1.

- CLASIFICACION DE LAS PRUEBAS DE LABORATORIO

Las pruebas de laboratorio se dividen en colorimétricas, cristalográficas e
inmunoenzimaticas.

1.1.- Colorimétricas
Las pruebas de colorimetría son técnicas empleadas con mayor frecuencia en
los laboratorios de bioquímica. Esta técnica suministra información cualitativa y
cuantitativa sobre sustancias en disolución, el instrumento utilizado para ello es
un colorímetro (Fig. 1) el cual se encuentra diseñado para dirigir un haz de luz
paralela monocromática a través de una muestra líquida y medir la intensidad
de la luz emergente.

FIGURA 1.- Colorímetro

El color es un atributo que percibimos de los objetos cuando hay luz. La luz es
constituida por ondas electromagnéticas que se propagan a unos 300.000
kilómetros por segundo. Esto significa que nuestros ojos reaccionan a la
incidencia de la energía y no a la materia en sí.
Las ondas forman, según su longitud de onda (Fig. 2), distintos tipos de luz,
como son:

 Luz infrarroja
 Luz visible
 Luz ultravioleta o blanca

Figura 2.- Espectro electromagnético, con las longitudes de onda de cada tipo
de radiación.
La colorimetría y fotocolorimetría no son en realidad distintas y la diferencia
estriba en el tipo de instrumental empleado, de forma que se denomina
colorímetro a aquellos aparatos en los que la longitud con la vamos a trabajar
se selecciona por medio de filtros ópticos (Fig. 3). Y en los fotocolorimétricos o
espectrofotómetros la longitud de onda se selecciona mediante dispositivos
monocromadores (Fig. 3).

a) b)
Figura 3.- Dispositivos de Luz para aparato colorímetro como son los filtros
ópticos (a)) y para los aparatos fotocolorímetros los dispositivos llamados
monocromadores (b)).
En principio todos los sistemas que cuantifican el color quedan definidos por
tres parámetros:
 Luminancia: medición luminosa de la intensidad de la radiación:
subjetivamente se habla de luminosidad y se dice que un color tiene mucho
brillo (claro) o poco brillo (oscuro). Se le puede simbolizar con L y su unidad
de medida es (Cd/m2).
 Longitud de onda predominante: la longitud de la radiación
monocromática correspondiente. Subjetivamente se habla de matriz o tono
y se dice que un color es amarillo, verde, azul, etc. Se le puede simbolizar
con 2d y su unidad es (nm) o (mm) o también el Angstrom (Å).
 Pureza: magnitud de la dilución de un color en blanco. Se representa por un
índice variable entre 0 y 1. Subjetivamente se habla de saturación. Y se dice
por ejemplo que un color rosa (mezcla de rojo con blanco) está poco
saturado en contraposición de un rojo que si lo está. Se lo puede simbolizar
con P.
ESPECTROS DE ABSORCIÓN
Muchos compuestos químicos tienen espectros característicos de absorción en
la región visible y ultravioleta y esto hace posible la identificación de dichos
materiales en una mezcla.
Proteínas: los aminoácidos triptófano y tirosina absorben a 280 nm lo cual
constituye el fundamento de una técnica muy sensible para determinar
proteínas sin que se destruya la muestra. Las proteínas también absorben en el
ultravioleta lejano, debido a los enlaces peptídicos.
Ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos y los bases que los componen
presentan una absorción máxima en la región de 260 nm. La magnitud de
absorción de estos ácidos constituye una medida de su integridad ya que los
ácidos nucleicos parcialmente degradados absorben más fuertemente que los
materiales nativos. Las bases que componen los ácidos poseen un espectro de
absorción suficientemente diferente lo cual permite usarlo en su identificación.
Hemoglobina: cuando se modifican las hemoglobinas por medio de ciertas
drogas o de monóxido de carbono, se presenta un cambio característico en la
absorción máxima y por lo tanto la presencia de estos agentes modificantes
puede ser detectada y medida a unos 540nm de absorbancia.

1.2.- Cristalográficas
La Cristalografía es la rama de la ciencia que estudia los cristales.
Hoy sabemos que los cristales contienen átomos, moléculas y/o
iones que forman unidades de repetición, llamadas celdillas
elementales (Fig.4)

Figura 4.- Formación de un cristal, por aromos y moléculas.

La Cristalografía es capaz de averiguar la estructura intima de la materia de la
que están formados los cristales, sea esta viva o inanimada. Conocer la
estructura interna de la materia significa averiguar las posiciones de todos sus
átomos y determinar los modos en que están unidos, pues en muchos casos
forman agrupaciones atómicas que conocemos con el nombre de
moléculas. Este conocimiento nos permite no sólo comprender las propiedades
de la materia, sino también modificarlas para nuestro beneficio.
1.3.- Inmunoenzimáticas
Para evidenciar la reacción antígeno-anticuerpo se han usado diferentes
métodos; de los basados en la inmunoprecipitación y la aglutinación, que
adolecen de insuficiente sensibilidad y detectabilidad, se pasó a los que
emplean marcadores para detectar dicha reacción. Se han usado isótopos
radioactivos, compuestos fluorescentes y quimioluminiscentes, marcadores
electroactivos, lantánidos, radicales libres estables, partículas de látex,
liposomas, colorantes, coloides, bacteriófagos y enzimas, entre otros.
Los ensayos que usan como marcador enzimas (técnicas inmunoenzimáticas,
inmunoensayos enzimáticos o ensayos inmunoenzimáticos) presentan
extraordinarias ventajas aún no superadas, tales como:
• Elevada sensibilidad, detectabilidad y especificidad.
• Equipamiento relativamente barato.
• Procedimientos técnicos rápidos y sencillos.
• Alta precisión y exactitud.
• Reactivos relativamente baratos y de larga vida.
• Gran variedad de substratos y cromógenos que incrementa su versatilidad.
Las técnicas inmunoenzimáticas constituyen el desarrollo ulterior del
radioinmunoanálisis; en lugar de los peligrosos radioisótopos de corta vida
media, se emplean enzimas como sustancias marcadoras. Surgieron a
mediados de la década de los 60 para la identificación y localización
intracelular de antígenos y han tenido un auge vertiginoso, su uso se ha
ampliado para la detección de un diverso número de antígenos y anticuerpos.
Estos ensayos se apoyan en tres características biológicas fundamentales: la
extraordinaria especificidad de los anticuerpos, el elevado poder catalítico y la
alta especificidad de las enzimas. Mediante la combinación de la reacción
inmunológica con un indicador altamente sensible, el débil efecto inmunológico
se ve reforzado por la amplificación enzimática, de forma que se consigue una
elevada sensibilidad y detectabilidad.
La reacción antígeno-anticuerpo se detecta generalmente mediante un cambio
de color o la emisión de luz, producidos por la interacción de la enzima y su
substrato. Ambos efectos son cuantificables y proporcionales a la intensidad de
la interacción. El uso de substratos de depósito permite la visualización de los
resultados y es muy utilizado sobre membranas.

2.- TÉCNICAS ORIENTATIVAS

Las pruebas de orientación utilizadas para la identificación preliminar de
sangre son:
presente en algún soporte encontrado en el lugar sujeto a investigación.
las pruebas de orientación utilizadas para la identificación preliminar de sangre
presente en algún soporte encontrado en el lugar sujeto a investigación.
Objetivos
 Conocer las pruebas de orientación utilizadas para la identificación preliminar
de sangre
presente en algún soporte encontrado en el lugar sujeto a investigación

2.1.- Técnica de Bencidina o Adler

La bencidina fue utilizada por ADLER desde 1904 en la clínica y posteriormente
se aplicó en Medicina Legal. Es el método más utilizado y desde que fue
propuesto, ha estado sometido a diferentes modificaciones que afectan tanto a
los reactivos empleados como a la técnica que se utiliza en su aplicación. En el
caso de la prueba de Adler, el reactivo se obtiene a partir de la bencidina. Se
han descrito diferentes formas de prepararlo. En un principio se utilizaba una
disolución de bencidina en alcohol. Posteriormente se propuso un
procedimiento alternativo, que consiste en disolver a saturación la bencidina en
ácido acético glacial.
La hemoglobina, descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno, que
al reaccionar con la bencidina la oxidará formando un compuesto intensamente
azul.
Esta técnica tiene una sensibilidad de 1, 300,000 a 500,000. Un resultado
negativo excluye la presencia de sangre; si la reacción es positiva requiere,
como toda técnica de orientación, del empleo de reacciones de confirmación ya
que se pueden obtener falsas reacciones positivas con otras sustancias que
tengan actividad semejante a las peroxidasas o bien con otros materiales
oxidantes como las manzanas, espárragos, frijol, zarzamora, entre otros.

2.2.- Técnica de la fenolftaleína o de Kastle-Mayer

Se basa en los indicadores químicos de la hemoglobina, sustancia de la sangre
que reacciona a la fenolftaleína, es básicamente una prueba colorimétrica. La
fenolftaleína en soluciones ácidas permanece incolora, pero en presencia de
bases se torna rosa o violeta, se utiliza el reactivo conocido con el nombre de
Kastle-Meyer.
La prueba únicamente sirve para confirmar que la muestra obtenida es sangre,
aunque no podemos conocer su origen pues algunos vegetales (brócoli) y
minerales (cobre), también causan que la fenolftaleína reaccione.
Esta técnica es mucho más sensible que la de la bencidina, siendo esta
sensibilidad de 1: 1, 000,000 a 10, 000,000.
2.3.- Técnica de leuco malaquita verde
También se le llama reacción de MEDINGER. El reactivo se puede preparar de dos
formas: La primera consiste en mezclar 0,32 g de perborato de sodio con 0,1 g de
leuco malaquita verde.
Para que la reacción sea considerada como positiva se debe observar en menos de 10
segundos un color azul-verdoso. La sensibilidad del método es de 1/100000

Se basa, al igual que las anteriores en una reacción de oxidación y reducción.

La estructura química de esta sustancia recuerda a la de la fenolftaleína. El
prefijo leuco se refiere a la forma reducida incolora; la forma leuco puede ser
preparada por reducción de la malaquita verde.
2.4.- Reacciones quimioluminiscentes
La quimioluminiscencia es la obtención de luz a partir de una reacción química
(exotérmica, es decir, que desprende energía), y se produce cuando los
electrones de las capas más externas del átomo saltan a las más internas.
El luminol es un compuesto quimioluminiscente y, por ello, el método consiste
en provocar la producción de luz por parte de las peroxidasas presentes en la
muestra.
Esta prueba es muy útil cuando las manchas son difíciles de ver, cuando se
encuentran en superficies oscuras, en grietas o hendiduras o zonas que han
sido lavadas. El luminol no destruye la mancha y no interfiere en el caso de que
se realicen después otras pruebas de confirmación o serológicas. La
sensibilidad es de 1/5000000 y es más efectivo con sangre antigua que con
sangre fresca. Se puede aumentar la efectividad rociando previamente la
mancha con ácido hidroclórico al 2% para descomponer la hemoglobina.

3.- TÉCNICAS DE CONFIRMACIÓN

Las pruebas de Teichmann y Takayama detectan la hemoglobina, ambas

dependen de una reacción entre un reactivo y la hemoglobina, esto produce
cristales de reacción, que puede ser visto bajo un microscopio, una ventaja
considerable de estas pruebas es que son más eficaces con manchas viejas.

3.1.- CRISTALES DE HEMINA O DE TEICHMANN

En 1853 Ludwig Teichmann, en Polonia desarrollo el primer ensayo

cristalográfico para hemoglobina, usando cristales de hemina o hematina. El
método es aplicable cuando la mancha de sangre se encuentra sobre metales
oxidados o cuando se ha sometido a altas temperaturas. Se admite desde
entonces que, si se observa la formación de los cristales, la mancha es, con
toda seguridad, de sangre.
Los cristales de hemina que se forman son romboidales y de color café obscuro
(Fig.5)

Figura 5.- Cristales de Hemina o Teichmann

3.2.- CRISTALES DE TAKAYAMA O HEMOCROMÓGENO

Solución para reconocer las manchas de sangre, compuesta de piridina, hidrato

de sodio y dextrosa, que en contacto con las manchas forma cristales de
piridino-hemocromógeno

Los cristales pueden formarse tanto en medio ácido como alcalino; sin
embargo, el reactivo de Takayama es de naturaleza alcalina.

En caso positivo se observarán cristales romboidales con forma de helechos,

pinceles o espinas de color rosado (Fig. 6).

Figura 6.- Cristales de Takayama

Las manchas encontradas en la escena del crimen se han constituido como

elemento esencial en la resolución de investigaciones judiciales. Establecer su origen y
grupo sanguíneo aporta información útil en el proceso de inclusión o exclusión de
sospechosos o víctimas. A continuación, se presenta información (una breve explicación
y fundamento) esencial de algunas de las técnicas que se utilizan para determinar el
origen de la sangre.

4.- TÉCNICAS DE ORIGEN

Son técnicas que nos permiten llevar un conjunto de procedimientos cuyo

objetivo es obtener un resultado determinado y efectivo. Entre las técnicas de
origen pueden encontrarse:

4.1.- INMUNOCROMATOGRAFÍA

La inmunocromatografía se basa en la migración de una muestra a

través de una membrana de nitrocelulosa. La muestra es añadida en la zona
del conjugado, el cual está formado por un anticuerpo específico contra uno de
los epítopos del antígeno a detectar y un reactivo de detección. Si la muestra
contiene el antígeno problema, éste se unirá al conjugado formando un
complejo inmune y migrará a través de la membrana de nitrocelulosa. Si no,
migrarán el conjugado y la muestra sin unirse.

La zona de captura está formada por un segundo anticuerpo específico

contra otro epítopo del antígeno. Al llegar la muestra a esta zona, los complejos
formados por la unión del antígeno y conjugado quedarán retenidos y la línea
se coloreará en este caso como rosa o azul (muestras positivas). En el caso
contrario las muestras son negativas.

La zona control está formada por un tercer anticuerpo que reconoce al

reactivo de detección. Cuando el resto de muestra alcanza esta zona, el
anticuerpo se unirá al conjugado libre que no ha quedado retenido en la zona
de captura. Esta línea es un control de que el ensayo ha funcionado bien,
porque se colorea siempre, con muestras positivas y negativas.

4.2.- REACCIÓN DE LAS PRECIPITINAS

La técnica de elección para determinar si una mancha de sangre es de

origen humano, es la Reacción de las precipitinas descubierta en 1900 por
Uhlenhuth.
 Las moléculas del anticuerpo (inmunoglobulina) reaccionan con el
antígeno (proteína soluble) para formar un precipitado fácilmente visible bajo
condiciones de luz apropiadas y a las concentraciones equivalentes de
antígeno y anticuerpo.

Esta reacción antígeno-anticuerpo está influida por varias fuerzas,

interactuando entre los factores reaccionantes como son: las fuerzas de Van
der Walls, puentes de hidrógeno, interacciones de dipolos, atracción entre los
antígenos no polares y la superficie del anticuerpo, y la atracción electrostática.
La reacción misma tiene lugar en varias etapas. Inicialmente se forma un
complejo antígeno anticuerpo soluble; conforme la reacción prosigue, ese
complejo empieza a unirse y forma una tupida red compuesta de moléculas de
anticuerpo bivalente y moléculas de antígeno polivalente. Esta formación crece
rápidamente formando partículas del tamaño suficiente como para ser
insolubles y formar un precipitado visible.

Debe tenerse en mente que para que la reacción se lleve a cabo se requiere
que la concentración del antígeno y del anticuerpo sean equivalentes; un
exceso de alguno de los dos producirá un resultado negativo.

4.3.- INMUNOELECTROFORESIS

Es un examen de laboratorio que mide las proteínas llamadas

inmunoglobulinas en la sangre. Las inmunoglobulinas son proteínas que
funcionan como anticuerpos, que combaten la infección. Existen muchos tipos
de inmunoglobulinas que combaten diferentes tipos de infecciones.

Esta técnica inmunoquímica se basa en las reacciones que se efectúan entre

un antígeno que emigra anódicamente y un anticuerpo que emigra hacia el
cátodo 20 durante una electroforesis. Sobre una placa de agarosa, se hacen
horadaciones en pares; el antígeno (seroalbúminas y alfa y beta globulinas) se
coloca en una de ellas y el anticuerpo (gamma globulinas) en la otra; una vez
terminada la electroforesis aparecen bandas visibles de precipitación entre las
perforaciones pares de los materiales proteínicos específicos.

La inmunoelectroforesis es una técnica que se realiza en dos fases. Primero se

separa la mezcla de Ags por electroforesis y posteriormente el antígeno que se
desea detectar se hace reaccionar con un anticuerpo específico colocado en un
pocillo lateral. Por difusión llegan a encontrarse los antígenos y el antisuero,
apareciendo el complejo Ag-Ac visible en forma de líneas de precipitación que
pueden ser estudiadas por comparación con un sistema estándar.
La técnica electroforética, tiene la ventaja de acelerar la difusión sobre el gel y
por lo tanto disminuye el tiempo de reacción además de ser más sensible que
las otras técnicas, pero requiere de un equipo más costoso.

5.- DETERMINACIÓN DEL GRUPO SANGUÍNEO EN SANGRE SECA

Hay diversos tipos de técnicas forenses de laboratorio, en especial las que se
refieren al tejido hemático y con el fin de evaluar estas técnicas y determinar la
capacidad de los procedimientos para alcanzar un resultado confiable.

Al determinar el grupo sanguíneo en sangre seca es necesario tener en cuenta

que las células que alguna vez estuvieron presentes en la sangre, ya no lo
están, es por eso que es necesario contar con una técnica capaz de reaccionar
con el sistema ABO de la sangre seca

Los ensayos antígenos-anticuerpo son la base para la formación de métodos

empleados en la detección de antígenos en el estroma de glóbulos rojos de la
mancha seca de sangre. Una técnica fácil que consiste en poner en evidencia
la presencia de antígenos mediante aglutinación con antisueros específicos en
manchas de sangre seca en estas muestras las células se encuentran rotas,
sin embargo los antígenos del sistema ABO no se desnaturalizan tan
rápidamente por lo que sobreviven y conservan la capacidad de combinación
de anticuerpos específicos, la formación de estos an-ac es la base de todos los
métodos empleados en la detección.

La técnica que se utiliza hoy en día para la determinación del grupo sanguíneo
en sangre seca es la de absorción-elusión que ha demostrado ser carácter
científico y confiable en comparación con otras técnicas. Esta técnica como su
nombre lo indica cuenta con dos procesos, la mancha problema y el anticuerpo
homologo, después de efectuar esto, el excedente de anticuerpo se elimina por
medio de un lavado con solución salina fría. En donde la absorción es completa
y el excedente anticuerpo se elimina por medio de solución salina. Luego el
complejo antígeno se disocia a 56°c y el anticuerpo eluido se conecta con los
eritrocitos antígenos. A lo que da como resultado la aglutinación que es la
presencia de un testigo antígeno de la misma especificidad. Este técnica puede
ser muy útil para la identificación del grupo ABO y Rh aun que se requiere de
mayores muestras igual empleada junto con la técnica absorción- inhibición
para la determinación del grupo en sangre, saliva y orina ,se puede usar en el
sistema MN , finalmente la aglutinación indica la presencia de antígeno de la
misma especificación , para ser más concreto lo primero de estos es la
absorción en el que la mancha de sangre seca se pone en contacto con su
antígeno correspondiente, una vez absorbido se eliminan los excesos con
solución salina y se procede a calentarse, se agregan glóbulos rojos y se
centrífuga, si se aglutina se dice que el antígeno utilizado es el mismo que está
presente en la mancha de sangre seca.

6.- TÉCNICA DE BIOLOGÍA MOLECULAR

El presente trabajo aborda lo referente a las técnicas genéticas moleculares,
tópico que en la actualidad reviste gran importancia debido tanto al gran
avance científico como tecnológico en el mundo, el cual ha permitido avanzar
a la ciencia en el  diagnóstico, prevención, control  y curación de
las enfermedades.

Los seres humanos están individualizados genéticamente a lo que hoy día se le

conoce como ADN. Esto pasa a través de los padres. Hoy se le puede llamar
cómo una huella digital del ADN. Todas las células que conforma el ser
humano es gracias a la fertilización, ya que esta produce una célula llamado
cigoto gracias a la unión del ovulo y espermatozoide, que en este está
constituido en su núcleo 23 pares de cromosomas homólogos, 22 cromosomas
autónomas y un par de cromosomas sexuales. Obteniendo el material genético
de 46 cromosomas en el núcleo celular y del ADN.

Un cromosoma está constituido por una molécula de ADN de ácido

desoxirribonucleico con 100, 000 genes en promedio. Y el ADN está formado
por cadenas de hélices que contiene adenina, citosina, guanina y timina; la cual
están unidas por un puente de hidrógeno. El ADN tiene fragmentos de
cromosomas que se codifican con proteínas convirtiéndose así en genes en
donde interviene en las funciones y estructuras de las células de los seres
humanos.

Una de las técnicas utilizadas para la identificación de una persona es por

medio del material genético, que es transmitido de los dos padres al hijo a
través de sus células sexuales, y el ADN mitocondrial, el cual solo es
transmitido al hijo por la madre. Primero se extrae el material genético del
soporte dónde se encuentre, se procede a cualificar y a cuantificar a través de
electroforesis horizontal, la cual puede ser a través de un gel de agarosa o por
la espectroscopía de luz ultravioleta, se lleva a cabo la reacción en cadena de
la polimerasa, luego es sometido a cierto grado de temperatura para asegurar
la unión de las cadenas de ADN, por último se elabora un gel de agarosa y se
determinará el genotipo de cada muestra

Los marcadores genéticos se emplean de acuerdo a su naturaleza polimórfica

Los genes son fragmentos de ADN de los cromosomas que codifican a las
proteínas las cuales intervienen inteligentemente en las funciones y
estructuras, del conjunto de células de ser humano aproximadamente entre 50
y 100 diferente y se localizan en el locus-de los cromosomas en formas
variables llamadas alelos, que difieren en l secuencia de nucleótidos del ADN.
Para el gen x puede existir en la población variantes en su alelos, y cada
individuo puede tener solo dos de estos alelos (x1, x2, x3, x4). Si un individuo
posee dos copias idénticas de un alelo es homocigoto, en ese locus y si los
tienen diferente es hereditario, la identificación, se basa en la caracterización
de variables polimórficas del material del individuo.

Para el medio forense el utilizar los alelos para identificación es una de las
técnicas más certeras que existen siguiendo una metodología específica cuya
finalidad es la exclusión de algún alelo por lo que es importante conocer la
distribución de estos.