) y marcadores inflamatorios (TNF-α y leptina), mientras que el citrato
se correlacionó con la edad (r=0.345,pags<0,001), actividad AST (r=0.249, pags=0.02), niveles de glucosa (r=0.284,pags=
0.008), HSI, TNF-α y leptina (Figura3). Koliaki et al. [26] demostraron que la flexibilidad metabólica de las mitocondrias
hepáticas en las primeras etapas de NAFLD se pierde en la etapa NASH. Utilizamos los valores calculados de HSI como
proxy de la estadificación de NAFLD y encontramos una correlación positiva con los niveles de citrato (Figura3).

Figura 3.Correlaciones significativas entre isocitrato, citrato, edad, HSI y parámetros sanguíneos estándar
para toda la cohorte del estudio. La fuerza de asociación entre las variables se calculó mediante la prueba
de Pearson realizada por Prism 8 (GraphPad). HGNA (norte=22) y controles (norte=67).

4. Discusión

La enfermedad hepática no alcohólica (NAFLD, por sus siglas en inglés) es la forma más común de enfermedad hepática
crónica. Hay evidencia emergente de que la disfunción mitocondrial contribuye a la patogénesis de NAFLD. Sin embargo,
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no existen marcadores no invasivos que evalúen la participación mitocondrial en NAFLD. En este estudio,
analizamos los niveles plasmáticos de siete intermediarios del ciclo de Krebs e investigamos su correlación con
los índices estándar y su papel potencial como biomarcadores de disfunción mitocondrial en NAFLD.
Como era de esperar en NAFLD, las actividades de transaminasas estaban elevadas (Tabla2) y los niveles de
albúmina se redujeron. Curiosamente, no encontramos una diferencia significativa en los niveles de creatinina en
plasma, lo que sugiere que la cohorte de NAFLD en el momento del estudio no tenía una disfunción renal significativa.
Tampoco se encontraron diferencias estadísticas en BUN, un factor de riesgo sugestivo de enfermedad cardiovascular
(CVD) en NAFLD [27]. El sesenta y tres por ciento (12/22) de los pacientes con NAFLD tenían un IMC > 30 kg/m2.
Aproximadamente el treinta y dos por ciento de la cohorte NAFLD demostró niveles de HbA1c en el rango diabético (>
6,5%) y el mismo porcentaje de la cohorte tenía niveles altos de triglicéridos (> 200 mg / dL), lo que indica la presencia
de síndrome metabólico. Un aumento en los marcadores inflamatorios TNF-α y leptina están asociados con NAFLD y
NASH.8,28,29]. Uygún et al. [30] y Chitturi et al. [31] demostraron en sus estudios que un aumento de la leptina sérica
en pacientes con esteatohepatitis no tiene relación con el IMC y, por lo tanto, no puede justificarse por la diabetes tipo
2, el sexo o la obesidad. En otro estudio, Serín et al. [32] mostró que la leptina sérica elevada es característica de los
pacientes esteatósicos con niveles normales de transaminasas.
El ciclo de Krebs tiene un papel central en el metabolismo del hígado, conectando los ácidos grasos hepáticos y las vías
relacionadas con la glucosa. celular anormal [20] y circulante [21] Los intermedios del ciclo de Krebs están estrechamente
asociados con la disfunción mitocondrial, como se demostró en una serie de estudios [22–25]. Dada la disminución de la
actividad en los complejos de la cadena respiratoria en NAFLD [4], se esperan perturbaciones en las concentraciones celulares
de los intermedios del ciclo de Krebs. Los datos obtenidos para los intermedios del ciclo de Krebs en plasma sugieren
conocimientos fisiopatológicos que vinculan la disfunción mitocondrial con NAFLD. En los estudios actuales, los pacientes con
NAFLD tenían niveles de citrato en plasma más altos que los sujetos de control sanos. Este hallazgo es consistente con el de
van der Wier et al. estudio que informó niveles elevados de citrato en plasma en pacientes con NAFLD [33]. El estudio también
sugirió que la acumulación de ácidos grasos conduce a la elevación del citrato en plasma en NAFLD. El aumento del citrato
plasmático también puede estar asociado con la lipogénesis de novo regulada al alza en NAFLD.34,35]. El citrato sirve como
precursor de carbono en la biosíntesis de novo de ácidos grasos y, aunque menos del 10% del citrato hepático se origina a
partir del citrato plasmático.36], en general, alrededor del 26,1 % de los triacilgliceroles hepáticos acumulados se originan a
partir de la lipogénesis de novo [35].
También observamos un aumento en los niveles de isocitrato circulante (pags<0,05). El isocitrato se convierte en
α-cetoglutarato a través de la descarboxilación oxidativa y es catalizada por la isocitrato deshidrogenasa (IDH). Se
describen tres isoformas diferentes de IDH humana: NAD+-dependiente de IDH3 y NADP+-formas dependientes IDH1/
IDH2. IDH1 se expresa en gran medida en el hígado e IDH2 juega un papel clave en la regulación del ciclo de Krebs en
múltiples tejidos. IDH3 se encuentra en las mitocondrias y cataliza el paso limitante de la velocidad de conversión
irreversible de isocitrato en α-cetoglutarato. Aunque no observamos anormalidades en el α-cetoglutarato plasmático,
el aumento en los niveles de isocitrato es consistente con la observación de que la expresión de IDH2 en los
hepatocitos primarios está regulada a la baja bajo la estimulación con palmitato y la acumulación de lípidos.37].

Para los análisis de correlación, seleccionamos todas las muestras independientemente de los niveles de glucosa
(Tabla1). El hallazgo más destacado en la cohorte de NAFLD fue una correlación negativa entre los niveles plasmáticos
de α-cetoglutarato y BUN.r= −0.7969,pags<0,05). Esto puede estar relacionado con la cataplerosis (pérdida de los
intermediarios del ciclo de Krebs) del α-cetoglutarato debido a la hiperamonemia que se ha informado en modelos
preclínicos de NAFLD.38]. Esto es consistente con nuestro informe anterior de que los niveles intermedios del ciclo de
Krebs, incluido el α-cetoglutarato, fueron significativamente más bajos en las células de miotubos C2C12 durante la
hiperamonemia.39]. Batshaw et al. también informaron una correlación inversa lineal similar entre el amoníaco
plasmático y los niveles de α-cetoglutarato [40] en lactantes con deficiencia de ornitina transcarbamilasa.
El análisis de correlación de toda la población bajo estudio reveló que el citrato y el isocitrato estaban
correlacionados con la edad (rango 23–67 años, Figura3). El citrato también se correlacionó positivamente con la
glucosa (r=0.2839,pags<0,05) y HbA1c (r=0.3844,pags<0,001). Esto es similar a un informe anterior de Shigiyama et al.
que mostró que los niveles de citrato están elevados en pacientes con NAFLD con un grupo de alta sensibilidad a la
insulina hepática [41]. El mismo estudio también informó un aumento en succinato y acónito, pero
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no encontramos una asociación estadísticamente significativa de estos metabolitos con la glucosa en nuestros sujetos. Sin
embargo, notamos que el acónito tenía una fuerte correlación negativa con el HDL-C en el grupo de control (r=
− 0,26,pags=0,03, datos suplementarios). También notamos una correlación negativa entre el isocitrato y la bilirrubina que
puede explicarse porque la bilirrubina es un potente inhibidor de la isocitrato deshidrogenasa [42,43].
Para evaluar el rendimiento del isocitrato y el citrato como marcadores de disfunción mitocondrial, se
construyeron curvas operativas del receptor (ROC) y se calcularon las áreas bajo la curva. Los valores de AUC indican
que el isocitrato y el citrato (AUC = 0,74 y AUC = 0,75) tienen un desempeño biomarcador moderado. Sin embargo,
cohortes más grandes de sujetos de control y pacientes con NAFLD pueden mejorar potencialmente estas
características.
Si bien se han establecido marcadores séricos de enfermedad hepática para NAFLD, los marcadores secundarios
de disfunción mitocondrial no invasiva en NAFLD aún deben investigarse. A través del análisis de los intermedios del
ciclo de Krebs en plasma, presentamos evidencia de la participación de la disfunción mitocondrial en el fenotipo
NAFLD. Nuestros hallazgos sugieren que el isocitrato y el citrato plasmáticos pueden discriminar entre cohortes
normales y NAFLD y pueden utilizarse como biomarcadores de disfunción mitocondrial no invasivos en NAFLD. Se
justifican futuros estudios mecánicos en modelos de enfermedad NAFLD y análisis de intermediarios del ciclo de
Krebs en plasma con grandes poblaciones en diferentes etapas de NAFLD.
Limitaciones del estudio: dado que no se ha realizado ninguna biopsia hepática, la suposición de que la
cohorte NAFLD tiene disfunción mitocondrial se basa en los múltiples estudios que demostraron evidencia de
anomalías mitocondriales moleculares, bioquímicas y biofísicas en el fenotipo NAFLD. Es importante señalar
que los sujetos de control del estudio eran de ambos sexos, pero la cohorte de NAFLD incluía solo un hombre.
Por lo tanto, nuestros hallazgos deben validarse con un grupo más inclusivo de género de pacientes con
NAFLD. Además, los resultados de este estudio deben validarse con grandes cohortes y contra diferentes
etapas de NAFLD, incluida la esteatohepatitis no alcohólica (NASH) y la fibrosis avanzada.

Materiales complementarios:Los siguientes están disponibles en línea enhttp://www.mdpi.com/2077-0383/9/2/314/s1, Figura S1:

Estructuras posteriores a la derivatización de los metabolitos del ciclo del ácido cítrico bajo estudio, Tabla S1: Iones objetivo y tiempos
de retención para todos los intermedios del ciclo de Krebs y estándares internos. Figura S2: Espectro EI-MS de ácido tricarbalílico.
Figura S3 (A) isocitrato y (B) espectros EI-MS de citrato. m/z 245 es específico de isocitrato, Figura S4. Índice de esteatosis hepática
calculado (HSI).

Contribuciones de autor:Conceptualización, YS, JD, AJM y SD; metodología, YS, RRS, JD, AJM, SD; software,
RWP; validación, YS, RRS; análisis formal, RRS, RWP; investigación, YS, JD y SD; recursos, YS, JD, AJM, SD; curación
de datos, YS, SD, JD; redacción—preparación del borrador original, YS, RRS; redacción—revisión y edición, YS,
JD, AJM, SD; visualización, YS, RWP; administración del proyecto, JD, AJM, SD Todos los autores han leído y
aceptado la versión publicada del manuscrito.
Fondos:Financiado en parte por: R21 AR 071045 (SD), R21 AA022742 (SD); RO1 GM119174; RO1 DK113196 (SD); P50
AA024333 (DE); UO1 AA021890 (SD); UO1 DK 061732-17, Fundación Mikati (GD, SD) y fondos de inicio de la Universidad
Estatal de Cleveland (YS).

Expresiones de gratitud:Nos gustaría agradecer a Dharmvir Singh por organizar los datos clínicos.

Conflictos de interés:Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

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Attribution (CC BY) (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).