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1.

Introduccin

En la industria farmacutica los productos parenterales se diferencian de los dems por su grado de pureza y
por estar libres de contaminantes, ya que la presencia de estos puede afectar no solo la estabilidad del frmaco
sino tambin la salud del paciente. Por esta razn son importantes las pruebas que se realizan al producto final,
ya que garantizan su calidad, entre estas pruebas se destacan las de tipo biolgico tales como esterilidad y
endotoxinas bacterianas. Esta ltima es de gran importancia ya que las endotoxinas son las sustancias
pirgenas de mayor impacto en los productos parenterales.

2. Sustancias pirgenas

De forma general se define pirgeno como aquella sustancia capaz de inducir fiebre, este sndrome febril es
desencadenado por pirgenos endgenos.

Pirgeno exgeno: Prcticamente todos los microorganismo tienen componentes que producen fiebre. Entre
estas sustancias estn los lipopoliscaridos de las bacterias gramnegativas (endotoxinas), (1) los polmeros de
acetilglucosamina, N-acetilmuromato y el tetrapptido de peptidoglucan de las paredes celulares de las
bacterias grampositivas, las enterotoxinas de los estafilococos, la toxina eritrognica del estreptococo del grupo
A y ciertos polisacridos y protenas producidos por rickettsias, virus y hongos. (2)

Pirgeno endgeno: Cuando los lipopolisacridos se introducen a los tejidos, tienen la tendencia de adherirse a
los macrfagos, lo cual determina la sntesis de pirgenos endgenos primarios como la interleucina 1 y 6, el
factor de necrosis tumoral alfa y algunos interferones. Una vez secretada la IL-1 entra a circulacin e interacta
con las neuronas termosensibles del hipotlamo, actos seguido la temperatura corporal comienza a elevarse,
este proceso en humanos se da alrededor de los 20 minutos. (2,3) La enzima COX-3 acta tambin como
pirgeno endgeno y es antagonizada por el acetaminofn. (3)

Mecanismo: Los pirgenos endgenos estimulan en las clulas endoteliales de los vasos del hipotlamo la
produccin de prostaglandinas (PGE2) que actan sobre los receptores 3 (EP3) de las clulas del centro
termorregulador con lo cual se genera la fiebre. (3) La intensidad de la respuesta pirgena y su grado de riesgo
depende del estado clnico del paciente, por la potencia del pirgeno y por la va de administracin (la intratecal
es la ms peligrosa, seguida por la intravenosa, la intramuscular y la subcutnea). (1)

Productos farmacuticos: Los pirgenos presentes en productos parenterales y que se inyectan a pacientes
pueden causar fiebre, escalofros, dolor de espalda y de las extremidades inferiores y, malestar general.
Aunque estas reacciones rara vez son fatales, en pacientes graves se dan sntomas similares al shock que
pueden ser letales. (1) Los pirgenos se consideran contaminantes si se encuentran en productos
farmacuticos parenterales.

Los pirgenos pueden ingresar al producto por cualquier medio que introduzca microorganismos vivos o
muertos, sin embargo en la actualidad el control de esa contaminacin, y la presencia de pirgenos en
productos terminados es indicador de un procesamiento bajo condiciones de limpieza mal controladas. El
tiempo disponible para que se produzca el crecimiento microbiano aumenta el riesgo de niveles elevados de
pirgenos, por lo que los procesos de fabricacin deben efectuarse con la mayor rapidez posible. (1) Por esta
razn se debe tener como objetivo prevencin de la produccin de pirgenos en la preparacin y el
procesamiento del producto, tambin porque es poco prctico y a veces imposible eliminar los pirgenos ya
presentes sin afectar el medicamento. (1)

Los pirgenos pueden destruirse mediante un calentamiento a altas temperaturas, el proceso tpico para
despirogenacin de elementos de vidrio y equipos es calentarlos a 250C durante 45 minutos (tambin puede
usarse calentamiento a 650C/1 minuto y 180C/4 horas), cabe resaltar que la esterilizacin en autoclave no
destruye los pirgenos. Algunas tcnicas que no involucran calentamiento es el uso de sustancias bsicas o
oxidantes, tambin se tiene que el lavado integral con detergentes deja libre de pirgenos los elementos de
vidrio si despus se enjuaga bien con agua no pirgena. (1)

Fuentes: Dado que los pirgenos son sustancias producto de microorganismos es de esperarse que se
encuentren en todo lugar, cuando se detectan en productos de uso parenteral pueden provenir del agua
utilizada como solvente, los recipientes con los cuales el producto tuvo contacto durante la fabricacin,
empacado, almacenaje y administracin; o los qumicos usados en su preparacin. (4) En el control de
pirgenos se debe conocer los medios por los que se pueden contaminar los productos parenterales. El medio
ms probable es el agua dado que se trata de un elemento esencial para el crecimiento de microorganismos.
Cuando los equipos y suministros se dejan hmedos y expuestos al ambiente hay riesgo elevado de aparicin
de pirgenos. Otras fuentes de contaminacin son los envases y equipos, ya que los materiales pirgenos de
adhieren al vidrio y otras superficies. Los solutos pueden ser una fuente de pirgenos, ya que la fabricacin de
sustancias puede involucrar el uso de agua pirgena para etapas de cristalizacin, precipitacin o lavado. (1,4)

Ensayo <151> USP, prueba in vivo (5)

El objetivo de este ensayo es determinar que las formas farmacuticas parenterales se encuentran dentro de
lmites aceptables de riesgo de reaccin febril. En esta prueba se mide el aumento de temperatura corporal en
conejos a los que se les inyecta una solucin de prueba por va intravenosa y aplica solo para productos que
sean tolerados por conejos en una dosis que no exceda los 10 mL por kg de peso del animal, inyectado por va
intravenosa en un perodo de no ms de 10 minutos.
Los conejos que se emplean en esta prueba deben ser maduros y sanos, y adems, ser acondicionados
durante un perodo no mayor a siete das, mediante la simulacin del procedimiento de la prueba omitiendo el
paso de la inyeccin. Se realiza en un lugar destinado exclusivamente para esta prueba, donde las condiciones
ambientales son similares a las del espacio donde son alojados los conejos, y libre de perturbaciones que
puedan excitarlos. Durante el tiempo que dura la prueba se les suspende la alimentacin a los animales. Treinta
minutos antes del inicio del ensayo se le debe tomar la temperatura corporal a cada conejo, a este registro se le
denomina la temperatura control, es este valor el que se emplea como base para determinar si existe un
aumento resultado de la aplicacin de la solucin de prueba.
Del grupo de prueba se seleccionan solo aquellos conejos cuya temperatura no difiera en 1 C con respecto a
los dems, y se deben descartar aquellos cuya temperatura corporal sea mayor a 39,8 C.
A menos que la monografa individual especifique otra cosa, inyectar en la vena de la oreja de tres conejos 10
mL de la sustancia a evaluar por kg de peso del animal, completando cada inyeccin dentro de los 10 minutos
siguientes al inicio de la administracin. A intervalos de treinta minutos registrar la temperatura, dentro de las
tres horas siguientes.
Si se produce una disminucin en la temperatura, se considera como elevacin cero. Si ninguno de los
animales presenta una elevacin superior a los 0,5C sobre su temperatura control, se considera como
ausencia de pirgenos. Si por el contrario, al menos un conejo presenta una elevacin de 0,5C o ms, se
contina la prueba con cinco conejos ms. Se considera que la solucin de prueba cumple con los requisitos
para determinar la ausencia de pirgenos cuando no ms de tres de los ocho conejos tienen un aumento de
temperatura de 0,5C o ms y si la suma del aumento mximo de las temperaturas individuales de los ocho
conejos no excede de 3,38.


Ensayo de pirgenos invitro

La prueba de pirgenos en conejos es la prueba estndar establecida en las farmacopeas desde hace ms de
50 aos. Se han realizado esfuerzos para el desarrollo de pruebas alternativas en la ltima dcada. Se ha
desarrollado el MAT (Monocytic Activation Tests), en la cual estas pruebas tienencomo base, el empleo de los
monocitos humanos. Las fuentes elegidas de monocitos han sido: sangre total humana, clulas mononucleares
de sangre perifrica o lneas celulares monocticas. ste mtodo, fue incluido desde el ao 2010 en la
farmacopea Europea y su atractivo El atractivo de este ensayo est, en que refleja las reacciones del sistema
inmune innato humano mejor que la prueba en conejos y la de endotoxinas(LAL), y por lo tanto permite una
prediccin ms realista de la actividad pirognica. Adems, estas pruebas son ms rpidas, ms precisas y
ms econmicas que las pruebas en animales, y estn siendo adoptadas rpidamente por la industria. (6)


Fundamento (7)

La prueba consiste en la incubacin de la muestra a evaluar junto con las clulas monocticas humanas en
condiciones libres de pirgenos (incubacin). Despus de 6-24h, las citocinas liberadas responsables de la
produccin de fiebre, son detectados por tcnicas de ELISA (de deteccin) (Figura 1).

Figura 1. Ensayo alternativo de pirgenos














Si se utiliza la sangre humana (fresca o criopreservada) como fuente de monocitos, stas inducen la liberacin
de molculas tales como la Interleuquina-1-Beta (IL - 1). IL - 1 es una molcula producida en respuesta a
bacterias Gram -negativas, Gram - positiva y otras infecciones, induciendo fiebre. La sangre humana puede ser
sustituida con lneas de clulas monoctica humana, dndose la liberacin de otras citoquinas pro- inflamatorias,
como factor de necrosis tumoral - alfa (TNF - ) o interleucina - 6 (IL - 6).

Ejemplo procedimiento Test pirgeno invitro:

Sistema Pyrodetec: consta de tres partes
1. Incubacin
El Sistema de PyroDetect utiliza sangre criogenizada para este ensayo. Las muestras de ensayo se mezclan
con la sangre en la placa de cultivo celular y se mantienen en una incubadora durante la noche a 37 C. Si
pirgenos estn presentes en la muestra, los monocitos de la sangre se producen IL - 1 durante la incubacin.
2. Deteccin IL - 1 por ELISA
Para la deteccin de la IL - 1, la incubacin (mezcla) se transfiere a una microplaca de ELISA recubierta con
un anticuerpo especfico para IL - 1. Molculas interleucina presentes estn obligados por el anticuerpo
inmovilizado. Entonces se aade un anticuerpo policlonal ligado a enzima y un sustrato. La siguiente reaccin
de color permite la deteccin de la cota de IL - 1 en un lector de ELISA.
3. Anlisis
Mediante espectrofotometra se puede utilizar para medir las cantidades de IL- 1 producida. La cuantificacin
se puede realizar por una curva con un estndar de endotoxina

Referencias bibliogrficas

1. Gennaro A., Remington farmacia, Ed. Mdica Panamericana, Buenos Aires, 2003, pp. 913-914.
2. Romero R, Microbiologa y parasitologa humana: Bases etiolgicas de las enfermedades infecciosas y
parasitarias, Ed. Mdica Panamericana, Mxico, 2007, pp. 104.
3. Rojas W, Inmunologa, Corporacin para Investigaciones Biolgicas, Colombia, 2004, pp. 91-92.
4. Aldana C.F., Estudio preliminar de la interferencia de compuestos proteicos de radiofrmacos en la
prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL), Universidad de San Carlos de Guatemala, 2007,
pp.17-18.
5. Farmacopea de los Estados Unidos. USP 30 NF 27. Volumen 1. Prueba de pirgenos. Pg. 149
6. Potu, A, et al. Monocyte Activation Test: a new pharmacoepial quality control test for pyrogens.
JAPS/Vol.1/Issue 1/2011
7. Holtkamp, B, et al. The Monocyte-Activation Test (MAT) for Pyrogens. Disponible en:
http://www.pharmaceutical-int.com/article/the-monocyte-activation-test-mat-for-pyrogens.html. Consulta:
noviembre 2013

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