Elisa (IgA) Anti-toxoplasma gondii

Integrantes: Nicole Garrido.S Gonzalo Daz

Principio del test:

El kit de Elisa provee un ensayo semicuantitativo in vitro para deteccin de anticuerpos humanos clase IgA contra Toxoplasma gondii en suero o plasma.El kit contiene micro concentraciones de reactivo de antigeno de Toxoplasma gondii. En la primera reaccion el suero diluido se incubara en los pocillos. En caso de resultados positivos para los anticuerpos IgA (tambien IgG y IgM) se ligara este con el antigeno del pocillo. Para detectar el anticuerpo ligado , se realiza una segunda incubacin usando una enzima conjuda antihumana (conejo) con una enzima conjuga ( peroxidasa) que luego catalizara una reaccion colorimtrica.

Preparacin y estabilidad de los reactivos

Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente (18 C a 25 C) unos 30 minutos antes de usar. Despus del primer uso, los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad si se conserva a 2 C a 8 C y protegidos de la contaminacin. Pocillos recubiertos, no abrir hasta su uso. Los calibradores y los controles estn prediluidos y listos para uso. Conjugado enzimtico: listo para uso. El conjugado enzimtico se debe mezclar cuidadosamente. Buffer de lavado : el buffer esta en una concentracin de 10x ,

Buffer de lavado: Est concentrado 10x. Si hay presencia de cristales debe calentarse a 37 C y mezclar bien antes de diluir. La cantidad requerida debe ser utilizada de la botella usando una pipeta limpia y se diluye con agua desionizada o destilada 1:9 (1 parte de reactivo ms 9 partes de agua destilada). El buffer de lavado diluido se mantiene estable durante 1 mes cuando se almacena entre 2 C a 8 C y se manejan adecuadamente.

Cromgeno / solucin sustrato: lista para usar. Cerrar el frasco inmediatamente despus de su uso, ya que el contenido es sensible a la luz. Debe ser incoloro para su uso. No utilizar la solucin si es de color amarillo.
Solucin stop : lista para uso

IMPORTANTE: calibradores y controles utilizados han sido negativos para Ags HB, VIHanti-VIH1 y VIH2 mediante inmunoensayos enzimticos y mtodos de inmunofluorescencia indirecta. No obstante, todos los materiales deben ser tratados como peligro potencial de infeccin y deben ser manejados con cuidado.

Preparacin y estabilidad de la muestra

Suero humano con EDTA, heparina o plasma citratado Estabilidad: las muestras de pacientes para la investigacin pueden ser guardados por 14 das (en 2 a 8C) Dilucin de la muestra: las muestras de pacientes se diluyen 1:101 en buffer de trabajo. Por ejemplo: Diluir 10 ul de suero en 1,0 ml de tampn de muestra y mezclar bien con vortex. Los controles y calibradores vienen pre-diluidos listos para su uso.

Incubacin
Incubacin simple: transferir 100 ul de el calibrador, del control positivo y negativo y la muestra diluida del paciente, el pipeteo no debe durar mas de 15 minutos , luego se incuba por 3 minutos en una pieza con una temperatura ambiente Lavado: Manual lavado en 3 secuencias usando 300 ul de Buffer Automtico: lavado en 3 secuencias con 400 ul en cada lavado. Luego del lavado utilizamos un papel absorbente el cual retira el exceso de solucin buffer (liquido residual > a 10 ul puede interferir con el sustrato y puede dar valores mas bajos que los esperados y lavados en cortos tiempos pueden dar valores mas elevados que el real. Incubacin de conjugados : pipetear 100ul de enzima conjugada (peroxidasa unida a Ig.A antihumano) en 2 pasos en cada micro placa , incubar por 30 minutos a una Tambiente.

 Lavado: realizar el lavado ya descrito anteriormente Incubacin del sustrato ,pipetiar 100ul de sustrato dentro de cada micro placa (3 etapas) incubar por 15 minutos a T de 1825C Solucin stop: Pipetear 100 ul de solucin stop dentro de cada micro placa en el mismo orden que se agrego el sustrato. Medicin : fotomtrica puede estar la medicin en una rango de 450 a 620. Realizar esta medicin luego de adicionar la solucin stop Antes de medir agitar la micro placa , homogenizar y distribuir la solucin.

Protocolo de pipeteo
1
A B
C Pos .

2
P6 P7

3
P 14 P 15

4
P 22 P 23

10

11

12

C
D E F G H

Neg
P1 P2 P3 P4 P5

P8
P9

P 16
P 17

P 24

P 10 P 18 P 11 P 19 P 12 P 20 P 13 P 21

 Este protocolo es una ejemplo de determinacin cuantitativa de anticuerpos en 24 pacientes (p1-p24) Calibrador , control positivo , y negativo son incubados en un pocillos diferentes cada uno. La fiabilidad del test es aumentada con determinacin en duplicados .

Calculo de los resultados:

Los resultados pueden ser evaluados semi cuantitativamente y son calculados por un radio que evala la absorbancia del control o la muestra del paciente por sobre la absorbancia del calibrador usando la siguiente formula:
Absorbancia del control o del paciente = Radio Absorbancia del calibrador Interpretacin de los resultados Radio <0.8 = negativo Radio >0.8 a<1.1 = bordeline Radio >1,1=positivo

Caractersticas del test.

Calibracin: La calibracin de los controles se realiza en unidades internacionales (UI), utilizando el suero de referencia con anticuerpos de Toxoplasma gondii Para cada grupo de pruebas realizadas, los valores de la medicin de los calibradores y las unidades internacionales y / o coeficientes determinados para los controles positivo y negativos deben corresponder a los lmites establecidos para las pruebas del kit. Si los valores especificados para los controles no son alcanzados, los resultados pueden ser inexactos y la prueba debe repetirse. Antgeno: El antigeno utilizado es Toxoplasma gondii organismo fue purificado por centrifugacin de gradientes de densidad y adems utilizando un detergente

Especificidad y Sensibilidad Se hizo un cateo de 231 pacientes que fueron investigados usando la tcnica de Elisa IG-A Anti Toxoplasma Gondii y con otro Elisa de mtodo de referencia, dando como resultado la especificidad fue de 83,1% con una sensibilidad de 94,5% Interferencias No fueron observadas interferencias con sueros hemolizados, lipemicos o ictericos en concentraciones superiores a 20 mg/dL para trigliceridos y para 0,4 mg/mL para bilirrubina.

Significancia clnica:
Es una Infeccin parasitaria producida por un protozoo intracelular, Toxoplasma gondii.Se presenta en tres estados durante su ciclo evolutivo y evolucin de la infeccin . trofozoto, quiste y ooquiste.Es una de las zoonosis ms difundida en la naturaleza

Forma infectante y va de Transmision:

QUISTES : carnivorismo,ingestin de carnes crudas o insuficientemente cocidas

TROFOZOITOS: va transplacentaria, y tranfusional de sangre u otros fludos .

OOQUISTES

: ingestin de alimentos , agua de bebida contaminada

con fecas de gatos, que contengan ooquiste de T.gondii

Patologa: Infeccin intracelular , especialmente del sistema retculo-endotelial, clulas del sistema nervioso.Destruccin celular, reaccin inflamatoria y finalmente fibrosis FORMAS CLINICAS:

TOXOPLASMOSIS ADQUIRIDA PACIENTE INMUNOCOMPETENTE Principalmente asintomtica Sintomticos : Linfoadenopatias o ganglionar Ocular Meningoenceflica miocrdica, pulmonar

TOXOPLASMOSIS CONGENITA

Generalizada aguda: Infeccin al final del embarazo, compromiso general, prematurez fiebre, hepato y esplenomegalia etc.
Encefalitis aguda: Infeccin a mediados del embarazo,Hidrocefalia coriorretinitis, microcefalia,calcificaciones y finalmente retardo sicomotor. etc. Secuelas: Infeccin al inicio del embarazo: Enfermedad intrauterina,casos severos Hidrocefalia, macro o microcefalia, calcificaciones cerebrales, Coriorretinitis.

FIN!!!

Quiste

Toxoplasmas libres en etapa proliferativa