PROCEDIMIENTO OPERATIVO

ESTANDAR (POE´S) PRUEBA IN

VITRO PARA LA DETERMINACION LAB-INM-069
DE TOXOPLASMA IgG EN EL SUERO
” HOSPITAL GENERAL DR. HUMANO EN LOS SISTEMAS
ENRIQUE ORTEGA
MOREIRA” GEMINI
Departamento /Área: Páginas 1 de 6
INMUNOLOGIA
Establecer una guía de apoyo a los profesionales encargados para su análisis explicando
1.- OBJETIVO /PROPÓSITO paso a paso el procedimiento del examen de serología TOXOPLASMA IgG en el
laboratorio clínico.
Aplica al personal involucrado en el procesamiento de Inmunología, usuarios del
2.- ALCANCE Laboratorio tanto interno como externo, con el fin de estandarizar el correcto
procesamiento TOXOPLASMA IgG
Dirigido a Licenciados en Laboratorio, Tecnólogos Médicos en Laboratorio, Químicos
3.- RESPONSABLE Farmacéutico.

IgG: : Característica de la respuesta secundaria del anticuerpo.

4.- DEFINICIONES
El Toxoplasma gondii es un parásito que puede infectar a la mayoría de los animales y las
aves. Solo puede llevar a cabo el ciclo completo de reproducción en gatos domésticos y
salvajes. Estos son los principales huéspedes del parásito.

FUNDAMENTO:
5.- DESARROLLO DEL
PROCEDIMIENTO La determinación inmunoenzimatica cualitativa de anticuerpos específicos se basa en la
técnica Elisa (Enzyme-linked Immunosorbent Assy)

Las placas de Microtitulacion están cubiertas con antígenos específicos unen a los
anticuerpos de la muestra. Después de lavar los pocillos para eliminar todo el material de
muestra no unida, el conjugado de peroxidasa de rábano (HRP) se añade. Este conjugado
se une a los anticuerpos capturados. En una segunda etapa de lavado se retira el
conjugado no unido. El complejo inmune formado por el conjugado unido se visualiza
añadiendo substrato tetrametibencidina (TMB), que da un producto de reacción azul

La intensidad de este producto es proporcional a la cantidad de anticuerpos específicos

en la muestra se añade acido sulfúrico para detener la reacción. Esto produce un cambio
de color de azul a amarillo. La extinción a 450/620 m se mide con un fotómetro de placa
de microtitulación ELISA

TIPO DE MUESTRA:

Suero o plasma

FUENTE DE MUESTRA:

Sangre venosa recogida por punción venosa periférica.

CANTIDAD QUE SE DEBE RECOLECTAR:

5 ml de sangre

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CONTENEDOR DE RECOLECCION:
En un tubo sin anticoagulante tapa roja o con acelerador del coagulo (gel activador)

TAMAÑO DE MUESTRA:
15muestras

PREPARACION DEL PACIENTE:

No es necesario estar en ayuno

CONDICIONES DE MANEJO DE MUESTRA:

La muestra de sangre del paciente debe ser obtenida por punción venosa recolectando
la cantidad adecuada después se debe depositar el tubo en baño de maría en seco para
que se retraiga el coagulo y se centrifuga para obtener el suero con el cual vamos a
procesar la muestra correspondiente.

EQUIPOS Y MATERIALES

• Fotómetro de placa de microtitulación con filtros de 450/620nm

• Pipetas automáticas
• Reloj
• Agua destilada
• Tubos de plásticos desechables
• Micropipetas para uso de (10-1000 ul)
• Dispositivo de lavado manual o automático de placas de microtitulación

REACTIVO Y MEDIOS REQUERIDOS

• Placas de micro titulación

• Tapón de dilución de muestra IgG
• Solución de parada
• Tapón de lavado (20x conc) Conjugado
• Solución de sustrato de TMB Control Positivo
• Control Cut-off
• Control Negativo

REQUISISTOS ESPECIALES DE SEGURIDAD:

• Si las muestras no son procesadas de inmediato deberán almacenarse en la

nevera de 2 a 8 ®c.
• Se debe utilizar la debida protección para evitar el contacto directo con fluidos
biológicos.
• No congelar y mantener al abrigo de la luz

PREPARACION DE LOS REACTIVOS Y LOS MEDIOS:

Es muy importante llevar todos los reactivos y las muestras a temperatura ambiente
(20-25 °C)

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Placa de microtitulación:

Las tiras rompibles están recubiertas con antígeno de Toxoplasma. Inmediatamente

después de la eliminación de las tiras, las tiras restantes deben sellarse de nuevo en el
papel de aluminio junto con la bolsita dióxido de silicio y almacenar a 2-8 °C.

Tampón de Lavado (20x conc)

Diluir el tapón de lavado 1+19 por ejemplo 10 ml del tapón de lavado +190 ml de agua
destilada. El tapón de lavado diluido es estable durante 5 días a temperatura ambiente
(20-25 °C). En caso de aparecer cristales en el concentrado, calentar la solución a 37 °C
por ejemplo un baño María. Mezclar bien antes de la dilución.

Solución de Sustrato de TMB

La solución esta para su uso y debe almacenarse a 2-8 °C protegida de la luz. La solución
debe ser incolora o podría tener un color ligeramente azul claro. Si el sustrato se
convierte en azul, es posible que haya sido contaminado y no puede ser utilizado en el
ensayo

Requisitos de almacenamiento

Todos los reactivos de ensayo para esta prueba se almacenan a de 2-8 °C y deben de
estar situado en el departamento de serología.

Toma y preparación de las muestras

Usar muestras de suero o plasma (citrato, heparina) si el ensayo, se realiza dentro de 5

días después de la toma de sangre, las muestras pueden ser almacenadas a 2-8 °C, en
caso contrario deben ser alícuotas y almacenadas congeladas (70-80 °C). Agitar bien las
muestras descongeladas antes de diluirlas. Evitar congelaciones y descongelaciones
repetidas. No se recomienda la inactivación por calor de las muestras.

Dilución de la muestra

Antes del ensayo, las muestras tienen que estar diluidas en relación 1+100 con el tapón
de dilución de muestra IgG POR EJEMPLO 10ul de la muestra con 1 Ml de tapón de
dilución de muestras IgG, mezclar bien con la mezcladora Vortex.

PROCEDIMIENTO

1. Pipetear 100ul de estándares/controles y muestras en los pocillos respectivos.

Dejar el pocillo A1 para el blanco
2. Recubrir las tiras con los autoadhesivos suministrados
3. Incubar 1h +- 5 minutos a 37 °C
4. Después de la incubación, retirar el autoadhesivo, aspirar el líquido de la tira y
lavarla tres veces con 300 ul del tapón de lavado. Evitar el rebosamiento de los
pocillos. El intervalo entre lavado y aspiración debe ser > 5 segundos. Para sacar
el líquido restante de las tiras, es conveniente sacudirlas sobre papel
absorbente
5. Pipetear 100ul de conjugado en cada pocillo con excepción del blanco
substrato A1.
6. Incubar 30 minutos a la temperatura ambiente (20-25 °C). Evitar la luz directa
del sol.
7. Repetir el lavado como en el paso numero 4
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 8. Pipetear 100 ul de solución de sustrato de TMB en todos los pocillos
9. Incubar exactamente 15 minutos en oscuridad a temperatura ambiente
(20-25 °C). Un color azul se produce en las muestras positivas debido la reacción
enzimática
10. Pipetear en todos los pocillos 100 ul de la solución de parada en el mis orden y
mismo intervalo de tiempo como con la solución de sustrato TMB, por tanto, un
cambio de color de azul a amarillo se produce
11. Medir la extinción con 450/620 nm en un periodo de 30 min después añadir la
solución de parada

PASOS PARA LA CORRIDA DE MUESTRAS AUTOMATICO:

• Encender el analizador
• Click en icono Gemini
• Seleccionar Log On
• Escogemos la opción supervisor
• Seleccionamos el icono de llave
• Colocamos el rack de muestra
• Seleccionamos Scanner on se enciende las luces para colocar el rack de muestra
y seleccionamos la prueba a realizar.
• Vamos a la hoja de trabajo y verificamos que todas las pruebas a realizar estos
seleccionados. Y star.

Cálculos de los resultados

Para que un ensayo se considere valido deben seguirse estrictamente las presentes
instrucciones de uso y deben cumplirse los siguientes criterios:

Blanco: valor de la extinción < 0,100

Control negativo: valor de la extinción < 0,200 y < Cut-off

Control cuT- off: valor de la extinción 0,150-1,300

Control Positivo: valor de la extinción > Cut- off

Si estos criterios no se cumplen, la prueba no es válida y deberá repetirse

Cálculo del valor de la medición

El Cut- off se obtiene de los valores de la extinción de los dos controles Cut- of

Ejemplo: 0,42 OD control Cut-off+ OD Control Cut-off=0,86:2= 0,43

Cut-off=0,43

Resultados en unidades [NTU]

Promedio valor de la extinción de la muestra x10 =[nova Tec-unidades=NTU] Cut-off

1.591 x 10 = 37 NTU
0,43
Ejemplo:

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Interpretación de los resultados

Negativo < 30 IU/ML: La muestra no contiene anticuerpos contra el patógeno. Un

contacto previo con el antígeno (patógeno resp. Vacuna) es poco probable.

Positivo >35 IU/ML: Los anticuerpos contra el patógeno están presente. Ha producido un
contacto con el antígeno (patógeno resp. Vacuna)

Zona intermedia 30-35 IU7ML: Los anticuerpos contra el patógeno no se pudieron

detectar claramente. Se recomienda repetir la prueba con una muestra fresca en 2 a 4
semanas. Si el resultado es de nuevo en la zona intermedia, la muestra se considera como
negativa.

El diagnostico de una infección no solamente se debe basar en el resultado del ensayo.

Es necesario considerar la anamnesis y la sintomatología del paciente junto al resultado
serológico. Estos resultados solo tienen valor restringido en pacientes
inmunodeprimidos o en Neonatos.

Interferencias

Las muestras lipemicas, ictéricas y hemolíticas no mostraron interferencias con

este equipo ELISA hasta una concentración de 5 mg/ml para triglicéridos, de 0,5 mg/ml
para bilirrubina y de 10 mg/ml hemoglobina.

Calibración de los equipos

Se realiza una autocomprobación cada vez que inicia el software GEMINI. El instrumento
se inicializa y verifica todos los módulos del instrumento. Estos se comprueban de la
siguiente manera:

COP (Comando de procesador operativo) Se verifica la conexión serial a todos los

módulos del GEMINI.

Pipeta La pipeta se inicializa. Se comprueba el movimiento en los ejes x, y, z, se prueban

los codificadores y los sensores de inicio en estas direcciones. La pipeta se ceba con
líquido del sistema cinco veces.

Lavadora Se comprueban los sensores de inicio, los codificadores, la bomba de aspiración

y de dilución.

Fotómetro Se mide el voltaje de referencia del extremo frontal y también las señales de
fondo oscuro del fotodiodo. Cada filtro se prueba para elegir la ganancia de lectura
óptima y el ruido en la ganancia óptima. Se miden las transmisiones del canal óptico

Transporte de Placas Se comprueba el movimiento en los ejes x, y, z y se prueban los

codificadores en estas direcciones

Incubadoras Los sensores de temperatura se prueban y se verifica si los impulsores del

calentador no están en circuito abierto.

Los resultados de esta verificación del instrumento se muestran en la pantalla:

El resultado de la autocomprobación es satisfactorio si se muestra la palabra "Pasado"

para cada módulo del instrumento.

VALOR CRITICO: N/A

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6.- FORMULARIOS Y - REGISTRO DE MANTENIMIENTO EQUIPO
REGISTROS - Registro de muestras rechazadas e identificada inadecuadamente

7.- REFERENCIA
Inserto de Toxoplasma IgG NOVATEC

8.-ANEXOS

9.- LISTA DE DISTRIBUCIÓN Distribuido a:

• Gestión de Calidad de Laboratorio

REDACTADO POR REVISADO POR : APROBADO POR:

Firmado electrónicamente por:

Firmado electrónicamente por: Firmado electrónicamente por: MONICA LICETH
MIGUEL EFRAIN IRENE STEFANIA INTRIAGO
HOLGUIN MACIAS PACHECO SALAZAR VILLAVICENCIO

LCDO. MIGUEL HOLGUIN LCDA IRENE PACHECO LCDA. MONICA INTRIAGO

MACIAS GESTION DE CALIDAD DE LABORATORIO RESPONSABLE DE LABORATORIO
FECHA DE REDACCIÓN: FECHA DE REVISION: FECHA DE APROBACIÓN:

10 FEBRERO 2023 24 FEBRERO 2023 27 FEBRERO 2023

VERSION ORIGINAL: 1 ACTUALIZACION 1

FECHA DE VIGENCIA:
FEBRERO 2023