CENTRO UNIVERSITARIO UTEG

Lic. Quimico Farmaceutico Biologo

Pruebas de esterilidad
& de pirógenos
-Presentan:

•Martinez Martinez Alejandro

•Martinez De Luna Juan Manuel
•Nava Velasco Luis Arturo
•Valdez Bernardino Alejandra Monserrat
•Vazquez Ortiz Gandhi

12/08/2022
 Metodos General Analitico
y sus variantes

01 MGA 0381 02 MGA 0711

Pruebas de esterilidad Prueba de Pirógenos

Prueba LAL
03 lisado de amebocitos de
limulus polyphemus

3.1 gel-clot 3.2 Turbidimetría 3.3 Cromogénico

 MGA 0381
01 Pruebas de esterilidad
 •Aplica a todos los productos biológicos

Medicamentos, material de curación, quirúrgico, productos oftálmicos,

dispositivos médicos y productos de aplicación parenteral

Se denominan como estériles

Tiene como finalidad investigar la presencia de

microorganismos contaminantes.
 Condiciones para realizar la prueba
● Condiciones asépticas y equipos calificados

● Personal calificado

● Incluir control microbiológico (ambiental)

● Incluir controles negativos de los medios,

diluyentes y soluciones de enjuague
empleados.
 Condiciones para realizar la prueba
● Sanitizar los envases de las muestras, soluciones y
medios de cultivo previo a análisis.

● El material que esté en contacto con la muestra debe ser

estéril

● Los medios de cultivo deben cumplir con la

prueba de esterilidad y promoción de crecimiento.
Medios de cultivo
Medio líquido de tioglicolato

● Medio de cultivo para bacterias ANAEROBIAS

(Pueden crecer bacterias aeróbicas)

● Clostridium sporogenes

● Incubar a 30 - 35 °C
Medios de cultivo
Medio digerido de soya tripticaseína

● Medio de cultivo para bacterias AEROBIAS y

HONGOS

● Staphilococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, etc.

● Candida Albicans, Aspergillus niger, etc.

● Incubar a 22.5 +- 2.5 °C

 MGA 0711
02 Prueba de Pirógenos
MGA 0711
prueba de Pirógenos
Animales de Prueba
● Se traba con conejos albinos blancos que pesen más de
1.5 kilogramos,

● Dieta balanceada, libre de antibióticos.

● Condiciones óptimas de temperatura de 20 a 30 cº.

MGA 0711
prueba de Pirógenos
Animales de Prueba
● No usar conejos que hayan trabajado en pruebas
anteriores a 3 semanas

● Que no hayan tenido algún aumento de tempera en un

ensayo mayos a 0.6 Cº
MGA 0711
prueba de Pirógenos
Equipo y material
Se usan:
•Termómetros
•Sondas
•Sensores
•Sistemas de medición de temperatura con calibración.
MGA 0711
prueba de
Pirogenos reactivos
● Todos los diluyentes y reactivos deben ser estériles y libres de
pirógenos para evitar falsos positivos.

● Cloruro de sodio libre de pirógenos. Calentar el cloruro de

sodio a 200 °C por no menos de 2 h.

● Carbonato de sodio libre de pirógenos. Calentar el

carbonato de sodio anhidro a 170°C durante no menos de 4 h.
MGA 0711
prueba de
Pirogenos reactivos
● Agua libre de pirógenos. Verificar la ausencia de pirógenos
agregando cloruro de sodio al 0.9% e inyectar 10 mL/kg de peso
del conejo.

● Solución salina al 0.9%. Disolver el cloruro de sodio en agua,

ambos libres de pirógenos, esterilizar en autoclave. Verificar la
ausencia de pirógenos inyectando 10 mL/kg de peso del conejo.
MGA 0381
Prueba de
Pirogenos reactivos
● Solución de bicarbonato de sodio al 2.5%. Disolver el
carbonato de sodio libre de pirógenos en agua libre de
pirógenos, Verificar la ausencia de pirógenos inyectando 10
mL/kg de peso del conejo.

● Solución de hidróxido de sodio al 0.05 N. Pesar 2 g de

hidróxido de sodio y disolver con agua libre de pirógenos y
llevar al aforo a 1 000 mL.
 Procedimiento.

● Registrar el peso de cada uno de los conejos. colocarlos en

cepos individuales.

● Insertar el sensor de temperatura en el recto a una profundidad

no menor de 7.5 cm al menos 90 min antes de la inyección.

● intervalos de 30 min tomar por lo menos dos temperaturas, la

última lectura corresponde a la temperatura control;
 Procedimiento.
● Esta es la temperatura base para determinar si existe si hay
aumento de temperatura provocado por la inyección de una
solución de prueba.

● A los 30 min de registrar la temperatura control inyectar la

muestra.

● El conejo que muestre una variación mayor de 0.2°C entre dos

temperaturas sucesivas, y los que difieran por más de 1°C
entre ellos, se eliminan de la prueba.

● No usar animales con temperatura controlada superior mayor a

39.8°C o menor de 38.0°C.
●
 Procedimiento.
● A menos de que se especifique algo diferente en la monografía
correspondiente.

● inyectar a cada uno de tres conejos, en la vena marginal de la

oreja, 10 mL de la solución de prueba por kilogramo de peso,
en un período de tiempo que no exceda de 10 min.

● Para la prueba de pirógenos de dispositivos médicos, lavar o

enjuagar las superficies del dispositivo que entran en contacto
con el material administrado en forma parental parenteral, o por
el sitio de inyección, o con los tejidos del paciente.
●
●
 Procedimiento.
● De acuerdo al peso del conejo inyectar en la vena marginal de
la oreja de tres conejos, la dosis indicada en la monografía
individual en un período de tiempo que no exceda de 10 min.

● Registrar la temperatura de cada animal a intervalos de 30 min

durante 3 h.

● La temperatura máxima de cada conejo es la más alta

temperatura registrada para cada animal en las 3 h después de
la inyección
●
●
 Interpretación.
● Considerar cualquier disminución de temperatura con respecto
a la temperatura controlada como cero.

● La muestra cumple los requisitos para ausencia de pirógenos si

ningún conejo muestra un incremento individual de 0.5°C o
mayor con respecto a su temperatura control.
 Interpretación.

● Si un conejo muestra un aumento de temperatura individual de

0.5°C o mayor, continuar la prueba usando otros cinco conejos

● La muestra cumple los requisitos para ausencia de pirógenos si

no más de tres de los ocho conejos presentan un aumento de
temperatura individual de 0.5°C
 Prueba LAL
03
Lisado de amebocitos
de Limulus polyphemus
Ensayo LAL

● se aplica a la determinación o cuantificación de endotoxinas provenientes de

las bacterias Gram negativas empleando como reactivo lisado de amebocitos
circulantes del cangrejo herradura de limulus polyphemus
Ensayo LAL
● La reacción requiere la presencia de cationes bivalentes.

● La velocidad de la reacción depende de la concentración de endotoxina,

del pH y de la temperatura.

● El lisado contiene un sistema enzimático que actúa en cascada y que se

activa progresivamente en presencia de endotoxinas.

● Como resultado final, la proteína coagulable (coagulógeno) se

transforma en un gel (coagulina)
CONDICIONES TALES DE EVITAR LA CONTAMINACIÓN MICROBIANA

Antes de llevarlo a cabo es necesario verificar:

● 1) que todos los materiales y reactivos a usar no contienen endotoxinas
bacterianas.

● 2) la sensibilidad del lisado, , de acuerdo a los requisitos posteriormente

descritos en cada método

● 3) la ausencia de factores interferentes en las muestras a analizar. Los

resultados son válidos siempre que se haya demostrado previamente que las
muestras a analizar no inhiben ni intensifican la reacción.
 Materiales y Reactivos

● el material de vidrio, el método más empleado es el calentamiento a 250

°C por lo menos durante 30 minutos o 180 °C durante 3 horas.

● Si se emplean materiales plásticos de único uso (microplacas, puntas

para pipetas automáticas, etc.)

● es necesario verificar que los mismos estén libres de endotoxinas y que

no interfieran con el ensayo
 Materiales y Reactivos

● Agua reactivo: El agua empleada en este ensayo debe estar libre de

endotoxinas. Puede ser preparada por destilación doble o triple y debe
ser recolectada en envases convenientemente despirogenados.

● Es necesario efectuar el control de calidad de la misma, que debe

cumplir con las condiciones del ensayo.

● Reactivo LAL (Lisado de Amebocitos) - Reconstituir el lisado según se

indica en el rótulo y/o prospecto.

● La sensibilidad del lisado, establecida en el rótulo y que debe ser

confirmada, se expresa en Unidades de Endotoxina por ml (UE/ml).
 Materiales y Reactivos

● El ácido clorhídrico 0,1 N y el hidróxido de sodio 0,1 N, empleados para

ajustar el pH entre 6,0 y 8,0, deben prepararse con agua reactivo

● Endotoxina de referencia y Endotoxina control. Existe una Endotoxina de

referencia internacional

● Se designa a la unidad de endotoxina como unidad internacional, siendo

la relación 1 UI = 1 UE. En esta Farmacopea se designa a la unidad
como UE (Unidad de endotoxina)
 Límites de Endotoxinas

● las monografías individuales de materia prima y producto terminado.

Bajo el subtítulo de Ensayo de endotoxinas bacterianas se indica el
límite de endotoxinas requerido para el producto.

● Es necesario demostrar que los productos a analizar contienen una

concentración de endotoxinas bacterianas menor al límite especificado.

● La misma se expresa en unidades entotóxicas por peso (UE mg), por

droga activa (UE UI) o por volumen (UE ml)
 Límites de Endotoxinas

● límite de endotoxinas en las monografías, se puede calcular tomando en

cuenta la dosis y vía de administración, empleando la dosi siguiente:

KM

● K es la dosis máxima de endotoxinas admitida (UE) por Kg de peso

corporal en humano
● M es la dosis máxima (en mg o UI) recomendada para ser administrada
por Kg de peso corporal en humanos
 Límites de Endotoxinas

● Para administración parenteral K es igual a 5 UE Kg.

● Para administración intratecal K es igual a 0,2 UE Kg.

● Para productos (usualmente cancerígenos) administrado por metro

cuadrado de superficie
corporal, la fórmula es:

KM

● K es igual a 5 UE Kg y
● M es [(máxima dosis m2 hora) 1,80 m2
 Límites de Endotoxinas

● En productos radiofármacos de administración parenteral el límite de

endotoxinas se calcula empleando la fórmula siguiente:] 70 Kg.

175 V
● administración intratecal,
14 V
● V es la dosis máxima recomendada en ml para ser administrada en
humanos
método gel en tubo
(gel-clot)

método
turbidimétrico

método
cromogénico
método gel en
tubo (gel-clot)
● Permite establecer la presencia de endotoxinas bacterianas empleándose
como ensayo límite o como determinación semicuantitativa

● la reacción se hace mediante comparación directa con una Endotoxina

control o de referencia

● las cantidades de endotoxina se expresan en la unidades de endotoxinas

definidas.

● El pH de la mezcla a ensayar y del Reactivo LAL debe estar comprendido

entre 6,0 y 8,0, a menos que se especifique de otro modo en la monografía
correspondiente.
 método gel en
tubo (gel-clot)

Ensayo para confirmar la sensibilidad del lisado

● Se debe confirmar la sensibilidad indicada en el rótulo del Reactivo LAL de cada
lote, empleando Endotoxina control o de referencia
.
 método gel en
tuboCálculo
(gel-clot)
de la media geométrica

Registrar la concentración en cada punto final, para cada serie de diluciones.

Determinar el logaritmo de la concentración del punto final y calcular la media

geométrica de la concentración del punto final por la fórmula siguiente:

anti log/ f e

e es la suma de los logaritmos de las concentraciones finales de la serie de diluciones y

f es el número de tubos de reacción en el punto final.

.
 método gel en
tubo (gel-clot)
Cálculo del contenido de endotoxina
- Calcular la concentración de endotoxinas en el producto a
ensayar, por la fórmula siguiente:
anti log / f d

d es el logaritmo de los factores dilución del producto (expresados como fracciones), en

el punto final para la muestra ensayada.

[NOTA: los resultados finales deben ser expresados en las unidades de límite de
endotoxina especificadas
(UE/ml o UE/mg o UE/Ul)].

.
método gel en
tubo (gel-clot)

Máxima dilución validada (MDV)

● La máxima dilución válida es la dilución máxima de la muestra que corresponde a

la máxima dilución en la cual el límite de endotoxina puede ser determinado en las
condiciones del ensayo
método gel en
tubo (gel-clot)
Máxima dilución validada (MDV)

● La máxima dilución válida es la dilución máxima de la muestra que corresponde a

la máxima dilución en la cual el límite de endotoxina puede ser determinado en las
condiciones del ensayo.

● Se aplica a soluciones inyectables o a soluciones de administración parenteral

reconstituidas y diluidas para su administración o, cuando sea aplicable,
método gel en
tubo (gel-clot)

● El cálculo se realiza empleando la fórmula siguiente:

ECL MDV
● L E- mg por ml, sí el límite de endotoxina especificado en la monografía es en
UE/mg. representa el límite de endotoxina y

● C la concentración del principio activo en la solución a ensayar o reconstituido.

● según las especificaciones del elaborador puede estar dada en:

UI/ml, si el límite de endotoxina especificado en la monografía es en UE/UI.

método gel en
tubo (gel-clot)

● Cuando en la monografía lo especifique, el límite de endotoxina especificado es

en UE/ml, se debe dividir el límite de endotoxina por (qué es la sensibilidad del
lisado, en UE/ml, declarada en el rótulo)
MÉTODOS
ESPECTROFOTOMÉTRICOS:
turbidimétrico y cromogénico

Método turbidimétrico
● Mide el cambio de turbidez (por absorbancia o transmitancia) durante a
transformación final de la proteína coagulante en coagulina.

● El valor de velocidad del cambio de turbidez es función de la concentración de

endotoxina.

● Los ensayos deben ser realizados a la temperatura de incubación de 37 ± 1 °C.

MÉTODOS
ESPECTROFOTOMÉTRICOS:
turbidimétrico y cromogénico

Método turbidimétrico
● Mide el cambio de turbidez (por absorbancia o transmitancia) durante a
transformación final de la proteína coagulante en coagulina.

● El valor de velocidad del cambio de turbidez es función de la concentración de

endotoxina.

● Los ensayos deben ser realizados a la temperatura de incubación de 37 ± 1 °C.

 MÉTODOS
ESPECTROFOTOMÉTRICOS:
turbidimétrico y cromogénico

Método cromogénico de punto final

En este método se detiene la reacción enzimática, a un tiempo preseleccionado, con una
cantidad apropiada de ácido acético.

La concentración de endotoxina se determina midiendo la absorbancia e interpolando la

misma en una curva de calibración preparada con soluciones de Endotoxina control o de
referencia en Agua reactivo
.
Los valores de pH deben estar comprendidos entre 6,0 y 8,0 ajustar pH de ácido
clorhídrico 0,1 N o hidróxido de sodio 0,1 N o soluciones reguladoras apropiadas,
estériles y libres de endotoxinas.
 MÉTODOS
ESPECTROFOTOMÉTRICOS:
turbidimétrico y cromogénico
Validación de la curva de calibración
- Debe realizarse cada vez que se emplee un nuevo lote de lisado o cuando se
modifique alguna condición que pueda influir en el resultado del ensayo.

Preparar al menos cuatro series de soluciones de por lo menos cuatro concentraciones

de Endotoxina control o de referencia en Agua reactiva, dentro del intervalo especificado
por el elaborador.

La curva debe incluir el límite ( ) especificado por el elaborador y un blanco de reactivos.

Realizar el ensayo y graficar la absorbancia en función de la concentración de
endotoxina para cada tubo
 MÉTODOS
ESPECTROFOTOMÉTRICOS:
turbidimétrico y cromogénico

Efectuar una regresión de la curva de absorbancia en función de concentración.

La recta de regresión debe tener una pendiente y linealidad significativas.

El coeficiente de correlación /r/ debe ser 0,98% en valor absoluto en el intervalo de

concentraciones de endotoxinas indicados por el elaborador del lisado

Determinar la concentración de endotoxina, m, a partir de la media aritmética de la

concentración más alta ( a) y la concentración más baja ( b) para la cual la curva de
regresión es lineal, siendo todos los valores expresados en UE/ml.
MÉTODOS
ESPECTROFOTOMÉTRICOS:
turbidimétrico y cromogénico

Factores interferentes
- La muestra debe ser diluida de acuerdo a un factor de dilución calculado a partir de la
fórmula siguiente:

Concentración de endotoxina límite/ m

La concentración de endotoxina límite es igual a la endotoxina límite especificada o

calculada, en UE/mg o UE/UI multiplicada por la concentración de la solución muestra,
en mg o UI de producto por ml.
MÉTODOS
ESPECTROFOTOMÉTRICOS:
turbidimétrico y cromogénico

Cuando la media de la concentración de endotoxina calculada es mayor o igual a 50 %

y menor a 200 % de m, la muestra ensayada no contiene factores interferentes.

Cuando la media de la concentración de endotoxina calculada es menor a 50 % o mayor

200 %, los factores interferentes deben eliminarse según se indica en Método de gel en
tubo
MÉTODOS
ESPECTROFOTOMÉTRICOS:
turbidimétrico y cromogénico

Cuando la media de la concentración de endotoxina calculada es mayor a la

concentración más alta en la parte lineal de la curva de regresión repetir el ensayo con
un factor de dilución mayor de la muestra a ensayar,

calculado por la fórmula siguiente:

Concentración de endotoxina límite/ m’

MÉTODOS
ESPECTROFOTOMÉTRICOS:
turbidimétrico y cromogénico

Procedimiento
- Preparar las muestras, con las modificaciones apropiadas para eliminar factores
interferentes y/o ajustar el pH, si fuera necesario.

el análisis deben prepararse las siguientes soluciones y ensayar cada solución por
duplicado

’
MÉTODOS
ESPECTROFOTOMÉTRICOS:
turbidimétrico y cromogénico
Procedimiento

a) solución de la muestra a ensayar, en la dilución y condiciones que cumpla con el

ensayo de interferencias;
b) solución de los controles positivos de la muestra por duplicado conteniendo
Endotoxina control o de referencia a una concentración de m o m’, en la misma dilución
de la muestra a ensayar
c) solución de Endotoxina control o de referencia en Agua reactivo a una concentración
de a, b y de m o m´;
d)Agua reactivo como control negativo.

’
MÉTODOS
ESPECTROFOTOMÉTRICOS:
turbidimétrico y cromogénico
METODOS CINETICOS:
turbidimétrico y cromogénico
Método turbidimétrico
- Mide el tiempo de reacción necesario para el desarrollo de un grado predeterminado de
turbidez de una solución sobre la cual se agrega lisado, empleando un aparato
apropiado.

Método cromogénico
- Mide el tiempo de reacción necesario para el desarrollo de una intensidad
predeterminada de color después de la liberación de un péptido cromogénico,
empleando un espectofotómetro a la longitud de onda apropiada
MÉTODOS
ESPECTROFOTOMÉTRICOS:
turbidimétrico y cromogénico

Validación de la curva de calibración

- Debe realizarse cada vez que se emplee un nuevo lote de lisado

Los resultados deben ser expresados en las unidades de endotoxinas límite

especificadas (UE/mg, UE/ml o UE/UI).

Interpretación
- La muestra cumple con los requisitos del ensayo si la concentración de
endotoxina es menor que la especificada en la monografía correspondiente
bibliografia
FEUM. (2016). Farmacopea Sitio web:
https://fdocuments.mx/document/mga-0711-prueba-de-piroge
nos.html

FEUM.(2016). farmacopea sitio web.

https://fdocuments.mx/document/mga-0381-prueba-de-esterilidad.html

FEUM.(2016). farmacopea MGA 0381 sitio web.

https://fdocuments.mx/document/mga-0330-prueba-de-endotoxinas-bacterianas.html