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Prueba previa del diario

Desarrollo y validación de un método RP-HPLC para el análisis

simultáneo de paracetamol, ibuprofeno, olanzapina y simvastatina
durante la biorremediación de microalgas

Telma Encarnação , António Aguiar , Cátia Palito , Alberto ACC

Pais , Maria G. Campos , Abı́lio JFN Sobral , Hugh D. Burrows

IIP: S2215-0161(20)30303-4
DOI: https://doi.org/10.1016/j.mex.2020.101083
Referencia: México 101083

Aparecer en: MétodosX

Fecha de recepción: 10 julio 2020

Fecha de aceptación: 24 de septiembre de 2020

Citar este artículo como: Telma Encarnação , António Aguiar , Cátia Palito , Alberto ACC Pais , Maria G.
Campos , Abı́lio JFN Sobral , Hugh D. Burrows , Desarrollo y validación de un método RP-HPLC para el
análisis simultáneo de paracetamol e ibuprofeno , olanzapina y simvastatina durante la biorremediación
de microalgas,MétodosX(2020), doi:https://doi.org/10.1016/j.mex.2020.101083

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Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY-NC-ND (
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)
Desarrollo y validación de un método RP-HPLC para el análisis simultáneo de paracetamol, ibuprofeno,
olánzapina y simvastatina durante la biorremediación de microalgas norte

Telma Encarnación*, António Aguiar, Cátia Palito, Alberto ACC País, Maria G. Campos, Abílio JFN Sobral and Hugh D.
Burrows

CQC, Departamento de Química, Universidad de Coimbra, 3004-535 Coimbra, Portugal

*
Correo electrónico del autor para correspondencia tencarnacao@qui.uc.pt

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RESUMEN
Se desarrolló y validó un método rápido de cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa (RP-HPLC) para la cuantificación
simultánea de paracetamol, ibuprofeno, olanzapina, simvastatina y ácido de simvastatina en el contexto de la biorremediación de
microalgas. El método fue validado de acuerdo con las pautas de la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. (FDA), la
Conferencia Internacional sobre Armonización (ICH) y Eurachem con respecto a la idoneidad del sistema, linealidad, exactitud, precisión,
recuperación, límites de detección y cuantificación, robustez, selectividad y especificidad. Los límites estimados de detección y
cuantificación fueron, respectivamente, 0,03 y 0,10 -g mL-1para paracetamol, 0,03 y 0,09 -g mL-1para ibuprofeno, 0,04 y 0,13 -g mL-1para
olanzapina, 0,27 y 0,83 -g mL-1para simvastantina, y 0.05 y 0.14 -g mL-1para el ácido de simvastantina. Los resultados de precisión
interdiarios e intradiarios estuvieron dentro del límite de aceptación de desviación estándar relativa (% RSD) de menos de 2, y se
encontró que el porcentaje de recuperación estaba dentro de los límites requeridos de 80-110%. El método desarrollado es rápido,
lineal, preciso, robusto y exacto, y se ha aplicado con éxito a la determinación de los productos farmacéuticos comunes mencionados
anteriormente durante la biorremediación de microalgas.

Palabras clave

Biorremediación, HPLC, validación de métodos, microalgas, productos farmacéuticos, aguas residuales

TABLA DE ESPECIFICACIONES

Área temática Ciencia medioambiental

Área temática más específica Química analítica

Un método rápido de cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-

nombre del método
HPLC)

Si corresponde, incluya detalles bibliográficos completos de la(s) referencia(s)

Nombre y referencia del método original
principal(es) que describan el método original del cual se derivó el nuevo método.

Si corresponde, incluya enlaces a los recursos necesarios para reproducir el método (por
Disponibilidad de recursos
ejemplo, datos, software, hardware, reactivo)

1. Introducción
 WLa contaminación del agua es una grave amenaza mundial para los huma salud y vida silvestre. Como resultado de la interna,
norte

uso agrícola e industrial del agua, los efluentes de las aguas residuales frecuentemente contienen contaminantes que pueden

persisten en el medio ambiente, se bioacumulan a través de la red alimentaria y llegan al agua potable. Varios

productos químicos orgánicos omnipresentes en el medio ambiente, por ejemplo, productos farmacéuticos, plastificantes, orgánicos persistentes

contaminantes (COP) no se eliminan mediante métodos de tratamiento convencionales y se pueden encontrar en bebidas

agua. La EPA de EE. UU. estima que el 20 % de la exposición dietética total a los contaminantes emergentes proviene de

agua potable [1,2] . La tecnología convencional de tratamiento de aguas residuales incluye tratamiento preliminar, primario y

tratamientos secundarios [3], que eliminan la mayor parte de la demanda bioquímica de oxígeno (DBO) y

sólidos en suspensión, que se encuentran en las aguas residuales. Sin embargo, el tratamiento convencional no puede producir efluentes de

de alta calidad, ya que el agua aparentemente limpia está cargada de contaminantes emergentes, junto con nitrógeno

y fósforo que causan eutrofización. Los tratamientos avanzados de aguas residuales incluyen tratamiento terciario,

utilizando técnicas fisicoquímicas, como la precipitación química, la ozonización, la luz ultravioleta, la ósmosis inversa,

junto con el tratamiento cuaternario. El tratamiento cuaternario está diseñado para la remoción de metales pesados,

contaminantes orgánicos e iones minerales solubles (también denominados quinternarios). El uso de microalgas para

El tratamiento de aguas residuales no es nuevo y ha sido explotado durante décadas. La eliminación de ciertos contaminantes.

de aguas residuales se ha informado en el tratamiento de textiles industriales [4], efluentes lácteos [5] y urbanos.

aguas residuales [6]. Actualmente, se ha implementado el uso de microalgas en varias estaciones para la

tratamiento de diversas fuentes de aguas residuales, incluidas las municipales e industriales [7,8]. Aguas residuales

el tratamiento es un proceso costoso pero las microalgas son una fuente de múltiples productos como pigmentos,

bioplásticos y metabolitos secundarios [9], que pueden ayudar a disminuir la carga respectiva.

Con el fin de reducir los efectos de los vertidos de contaminantes y cumplir con la normativa presente y futura

para la eliminación de aguas residuales, se necesitan sistemas más avanzados. Además, más y mejores métodos para

se requiere monitoreo y validación de contaminantes emergentes.

Los productos farmacéuticos utilizados en este estudio incluyen paracetamol (o acetaminofén) (PAR), ibuprofeno

(IBU), olanzapina (OLA) y simvastatina (SIM). Fueron elegidos por su ocurrencia o persistencia en

2
la ambiente; cabe señalar que el paracetamol un d ibuprofeno se clasifican generalmente como nocivos para

organismos acuáticos [10]. El paracetamol es el fármaco analgésico más utilizado y está muy presente en

efluentes El ibuprofeno es uno de los antiinflamatorios no esteroideos más utilizados. olanzapina,

un fármaco antipsicótico, utilizado para el tratamiento de la esquizofrenia, es resistente a la fotodegradación por

la luz del sol, y se encuentra en las aguas superficiales [11,12] . La simvastatina es un regulador de lípidos y también se encuentra a menudo en

efluentes Este fármaco es una lactona que se hidroliza en agua a la correspondiente --

hidroxiácido, el ácido de simvastatina (SIMA) (Fig. 1). En afluentes, concentraciones de 492340-6924 ng L-1de

PAR, 1681-33764 ng L-1de IBU, 7-115 ng L-1de OLA y 1230 ng L-1de SIM han sido reportados

[10,13].

HPLC es ampliamente utilizado por la industria farmacéutica para cuantificar productos farmacéuticos, con un enfoque particular

sobre su cuantificación en tabletas [14,15]. La cuantificación de contaminantes emergentes, como los productos farmacéuticos.

en las aguas residuales es un campo que necesita mayor exploración. En este contexto, el objetivo de este estudio fue

desarrollar y validar un método RP-HPLC para cuatro productos farmacéuticos comunes, con relevancia para

fines de biorremediación. El método validado se aplicó con éxito a la evaluación de la

desempeño y eficiencia de células libres e inmovilizadas de microalgasnanocloropsissp. en la eliminación

los cuatro productos farmacéuticos [16].

2. Experimental

2.1 Reactivos y productos químicos

El paracetamol se compró a Fagron Ibérica (España) y el ibuprofeno lo suministró Laboratórios

Medinfar (Lisboa, Portugal). Olanzapina fue adquirida de Zhejiang MYOY Import & Export Co., Ltd

(Hangzhou, China). La simvastatina fue cedida amablemente por Labesfal, Laboratórios Almiro, SA (Santiago

de Besteiros, Portugal). El medio de microalgas f2 se obtuvo de Varicon Aqua Solution (Malvern, Reino Unido).

Todos los demás reactivos y disolventes eran de grado analítico o HPLC.

3
 2.2 Instrumentación

El análisis por HPLC de PAR, IBU, OLA, SIM y SVA se realizó con un Dionex Ultimate

Sistema 3000 equipado con un autoinyector y cuatro detectores de longitud de onda doble UV/VIS variable. los

La columna utilizada para el análisis fue Luna Phenyl-Hexyl, Phenomenex® (Torrance, EE. UU.), con 5 µm

tamaño de partícula, 3 mm de diámetro interno y 150 mm de longitud, compatible con un cartucho SecurityGuard™

Phenomenex® (Torrance, EE. UU.), con 3,0 mm de diámetro interno, que estuvo en un horno a una temperatura

de 35 ˚C. Los datos se registraron utilizando el software Chromeleon. El análisis cromatográfico se llevó a cabo

en modo de gradiente de varios pasos, como se indica en la Tabla 1. Preferentemente, el detector de UV se fijó a 230 nm para

la detección simultánea de PAR, IBU, OLA, SIM y SVA. El volumen de inyección fue de 10 µL para

estándar y muestras. Antes del análisis, cada estándar y muestra se filtró a través de filtros de 0,22 µm. A

Se encontró que el tiempo de ejecución de 8 min era adecuado para la separación de los cinco analitos, seguido de un paso de lavado

de 3 min con buffer entre ejecuciones.

2.3 Preparación de la fase móvil, soluciones madre y estándar y controles de calidad

La fase móvil consistió en una mezcla de tampón y acetonitrilo según el gradiente

modo, Tabla 1. El tampón se preparó disolviendo 1,15 g de sal de hidrogenofosfato dipotásico en

650 ml de agua ultrapura. El valor del pH se ajustó a 7,3 - 0,1 con ácido fosfórico. Todos

las soluciones se filtraron a través de un filtro de membrana de 0,22 y se sonicaron para desgasificar. Cinco acciones de acetonitrilo

soluciones a 1mg mL-1de PAR, IBU, OLA, SIM y SIMA. SIMA se obtuvo por hidrólisis alcalina de SIM;

una solución de metanol SIM de 2 mg mL-1fue preparado y mezclado a partes iguales

volumen de solución de NaOH 0,04 M. Esta mezcla se calentó a 60 °C durante 45 min y luego se neutralizó con

HCl 1 M. Una solución SIMA de ca. 1 mg ml-1se obtiene y confirma por la ausencia del pico SIM en

4
HPLAnálisis C [17]. Dos soluciones estándar de trabajo c que contenían los cinco analitos se prepararon en el

concentraciones de 100 y 10 -g mL-1por dilución de cada solución madre con la fase móvil

(acetonitrilo:tampón, 50:50). Para la determinación de los límites de detección y cuantificación se utilizaron

seis soluciones estándar (0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1 y 1.25 -g mL-1) se prepararon a partir de 10 -g mL-1laboral

solución. Ocho soluciones estándar (0.5, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100 -g mL-1) se prepararon por dilución de la solución

estándar de trabajo con la fase móvil (acetonitrilo:tampón, 50:50). Para las soluciones de control de calidad, seis

repeticiones de 0.5, 1.5, 50 y 100 -g mL-1Los estándares que contenían los cinco analitos fueron

consideró. Todas las soluciones madre se almacenaron a -20 -C y las soluciones de trabajo se prepararon recién preparadas según se necesitaba.

2.4 Validación del método

El método para la cuantificación de PAR, IBU, OLA, SIM y SVA fue validado de acuerdo con los EE. UU.

Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) [18], y la Conferencia Internacional sobre Armonización (ICH)

directrices [19] además de Eurachem [20], con respecto a la idoneidad del sistema, linealidad, precisión,

precisión, recuperación, límites de detección y cuantificación, selectividad y especificidad.

2.4.1 Idoneidad del sistema

La prueba de idoneidad del sistema garantiza que el sistema de prueba completo, incluido el instrumento,

reactivos, columna y analista, es adecuado para la aplicación prevista. Para ello, seis consecutivos

las inyecciones se realizaron con la solución estándar de PAR, IBU, OLA, SIM y SIMA a una concentración de

75 µmL-1. Los parámetros número de placa teórica (norte), factor de capacidad (k´), resolución (R), Factor de coleo

(T) fueron analizados.nortees indicativo de la eficiencia de la columna,ḱes una medida de dónde está el pico de interés

ubicado con respecto al volumen vacío,Res una medida de qué tan bien se separan dos picos, yTes un

medida de la simetría del pico.

2.4.2 Límites de detección (LOD) y cuantificación (LOQ)

5
 LOD es la cantidad más baja de analito en un sa ple que se puede detectar pero no necesariamente
metro

cuantificado como un valor exacto, y LOQ es la cantidad más baja de analito en una muestra que puede ser

determinada cuantitativamente con exactitud y precisión aceptables. Los valores LOD y LOQ fueron

determinado mediante el uso de parámetros de regresión de una curva de calibración de seis soluciones estándar (0.1, 0.25,

0.5, 0.75, 1 y 1.25 µg mL-1) que contiene los cinco analitos (3.3-/S y 10-/S, respectivamente, donde - es

la desviación estándar de los residuos y S es la pendiente) [19].

2.4.3 Linealidad

La linealidad es un criterio crítico para el análisis cuantitativo y constituye una medida de precisión sobre

el rango del método. La linealidad del método propuesto se evaluó a través de curvas de calibración,

construido con ocho soluciones estándar, que contienen los cinco analitos, que van desde 0,5 a 100 -g mL-1,

para calcular el coeficiente de correlación, la pendiente y los valores de intercepción. Los datos se analizaron utilizando el Análisis

Paquete de herramientas de Microsoft Excel-(Microsoft Corp., Redmond, WA) con regresión lineal por el mínimo

método de cuadrados.

2.4.4 Exactitud y precisión

La exactitud de un método analítico expresa la cercanía entre el valor de referencia y el

valor que se encontró realmente. El valor medio debe estar dentro del 15% del valor teórico, excepto en

el LLOQ, donde no debe desviarse más del 20% [18]. La precisión del método fue

establecido analizando seis réplicas de los cuatro controles de calidad y calculando la veracidad de cada

analito La veracidad se expresa en términos de sesgo y representa la desviación sistemática de un verdadero punto central.

valor y se calculó como

% de precisión = (concentración observada/concentración nominal) x 100.

6
precision representa el grado de concordancia entre el valor medido y el valor de referencia [20].

La precisión generalmente depende de la concentración del analito y, por lo tanto, debe determinarse dentro del

rango de concentraciones de interés. La evaluación de la precisión se determinó mediante la repetibilidad (intradía)

y precisión intermedia (interdía) durante tres días consecutivos. Seis réplicas de cuatro controles de calidad.

soluciones (0.5, 1.5, 50 y 100 -g mL-1) se prepararon y analizaron de acuerdo con el índice intradiario e interdiario

precisión. La desviación estándar relativa (RSD) de los resultados debe ser inferior al 15%, de acuerdo con

los requisitos, excepto el LLOQ, donde debe ser inferior al 20% [18].

2.4.5 Selectividad y especificidad

La selectividad analítica podría interpretarse como “la medida en que el método se puede utilizar para

determinar analitos particulares en mezclas o matrices sin interferencias de otros componentes de

comportamiento similar[21]. IUPAC recomienda el término selectividad, mientras que otras áreas, por ejemplo, farmacéutica

campo, utilice el término especificidad, pero existe acuerdo sobre la interpretación. En el método desarrollado, el

respuesta de la solución que contiene solo PAR, IBU, OLA, SIM y SIMA se comparó con microalgas

medio de cultivo f2.

2.4.6 Recuperación

Se pueden utilizar estudios de recuperación para abordar el nivel de sesgo. La recuperación de PAR, IBU, OLA, SIM

y SIMA del medio de cultivo de microalgas se determinó por comparación de las concentraciones

respectivas con las de las soluciones estándar en la fase móvil a tres concentraciones diferentes (1, 50

y 100 -g ml-1).

2.5 Aplicabilidad del método

2.5.1nanocloropsissp. condiciones de cultivo

7
 nanocloropsissp. se obtuvo de Varicon Aq tua Solution, Malvern, Reino Unido, y se cultivó durante

6 días en medio 2 L f/2. 100cm3de unnanocloropsissp. el cultivo se filtró y se lavó, y las células

posteriormente se transfirieron a un fotobiorreactor cerrado esterilizado, al que se le agregaron 100 cm3de medio de cultivo

Se añadieron Cell-hi TEViT (Varicon Aqua Solution, Malvern, Reino Unido). Esto se basa en el medio f/2

privado de nitratos. La concentración de nitrato fue de 0.30 g L-1y salinidad 25 g L-1. Los medios de cultivo fueron

previamente esterilizado por irradiación de microondas.

2.5.2 Eliminación de productos farmacéuticos del agua pornanocloropsissp.

A los 100cm3nanocloropsissp. cultivo, una concentración de 50 -g mL-1de cada fármaco,

Se agregó PAR, IBU, OLA, SIM y SIMA. De manera similar, un blanco con 50 -g mL-1de cada fármaco,

PAR, IBU, OLA, SIM y SIMA, se agregó a 100 cm3de medio de cultivo f2, sin células. los

cultivos y los medios f2 fueron m-2s-1con fotoperíodo 16:8 y mantenido durante 60 horas. Se agregó agua Millipore cuando fue

necesario para asegurar el mismo volumen debido a la pérdida de agua por evaporación. Se tomaron muestras de 30 mL

reemplazado con agua Millipore. Los cultivos fueron aireados por burbujeo de aire atmosférico, a razón de 300 cm

3min-1, y crecido a 25±2 ºC bajo luz con un nivel de irradiación de ± 100 μmol. Cada experimento fue

realizado por triplicado.

3. Resultados y discusión

3.1 Desarrollo y optimización de métodos

Un método RP-HPLC para el análisis simultáneo de PAR, IBU, OLA, SIM y SIMA fue

desarrollado. De acuerdo con la literatura publicada, un método de HPLC anterior para la

determinación de OLA, SIM y SIMA, se utilizó una columna Phenyl-Hexyl para el análisis de los tres analitos

con buena separación y cortos tiempos de retención, lo que motivó la elección de esta columna. Con respecto a

Para el análisis de PAR e IBU, hay una serie de métodos informados en la literatura [22].

8
 También se consideró el pKa de los analitos; pKa s de PAR, IBU, OLA, SIM son 9.46, 4.85, 7.24

y 14,91, respectivamente. Siguiendo la regla general habitual, el pH de la fase móvil debe seleccionarse

dos unidades por encima o por debajo del pKa del analito. Alcanzar valores de pH cercanos a los valores más altos y más bajos de

Sin embargo, el pH, 12,91 y 2,85, es perjudicial para la columna. Para valores de pH fuertemente ácidos, IBU no es

disociado y muestra una fuerte atracción hidrofóbica con el lecho de sílice, resultando en tiempos de retención cercanos a los 4

min. Sin embargo, a pH 3, los tiempos de retención de PAR y OLA son 1,103 y 1,047, lo que da como resultado un pobre

separación de los picos y baja resolución. Por lo tanto, se eligió un valor de pH alrededor de 7 para la separación

de los cinco analitos. En cuanto a la fase móvil, se descartó el metanol ya que, ante la presencia de pequeñas

cantidades de ácido, puede ocurrir la transesterificación del ibuprofeno al éster metílico correspondiente. Por lo tanto, se eligió

acetonitrilo para el eluyente A y tampón de fosfato para el eluyente B. Diferentes proporciones de acetonitrilo

y tampón se probó hasta que se encontró la mejor separación en modo gradiente, como se describe en la Tabla 1. Bajo

las condiciones descritas, PAR, IBU, OLA, SIM y SIMA eluidos a los 1,26, 2,10, 3,72, 6,35 y 2,99 min,

respectivamente. El método fue validado en el rango de 05-100 -g mL-1.

3.2 Validación del método

3.2.1 Idoneidad del sistema.Los parámetros de idoneidad del sistema, resumidos en la Tabla 2, incluidos

%RSD, placas teóricas, factor de cola y resolución, cumplieron con los criterios requeridos. Los picos muestran simetría

y alta resolución. El % RSD del área del pico y el tiempo de retención para PAR, IBU, SIM y SIMA fueron

inferior al 2% (Cuadro 2), lo que indica que el sistema es apropiado para analizar simultáneamente los cinco

compuestos. Los valores del factor de capacidad para PAR e IBU están por debajo de 2; sin embargo, en un cromatograma de gradiente,

los valores del factor de capacidad no tienen significado teórico. Los resultados obtenidos con el sistema

idoneidad indican que los parámetros cromatográficos seleccionados son adecuados para identificar PAR, IBU, OLA,

SIM y SIMA.

9
 3.2.2 Límites de detección (LOD) y cuantificación a(LOQ).Los valores estimados para LOD y

LOQ se resumen en la Tabla 3. Los valores LOD y LOQ muestran la sensibilidad del método para el

detección y cuantificación de PAR, IBU, OLA, SIM y SIMA.

3.2.3 Linealidad.Para la evaluación de la linealidad del método, soluciones con concentraciones en

el rango de 0.5-100 -g mL-1fueron evaluados. Se encontró que el coeficiente de correlación era mayor que

0,9999 para los cinco analitos, lo que indica una buena linealidad de la curva de calibración (Tabla 4). el residuo

desviaciones estándar cercanas a cero, 0,17, 0,15, 0,11, 0,25, 0,5 para PAR, IBU, OLA, SIM y SIMA

respectivamente, confirme la linealidad. Sin embargo, por inspección visual de la respuesta de la parcela frente a la concentración, una

tendencia sistemática en la distribución refleja un cambio en la varianza con el nivel. El gráfico de residuos de la simvastatina indica que

el modelo se ajusta bien a concentraciones altas y es un buen predictor de concentraciones más bajas.

valores de concentración (Tabla 4).

3.2.4 Exactitud y precisión.Los datos obtenidos con la evaluación de la exactitud y

precisión se muestran en la Tabla 5. Todos los resultados cumplieron con los criterios de aceptación. El intradiario y el interdiario

Los valores de %RSD y sesgo se encuentran dentro de los criterios de aceptación del 15 % del valor teórico que demuestra

que el método desarrollado es preciso, fiable y reproducible [18].

3.2.5 Selectividad y especificidad.La selectividad del método se evaluó analizando

soluciones estándar en presencia de los componentes del medio de cultivo (Fig. 3). La ausencia de cualquier

La señal al mismo tiempo de elución que los cinco analitos sugiere que no hubo interferencias en la matriz.

3.2.6 Recuperación.Como se puede ver en la Tabla 6, todas las recuperaciones medias calculadas (veracidad) están en el

rango de 81-109% estando dentro del porcentaje de recuperación aceptable de 80-110% para los analitos

concentración de 1 ppm que indica la idoneidad de cuantificar simultáneamente los cinco analitos.

3.3 Aplicabilidad del método

10
 La aplicabilidad del método fue evaluada por evaluat la eficacia de la biorremediación, utilizando la

microalgasnanocloropsissp. Para la eliminación de los cinco productos farmacéuticos del agua contaminada. A

cuantificar PAR, IBU, OLA, SIM y SIMA en agua contaminada, se filtraron células de microalgas y se

el sobrenadante fue analizado por RP-HPLC por el método desarrollado en este trabajo.nanocloropsissp.

eliminado 11.33, 7.98 y 35.64 -g mL-1de PAR, IBU y OLA, respectivamente. Los resultados para SIM y

SIMA no fueron concluyentes; debido a algún nivel de precipitación de SIM y SIMA, no se pudo establecer

claramente si la desaparición de ambos compuestos se debió a la biorremediación oa la precipitación.

Sin embargo, aparecieron algunos picos adicionales en diferentes tiempos de retención pero con la misma

longitud de onda de SIM. Esto podría sugerir la metabolización del fármaco con el metabolito excretado

correspondiente. El presente estudio demuestra que la especie utilizada para la remoción de los fármacos es

adecuado para la biorremediación de PAR, IBU, OLA, SIM y SIMA en aguas residuales altamente concentradas.

11
4. Conclusiones

Se desarrolló y optimizó un método HPLC para la determinación y

cuantificación de PAR, IBU, OLA, SIM y SIMA durante la biorremediación usando

microalgas El método desarrollado demostró ser rápido, lineal, preciso, robusto y

preciso, y es adecuado para la evaluación de la eficiencia de biorremediación de microalgas.

Contribuciones de autor

La concepción y diseño del estudio, todos los cálculos, análisis e interpretación de

Los datos han sido realizados por TE. TE, AA y CP realizaron la optimización de HPLC; COMO

recursos proporcionados; El manuscrito fue escrito por TE; HB y ACCP revisaron la

cálculos y el manuscrito; El trabajo fue supervisado por HB, ACCP y MC.

Declaración de interés en competencia

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia ni relaciones

personales conocidas que pudieran haber influido en el trabajo informado en este documento.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), Agencia Portuguesa

para la Investigación Científica, para la beca de investigación de doctorado a TE, SFRH/BD/81385/2011. Estamos

agradecido por la financiación del Centro de Química de Coimbra (CQC) que cuenta con el apoyo de la FCT

a través de los programas UID/QUI/UI0313/2019 y COMPETE. Los autores también agradecen

Labesfal-Laboratórios Almiro, SA por la amable donación de simvastatina.

12
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15
 Fig. 1 Estructuras químicas de (a) paracetamol, (b) ibuprofeno, (c) olanzapina, (d)

simvastatina y (e) ácido de simvastatina.

Figura 2 Cromatograma del estándar 75 µg mL-1solución de PAR, IBU, SIMA y SIM

considerados para la evaluación de la idoneidad del sistema.

Figura 3 Cromatogramas (A) del medio f2 y (B) de los estándares PAR, IBU, SIMA y SIM
considerados para la evaluación del efecto matriz.

Tabla 1 Condiciones cromatográficas del método HPLC de gradiente.

Tiempo (min) Eluyente A (%) Eluyente B (%) Caudal (ml min-1)

0 30 70 0.8
1 40 60 0.8
2 60 40 0.8
5 sesenta y cinco 35 0.8
7 70 30 0.8
8 30 70 0.8
Eluyente A: acetonitrilo; Eluyente B: tampón fosfato a pH 7,3

Tabla 2 Parámetros de la prueba de idoneidad del sistema.

cromatográfico PAR (75 µg mL-1) IBU (75 µg mL- SIMA (75 µg OLA (75 µg mL- SIM (75 µg mL-
parámetros 1 ) ml-1) 1) 1)

Retencion Cima Retencion Cima Retencion Cima Retencion Cima Retencion Cima Aceptación
tiempo área tiempo área tiempo área tiempo área tiempo área criterios
(mín.) (mín.) (mín.) (mín.) (mín.)
Significar (norte=6) 1.26 37,15 2,10 25,0 2.99 17,6 3,72 51.0 6.35 31.3 -
Dakota del Sur 0.002 0,51 0,002 0.50 0.004 0,25 0,004 0,67 0.006 0,50 -
%RSD 0.13 1.38 0.11 2.00 0.13 1,42 0,11 1,30 0,09 1,58 ≤ 2,0 %a
Teórico 2816 8670 23708 20120 64570 > 1000a
platos (norte)
factor de capacidad 0.52 1.52 2.59 3.47 6.62 > 2.0b
(k)́
Factor de coleo (T) 1.08 1.06 1.14 1.23 0.98 ≤ 2,0b
Resolución (rs) 9.00 10.6 8.03 20.0 14.4 > 2.0b(>
1.5C.A)
a
[23]

b
[24]

b
[25]

dieciséis
Tabla 3 Límites estimados de LOD de detección y LOQ de cuantificación para PAR, IBU, SIMA, OLA

y SIM.

analito LOD (µg mL-1) LOQ (µg mL-1)

PAR 0.03 0.10
IBU 0.03 0.09
SIMA 0.05 0.14
OLA 0.04 0.13
tarjeta SIM 0.27 0.83

Tabla 4 Resultados obtenidos del análisis de regresión por el método de mínimos cuadrados ponderados para

PAR, IBU, SIMA, OLA y SIM (norte=6).

analito SignificarR2 Pendiente media ± SE Intersección media ± SE

PAR 0.99994 0,50 ± 0,070 - 0,004 ± 0,07
IBU 0.99991 0,34 ± 0,001 - 0,060 ± 0,07
SIMA 0.99997 0,44 ± 0,001 0,010 ± 0,05
OLA 0.99994 0,80 ± 0,003 0,230 ± 0,12
tarjeta SIM 0.99940 0,50 ± 0,005 0,367 ± 0,24

Tabla 5 Precisión y exactitud intradía e interdiaria para PAR, IBU, SIMA, OLA y SIM (norte=6).

Nominal Intradía (norte=6) entre dias (norte=18)

concentración Medido Precisión Precisión Medido Precisión Precisión
(µg mL-1) concentración %RSD %parcialidad concentración %RSD %parcialidad

(µg mL-1) (µg mL-1)

media ± DE media ± DE
PAR (0,5) 0,49 ± 0,01 3.80 - 2.82 0,50 ± 0,01 4.75 0.28
PAR (1.5) 1,53 ± 0,02 2.29 2.12 1,52 ± 0,01 1.61 1.23
PAR (50) 51,22 ± 0,55 2.14 2.44 50,74 ± 0,41 1.61 1.47
PAR (100) 100,56 ± 0,92 1.82 0.56 102,52 ± 1,04 2.02 2.52
IBU (0,5) 0,52 ± 0,01 5.20 4.69 0,52 ± 0,01 4.27 3.59
IBU (1,5) 1,60 ± 0,01 2.66 6.61 1,57 ± 0,02 3.34 4.52
IBU (50) 50,50 ±0,54 3.10 1.01 49,78 ± 0,38 2.21 - 0,43
IBU (100) 98,90 ± 0,73 0.73 - 1.10 102,73 ± 1,18 3.36 2.73
SIMA (0.5) 0,50 ± 0,01 5.54 0,95 0,50 ± 0,01 5.44 - 0.03
SIMA (1.5) 1,49 ± 0,03 4.29 - 0,60 1,50 ± 0,02 2.60 - 0,29
SIMA (50) 53,24 ± 0,93 3.96 6.48 51,68 ±0,80 3.51 3.36

17
SIMA (100) 100,44 ±0,89 2.01 0.44 102,42 ± 2,40 5.31 2.41
OLA (0,5) 0,51 ± 0,02 3.98 2.89 0,51 ± 0,02 4.84 2.65
OLA (1.5) 1,49 ± 0,04 2.98 - 0,59 1,49 ± 0,03 2.70 - 0,29
OLA (50) 49,51 ± 1,26 3.10 - 0,97 48,99 ±0,85 2.10 - 2,03
OLA (100) 96,87 ± 1,13 1.41 - 3.13 97,08 ±1,65 2.06 - 2,92
tarjeta SIM (0.5) 0,45 ± 0,01 5.25 - 9.98 0,44 ± 0,01 5.00 - 11.55
Tarjeta SIM (1.5) 1,52 ±0,02 2.81 1.57 1,52 ± 0,02 2.60 1.08
tarjeta SIM (50) 45,05 ± 0,96 0.96 3.97 46,07 ±0,76 3.07 - 7.86
tarjeta SIM (100) 91,48 ± 0,77 1.57 - 8.52 92,76 ± 0,88 1.76 7.24

Tabla 6 Porcentaje de recuperación de PAR, IBU, SIMA, OLA y SIM del cultivo de microalgas

medio (norte=6).

PAR IBU SIMA OL tarjeta SIM

A
µg mL-1 1 50 100 1 50 100 1 50 100 1 50 100 1 50 100
%Recuperar 102. 98. 98. 99. 96. 95. 99. 108. 108. 5 80.8 93. 101. 104. 93. 101. 0 3
y 0789767 9 7 03

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