Utilizacin de cianobacterias como bioindicadores de la calidad del agua en ros de la Comunidad de Madrid

Mateo, P., Perona E., Douterelo I., Rodrguez V., Loza V. Departamento de Biologa. Facultad de Ciencias. Universidad Autnoma de Madrid

AGUA: AGUA: BIEN BIEN ESCASO ESCASO

Degradacin Degradacin cualitativa cualitativa yycuantitativa cuantitativa del delagua agua

Creciente Creciente Importancia Importancia Calidad Calidad Ecolgica Ecolgicadel del agua agua

Incremento Incremento de dela la contaminacin contaminacin difusa difusa

ESTUDIOS DE SEGUIMIENTO: MONITORIZACIN

Cianobacterias: Cianobacterias: Aptitud Aptitud bioindicadora bioindicadora

Respuesta Respuestade de organismos organismosaa cambios cambios ambientales ambientales

DMA: DMA:incorpora incorpora Parmetros Parmetros biolgicos biolgicos

Estudio Estudiode de comunidades comunidades de deorganismos organismos

OBJETIVOS
Monitorizar ros de la Comunidad de Madrid

Estudiar Estudiarla la calidad calidadde deagua aguade de los losros rosdesde desdedos dos puntos puntosde devista: vista:

Estudiar la viabilidad del uso de las cianobacterias como organismos bioindicadores

FsicoQumico

Biolgico

CIANOBACTERIAS
Las Cianobacterias son organismos procariotas que realizan fotosntesis oxignica. Se caracterizan por tener clorofila a y ficobiliprotenas como pigmentos. Color verde-azulado. Son organismos que muestran gran diversidad morfolgica (unicelulares o formando filamentos, con o sin vaina alrededor). Sus clulas vegetativas pueden llegar a especializarse:
Heterocistos: capaces de fijar nitrgeno atmosfrico Acinetos: formas de resistencia.

Porqu las Cianobacterias?

Son abundantes en nuestros ros Fciles de recoger Dominantes en determinados ros

Productores primarios en la base de las cadenas trficas

Presentan caractersticas morfolgicas indicadoras

Efectos sinrgicos o antagnicos

Biodisponibilidad Integradores

Efecto acumulativo Biomagnificacin MTODOS BIOLGICOS

Deteccin contaminacin intermitente

Alto coste

MTODOS FSICO-QUMICOS Precisos, cuantifican los contaminantes del agua

Lmite de deteccin Contaminantes clave

Area de estudio
Ro Guadalix Ro Jarama Arroyo Tejada

Ro Guadarrama
MADRID

RoAlberche

Muestreo
Recogida de dos tipos de muestras
piedras agua

Raspado del biofilm

Medida in situ de parmetros fsico-qumicos

Anlisis Biolgico
Muestras de campo fijadas

Cultivos de laboratorio

fluorescencia

Calidad de las aguas en los ros estudiados

Todos los ros estudiados presentaron un incremento en la concentracin de nutrientes (fosfato, amonio y nitratos) aguas abajo

Gradiente de EUTROFIZACIN

Efecto de la eutrofizacin sobre la diversidad de cianobacterias

Ro Alberche

GUADALIX RIVER
20 18

JARAMA RIVER
20 18

SPRING
16 14 12 10

SUMMER
16 14 12 10

SPRING

SUMMER

NUMBER OF SPECIES

NUMBER OF SPECIES

8 6 4 2 0 20 18 16 14 12 10 8

8 6 4 2 0 22 20 18 16 14 12 10 8

AUTUMN

WINTER

AUTUMN

WINTER

6 4 2 0

6 4 2 0

SR

NH

SR

NH

SR

NH

SR

NH

TEJADA STREAM
20 18 16 14 12

AUTUMN SPRING

NUMBER OF SPECIES

10 8 6 4 2 0 20 18

WINTER
16 14 12 10 8 6 4 2 0

UPSTREAM DOWNSTREAM

SR- Species richness NH- Non heterocystous H- Heterocystous

NH

Estudio de la diversidad de las comunidades de cianobacterias mediante tcnicas moleculares

Raspado del biofilm ADN de la comunidad Mezcla de genes 16s rRNA Patrn de bandas de la comunidad

Extraccin de ADN

Separacin por TGGE

Los diferentes genes de 16S rDNA presentes en una comunidad se separarn mediante TGGE, con lo que obtendremos un patrn o perfil de bandas caracterstico de la comunidad que constituir su huella gentica.

Perspectivas futuras
1. Analizar los cambios en la biodiversidad morfolgica de las comunidades de cianobacterias en cursos fluviales de la Comunidad de Madrid. 2. Analizar las caractersticas ecofisiolgicas diferenciales de las poblaciones de cianobacterias de cursos fluviales de la Comunidad de Madrid. 3. Analizar la diversidad gentica de las comunidades de cianobacterias en cursos fluviales de la Comunidad de Madrid. 4. Correlacionar los cambios en la biodiversidad cianobacteriana, mediante la obtencin de huellas gnicas, con cambios en la calidad de las aguas de cursos fluviales de la Comunidad de Madrid.

Utilizacin de cianobacterias como biosensores de contaminantes

Fernndez-Pias F, Gonzlez-Garca C, Rodea-Palomares I, Legans F. Departmento de Biologa. Universidad Autnoma de Madrid. Cantoblanco. 28049 Madrid.

BIOENSAYOS DE TOXICIDAD
Los bioensayos de toxicidad se basan en el efecto adverso que pueden producir ciertos compuestos qumicos sobre un ser vivo. Estos ensayos son importantes en la evaluacin del impacto de la contaminacin en el medio. Los seres vivos detectan la parte biodisponible del contaminante (proporcin del contaminante que puede ser asimilado por un organismo). Se suelen clasificar en funcin del tiempo de exposicin del organismo al compuesto/s: De toxicidad aguda. Efectos a corto plazo en un tiempo mximo de 96 h. De toxicidad crnica. Efectos producidos a largo plazo. De toxicidad sub-aguda. Tiempos de exposicin inferiores al 10% de la vida media de la especie estudiada. De toxicidad multigeneracionales (genotoxicidad: dao del material gentico). Evaluacin de las alteraciones que producen los compuestos qumicos sobre los procesos reproductivos, si son o no teratognicos. En este tipo de bioensayos se suele hacer uso de peces, peces invertebrados, invertebrados plantas y algas. algas Se miden cambios en el crecimiento, reproduccin o metabolismo. La toxicidad se expresa como la dosis que es letal para el 50% de los organismos (LD50, Lethal Dose) o la dosis que inhibe en un 50% la actividad metablica que se est midiendo (EC50, effective concentration).

QU ES UN BIOSENSOR?

BIOSENSORES LUMINISCENTES 2 Tipos de luciferasa: Bacteriana (genes lux), Eucaritica (genes luc)
La luciferasa bacteriana (Vibrio fischeri, Photobacterium leiognathi, Photorabdus luminescens) codificada por los genes luxA y luxB, cataliza la reaccin: FMNH2 + RCHO + O2 RCOOH + H2O + Luz (490 NM) RCHO es un aldehido de cadena larga cuya sntesis enzimtica viene codificada por luxCDE

BIOSENSORES LUMINISCENTES
La luciferasa eucaritica de la lucirnaga (genes luc) cataliza la descarboxilacin oxidativa de la luciferina (cido carboxlico heterocclico) dependiente de ATP: luciferina + ATP + O2 oxiluciferina + PPi + CO2 + luz (560 nm)

ORGANISMOS BIORREPORTADORES (componente biolgico del biosensor): Los organismos transgnicos que portan los genes luc o luxAB nicamente bioluminescen si se les aade el aldehido o la luciferina. Los organismos transgnicos que portan el opern bacteriano lux completo luxCDABE Cepas autoluminiscentes

Biosensores luminiscentes no especficos o de ecotoxicidad general: Sirven para evaluar la toxicidad global de una muestra, no detectan toxinas especficas: El componente biolgico del biosensor presenta luminiscencia constitutiva y dicha luminiscencia disminuye en presencia de un analito/s txicos presentes en la muestra a analizar.

En este experimento se ha modificado a la bacteria Pseudomonas fluorescens para que exprese el opern lux de forma constitutiva (cepa autoluminiscente).

Esta figura muestra la inhibicin de la autoluminiscencia de las bacterias en respuesta a concentraciones crecientes de una toxina.

BIOSENSORES NO ESPECFICOS
Organismo modelo: La cianobacteria de agua dulce Anabaena sp. PCC7120 Dos cepas derivadas de Anabaena que son autoluminiscentes ya que llevan una integracin cromosmica del opern lux completo (luxCDABE) de la bacteria terrestre luminiscente Photorhabdus luminescens:

-Anabaena sp. PCC7120 CPB4336 -Anabaena sp. PCC7120 CPB4337

OBJETIVO GENERAL: UTILIZAR LAS CEPAS 4336 y 4337 PARA DETECTAR METALES PESADOS BIODISPONIBLES EN SISTEMAS ACUTICOS Optimizacin de las condiciones de ensayo de las dos cepas autoluminiscentes: Influencia de la composicin del medio de cultivo en la autoluminiscencia Influencia de la densidad celular Influencia del pH Ensayos de toxicidad con metales pesados: Metales a probar: Ag, Cu, Hg, Zn, Cd, Pb La toxicidad se estima por el grado de inhibicin de la autoluminiscencia constitutiva por la exposicin a concentraciones crecientes del metal La EC50 [concentracin efectiva del metal capaz de reducir en un 50% la bioluminiscencia de la muestra control (aquella no tratada con el metal) se escoge como Valor de Toxicidad.

Optimizacin de las condiciones de ensayo: Influencia de la composicin del medio y la densidad celular en la autoluminiscencia

20000 18000 16000 Luminescence ( RLU ) 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000

AA/8N pH 7.5 DO 750nm : 0.5 AA/8N pH 7.5 DO 750nm : 1 BG11 pH 7.5 DO 750nm : 0.5 BG11pH 7.5 DO 750nm : 1 H2O pH 7.5 DO 750nm : 0.5 H2O pH 7.5 DO 750nm : 1

Anabaena CPB4336
luminescence ( LRU )

30000 25000 20000 15000 10000 5000 0

0 1 6 0 5 9 15 14 29 43 58 72 87 10 11 13 14 17 4

0
10 1 11 6 13 0 14 5 15 9 17 4 14 29 43 58 72 87 0

time ( min )

Anabaena CPB4337

time ( min )

Optimizacin de las condiciones de ensayo: Influencia del pH en la autoluminiscencia

18000

Luminescence ( RLU )

16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0

H2O pH 5.8 H2O pH 7 H2O pH 7.5 H2O pH 8

Anabaena CPB4336

17 4

87 10 1

11 6

13 0

14 5

15 9

29

43

58

14

72

Condiciones ptimas: H2Od pH=5.8 D.O.750nm=0.5

25000

time ( min )

20000

Luminescence ( RLU )

15000

10000

H20 pH5.8 H2O pH7 H2O pH7.5 H2O pH8

5000

Anabaena CPB4337

0
10 1 11 6 13 0 14 5 15 9 17 4 14 29 43 58 72 87 0

time ( min )

Ensayos de ecotoxicidad con metales pesados Anabaena sp. PCC 7120 cepa CPB4336 expuesta durante 30 min a concentraciones crecientes de Zn
% of maximum bioluminescence
120

120

100

% bioluminescence inhibition
0 0.05 0.1 0.3 0.5 1 3 5 10 50 100

100

80

80

60

60

40

40

20

20

-8

-6

-4

-2

Zn concentration (mg l-1)

Log [mg l-1]

Orden de sensibilidad a los metales : Cepa CPB4336: Zn > Cu > Ag > HgCl2 > Cd > Hg(NO3)2 > Pb Cepa CPB4337: Cu Zn > Ag > HgCl2 > Hg(NO3)2 Cd > Pb EC50= 0.14 mg l-1

EC50s (mg l-1) del Cu, Zn, y Cd para distintas cepas bacterianas bioluminiscentes (15 min de exposicin)
Biosensor Synechocystis sp. sp. PCC6803 (luc) luc) Pseudomonas fluorescens 8866 (luxCDABE) luxCDABE) Pseudomonas putida F1(luxCDABE ) F1(luxCDABE) Pseudomonas fluorescens 10586s pUCD607 (luxCDABE) luxCDABE) Pseudomonas fluorescens 10586s FAC510 (plasmid luxABE) E.coli HB101 (luxCDABE) Anabaena sp. sp. CPB4336 (luxCDABE) Anabaena sp. sp. CPB4337 (luxCDABE) Rhizobium trifolii F6 pUCD607 (luxCDABE) luxCDABE) Microtox Photobacterium phosphoreum Rhizobium trifolii TA1 Tn5luxAB
a

EC50 (ppm) ppm) a los 15 minutos Cu 0.24 0.30 0.17 0.09 0.76 1.4 0.26 0.13 0.42 1.89 2.34 0.78a Zn 0.88 0.10 0.04 0.09 0.89 0.15 0.14 0.25 0.94 2.35 3.45 0.48a Cd 0.17 0.98 1.54a 2.68a 0.06 9.78 2.14a

EC50 calculada despus de 30 min de exposicin

PERSPECTIVAS FUTURAS Aplicacin de las cepas cianobacterianas para ensayos de ecotoxicidad en ros de la Comunidad de Madrid Inmovilizacin de las cepas para construir biosensores propiamente dichos Inmovilizacin en membranas de silicona

Self-luminescence of immobilized ANABAENA CPB4337

160x103 140x103 120x103 100x103 80x103 60x103 40x103 20x103 0 0 1 2 3 4 5 6

Luminescence (RLU)

Time (h)

PERSPECTIVAS FUTURAS Aplicacin de las cepas cianobacterianas para ensayos de ecotoxicidad en ros de la Comunidad de Madrid Inmovilizacin de las cepas para construir biosensores propiamente dichos Inmovilizacin en membranas de silicona Inmovilizacin en agar

Construcin de cepas biorreportadoras basadas en cianobacterias aisladas de ros de la CM

Anabaena sp. PCC7120

MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIN!

EC50s (mg l-1) de Ag, Cu, Hg (HgCl2), Hg [Hg (NO3)2], Zn, Cd y Pb para las cianobacterias autoluminiscentes Anabaena sp. PCC 7120 cepas CPB4336 y CPB4337 a tiempos crecientes de exposicin al metal pesado.
Anabaena sp. PCC 7120 CPB4336 Ag Cu HgCl2 Hg(NO3)2 Zn Cd Pb Anabaena sp. PCC 7120 CPB4337 Ag Cu HgCl2 Hg(NO3)2 Zn Cd Pb

15 min 0.26 0.26 0.93 2.42 0.50 ---------

30 min 0.25 0.23 0.87 1.48 0.14 1.54 13.94

60 min 0.17 0.10 0.56 0.93 0.05 0.75 4.79

90 min 0.12 0.04 0.04 0.40 0.88 0.04 0.56 3.15

120 min 0.10 0.03 0.30 0.63 0.04 0.48 2.53

150 min 0.09 0.02 0.19 0.53 0.04 0.46 2.35

180 min 0.09 0.02 0.12 0.50 0.04 0.47 2.12

15 min 0.16 0.13 0.54 2.26 1.64 ---------

30 min 0.18 0.09 0.40 0.98 0.25 2.68 ------

60 min 0.13 0.05 0.18 0.70 0.07 0.76 16.79

90 min 0.10 0.03 0.14 0.50 0.05 0.60 8.98

120 min 0.09 0.02 0.12 0.49 0.04 0.49 4.19

150 min 0.08 0.02 0.10 0.48 0.04 0.48 2.69

180 min 0.08 0.02 0.09 0.48 0.04 0.46 1.88

Orden de sensibilidad a los metales (60 min de exposicin): -Cepa CPB4336: Zn > Cu > Ag > HgCl2 > Cd > Hg(NO3)2 > Pb -Cepa CPB4337: Cu Zn > Ag > HgCl2 > Hg(NO3)2 Cd > Pb Basado en los valores de EC50 (60 min), la cepa CPB4337 es ms sensible a Zn, Ag, y Cu . Pb es el in menos txico.