Estudio de los virus...

Presentado por el equipo 5

 Contenido:
02
01 03
Microscopia Ultrafiltración Ultracentrifugación
electrónica
05
06
Determinación
04 Tinciones
Rayos X del tamaño
07 08
Difracción de Análisis secuencial
Rayos X de ácido nucleico
 01
Microscopia
electrónica
Mediante el microscopio electrónico es posible observar la
morfología de los viriones presentes en muestras clínicas.

Este metodo tiene diferentes limitaciones:

El miroscopio es costoso.
Necesita una alta concetracion de viriones (109
partículas virales /ml) presentes en la muestra.
Se emplean electrones y el enfoque se realiza
mediante campos magnéticos, los objetos
que van a observarse se colocan sobre carbón
o una membrana de colodión.
 Moldeado de sombras
Antes de colocar la preparación el el microscopio, se dispone una
cámara de vacío y se evapora un metal (oro o cromo), de tal manera
que se forma una capa metálica muy delgada que recubre la
superficie de las partículas.
Esta envoltura del objeto no es uniforme, pues la mayoría del metal se
deposita en el lado de la partícula más próxima al punto donde
procede el vapor metálico, mientras que en el opuesto se deposita
poco.
Moldeado de sombras
Cuando se observan al microscopio se pueden apreciar en
tercera dimensión.
Al verse los virus en la pantalla fluorescente, se acostumbra
tomar fotos donde se pueden observar detalles y además
puede calcularse el tamaño y estudiarse la morfología
Sujeto
C
 02
Ultrafiltración
 El método de filtración y de ultrafiltración
permiten la detección e identificación viral
por medio de técnicas de biología
molecular (RT-PCR, PCR), conserva la
capacidad infecciosa del virus, que se
puede evidenciar por el aislamiento viral en
líneas celulares sensibles a ello.
¿Cómo funciona?
Muestra de sangre, saliva o mucosas del
individuo, así se obtiene una muestra del
material genético (ARN o ADN)
En caso de ser ARN hay que transducir a
ADN bicatenario (RT)
Se añaden reactivos químicos (Taq
polimerasa, cebadores, ADN molde y
nucleótidos ) para crear copias genéticas
Se introducen en un termociclador para
obtener miles de millones de copias
Si el virus está presente se observará
flourecencia en las copias
 03
Ultracentrifugación
Existen dos procedimientos de ultracentrifugación aplicables
en el diagnóstico virológico por microscopía electrónica.

El primero de estos procedimientos se basa en la propiedad

que tienen las partículas virales de flotar en sales de cesio.

Se somete la muestra que se va a examinar a un gradiente de

flotación por ultracentrifugación en sales de sulfato de cesio.

 Obtener un
Antes de la preparación del gradiente se sobrenadante libre
requiere homogeneizar la muestra y de bacterias
centrifugarla a baja velocidad utilizando una y detritos
centrífuga de tipo corriente a 2.000
revoluciones por minuto durante 10 minutos.

Después de esta centrifugación se ajusta el índice de

refracción del sobrenadante mediante la adición de
sal sólida de cesio y se procede a la ultracentrifugación.
El índice de refracción deseado y por consiguiente el tipo
de gradiente requerido depende de la densidad de las
partículas virales que se desean detectar.

En el caso de virus con envoltura de lípidos se prepara un

gradiente de sacarosa para concentrarlos según su
tamaño y su coeficiente de sedimentación.

Las partículas se sedimentarán de acuerdo con las

concentraciones de sacarosa y el tiempo de
centrifugación utilizados.
Para el caso de virus desnudos (sin envoltura lipídica), son
suficientes 35.000 r.p.m. durante 18 horas para alcanzar el
equilibrio por flotación.

Cuando se utilizan los gradientes de sacarosa, el tiempo de

centrifugación depende de la concentración de sacarosa en
el gradiente.

Se utilizan generalmente tubos de nitrocelulosa, de

2 pulgadas de largo por media pulgada de
diámetro.
Los virus quedan contenidos en las bandas que origina el
gradiente y se observan mediante trans-iluminación del
tubo de centrífuga sobre un fondo oscuro o negro.

Una vez localizada las posiciones de las bandas se obtiene el

material para estudio mediante la perforación lateral del
tubo y aspiración con una jeringa de tipo tuberculina con
aguja calibre 26.
El material obtenido se deposita sobre una rejilla para
microscopía previamente cubierta con película de
colodión y contrastada con carbón evaporado, y se
tiñe con alguno de los colorantes utilizados en
microscopía electrónica, generalmente ácido
fosfotúngstico al 2%.
 04
Rayos X
 Método de difracción de Rayos X

Una de las palicaciones de la difraccion de rayos X es ver

como maduran los virus en el inyterior de una celula.
Se pueden ver virus al interior de una celula infectada.

1. la microscopia de Rayos X se utiliza para obtener

imagenes de celulas infectadas desde distintos angulos.
2. La informacion obtenida se procesa mediante
reconstruccion tomografica tridimencional.
3. Como resultado se obtienen imagenes de tal calidad y
resolucion que permite a los investigadores diferenciar las
fases del proceso de maduracion del virus dentro de una
célula.
Aplicaciones
Es un metodo de alta tecnología no destructivo para el analisis de una
amplia gama de materiales incluidos, fluidos, metales, minerales,
plasticos, productos farmacéuticos, ceramicas, etc.
Obtener informacion sobre la estructura de un material: tamaño y
forma de las particulas.
Determinación de la estructura molecular de una sustancia cristalina,
Sujeto
en los campos de la Mineralogía, Química Orgánica e Inorgánica,
C
Productos farmacéuticos, Bioquímica, Física de los materiales, y
productos químicos en general.
 Aplicaciones en Virología
La difraccion de Rayos X de cristales de proteínas da detalle de su
conformación tridimencional.
Tambien da detalle de la interaccion de peptidos e hidratos de carbono, si
estos estuvieran presentes.
Se utiliza para analisas subunidades de virus (como las proteinas que los
conforman).
Determinar el impacto de las mutaciones en los peptidos de los virus
relacionadas con cambios en la union de anticuerpos y receptores de células
huesped.
Importancia
La difraccion de Rayos X ha abierto un nuevo
enfoque en la busqueda de farmacos antivirales.

Ahora que se conoce la estructura

tridimencional de muchos virus, se ha podido
identificar los sitios de union de los receptores en
las proteinas de la capside.
 05
Determinación
del tamaño
Para los virus se utiliza una medida inferior al micrón,
llamada nanómetro (nm) o milimicron (mµ) que
equivale a 10-1 metros.

Por filtración y microscopía electrónica se ha visto que

el tamaño de los virus va de 20 a 300 nm.
 06
Tinciones
 PARA LA MICROSCOPIA

ELECTRONICA

1. Sombra metálica
2. Tinción negativa
3. Tinción positiva
Tinción
Tinción del sombreado, donde las partículas virales se

ponen en un ángulo donde el metal que se utiliza en

sombra
ella se deposita sobre el virus pero no sobre su sombra

metálica y sólo se visualiza lo que no se ha cubierto con el

metal.

Tinción negativa es donde el acetato de uranilo

Tinción
forma una especie de molde viral que permite

negativa detallar la estructura del virus.

En la tinción negativa se utilizan tintes ácidos,

como ls nigrosina o tinta china.

 En la tinción positiva, los átomos de metales
pesados están unidos a sitios específicos de
la molécula teñida, es decir los iones del
Tinción metal pesado reaccionan con
positiva macromoléculas de la muestra
incrementando su contraste. Algunas de las
sales metálicas comúnmente usadas (por
ejemplo, acetato de uranilo) se aplican
tanto para tinción negativa como positiva.
 Es fácil de ejecutar.
Tinción

Es una técnica económica.

Negativa
Procedimiento
El contraste se obtiene embebiendo la partícula en una sal de un metal pesado
(ácido fosfotúngstico al 2%, acetato de uranilo al 4%) que perfila mínimos
detalles ultraestructurales sobre un fondo oscuro; de ahí su denominación
como técnica de “contraste negativo” o tinción negativa.

Ejemplo de muestra con tinción negativa.

Micrografía electrónica de un virus cascabel
de tabaco después de la tinción negativa con
fosfotungstato de potasio.
Morfología de los virus: viriones purificados observados al

microscopio electrónico tras una tinción negativa

 TINCION DE SOMBRA METALICA
El sombreado metálico consiste en pulverizar el espécimen con una fina capa de
un metal pesado como oro o platino, desde un ángulo.
Los objetos de la preparación producen sombras en la capa de metal dando
lugar a una imagen con una cierta apariencia tridimensional que permite calcular
el tamaño del objeto.

Ejemplo de muestra con tinción sobras metálicas. Micrografía

electrónica de un virus cascabel de tabaco después de la

tinción negativa con fosfotungstato de potasio.

 TINCION CON NANOPARTICULAS DE ORO Y

PLATA
ORO El procedimiento requiere como primer paso separar
nanopartículas de plata que vistas a través de un
espectrofotómetro (de UV visible) y suspendidas de agua
presentan un color amarillo intenso.
Después se coloca junto a moléculas que tienen la capacidad de
unirse a los anticuerpos contra proteínas del virus. A esta parte
se le conoce como funcionalización.
Virus SARS-COV-2

PLATA
Se trata de una técnica que permite detectar la
presencia de virus en lugar de anticuerpos.
 08
Análisis
secuencial de
ácido nucleico
Métodos de hibridación
El principio de la hibridación de ácidos nucleicos es que el
ADN monocatenario se hibridará por apareamiento de
bases con enlaces de hidrógeno con otra cadena sencilla de
ADN (o ARN) de secuencia de bases complementaria. Por lo
tanto, las dos hebras de la molécula de ADN diana se
separan primero por calentamiento, luego, después del
enfriamiento, se deja hibridar con una sonda de ADN o ARN
monocatenario marcada presente en exceso.
Métodos de transferencia de puntos (hibridación de
filtros)

Métodos de hibridación in situ

Métodos de hibridación de Southern Blot

 Reacción en cadena de la
polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa es un método in

vitro para la síntesis enzimática de secuencias específicas de
ADN utilizando dos cebadores oligonucleótidos, que se
hibridan con cadenas opuestas y flanquean la región de
interés en el ADN diana.
 Secuenciación del genoma viral y
secuenciación parcial
Se utiliza para detectar más mutaciones en
el parvovirus canino que podrían predecir la
necesidad de otra reformulación de la
vacuna.
Dos herpesvirus putativos no cultivables, el
herpesvirus ovino 2, la causa de la fiebre
catarral maligna bovina asociada a las
ovejas, y el herpesvirus asociado con el
sarcoma de Kaposi en humanos, fueron
descubiertos mediante este método.
Huellas dactilares y restricción de
oligonucleótidos y
Mapeo de endonucleasas
En 1981, el origen y la propagación del
virus de la fiebre aftosa en una epidemia
que se propagó entre países de Europa
se lograron mediante el uso de huellas
dactilares de oligonucleótidos del ARN
viral obtenido de aislamientos de sitios
clave.
Bibliografía
Shay G, Martinson B, Moyer M, Dahling D. A multiplex reverse transcription –PCR method for
detection of human enteric viruses in groundwater. Appl Environ Microbiol. 2003;69:3158-64.
http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0120-
41572010000200015#:~:text=El%20m%C3%A9todo%20de%20filtraci%C3%B3n%20y,l%C3%ADnea
s%20celulares%20sensibles%20a%20ello. (Accesado 13 de agosto de 2022)
¿Cómo funcionan las pruebas de la COVID-19? Explicación de la prueba RT-PCR
https://www.iaea.org/es/newscenter/multimedia/videos/como-funcionan-las-pruebas-de-la-covid-
19-explicacion-de-la-prueba-rt-pcr (Accesado 13 de agosto de 2022)
Merchant, Packer. (1980). Métodos de estudio de los virus. En Bacteriología y Virología Veterinarias
(607-625). Zaragoza España: ACRIBIA.
Frederick A. Murphy E. Paul J. Gibbs Marian C. Horzinek Michael J. Studdert. (1999). Laboratory
Diagnosis of Viral Diseases. En Veterinary Virology(197-223). California USA: Elsevier.
MacLachlan, N. J., et. at. (2011). Fenner's Veterinary Virology. 4ta ed. Ed: Elsevier. Londres, Inglaterra.
Macias Ferrer, D. (12 de Diciembre de 2012). Difracción de Rayos X. En: SlideShare. Extraído de:
https://es.slideshare.net/mtrodavidmaciasferrer/difraccin-de-rayos-x