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 ESPECTROFOTOMETRÍA Y MANEJO DEL
 ESPECTROFOTÓMETRO
 2DO LABORATORIO DE CINÉTICA Y BIOQUÍMICA






 Integrantes:

 Altamirano Quintanilla Jossel


 Justano Laime Naomi
 Ñacari Quispe Sebastián
 Torres Jara Sergio Manuel

Profesor:
Pedro Ramos / César Sebastián
LABORATORIO N°1 DE CINETICA BIOQUÍMICA UNIVESIDD NACIONAL DE INGENIERÍ
LABORATORIO N°1 DE CINETICA BIOQUÍMICA UNIVESIDAD NACIONAL DE INGENIERÍA
LABORATORIO N°1 DE CINETICA BIOQUÍMICA UNIVESIDAD NACIONAL DE INGENIERÍA

INDICE:

1. Introducción……………………………………………………………….. pág. 2

2. Resumen………………………………………………………………………pág.2

3. Objetivos………………………………………………………………………pág. 3

4. Marco Teórico………………………………………………………………pág.3

5. Resultados……………………………………………………………………pág. 7

6. Discusión………………………………………………………………………pág. 8

7. Conclusiones…………………………………………………………………pág. 9

8. Recomendaciones…………………………………………………………pág. 9

9. Cuestionario………………………………………………………………….pág. 10

10. Fuentes de información…………………………………………………pág. 14

11. Anexos…………………………………………………………………………..pág. 15

12. Apéndice:

Flujograma…………………………………………………………………….pág. 18

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LABORATORIO N°1 DE CINETICA BIOQUÍMICA UNIVESIDAD NACIONAL DE INGENIERÍA

1. INTRODUCCIÓN

Ante la necesidad de análisis de distintas muestras problema que se presentan en la


vida cotidiana, se desprendieron distintos parámetros para el análisis de estos entre
ellos la concentración. A medida que se dio el avance de las tecnologías se dio un
método sencillo y práctico para el cálculo de este, la espectrofotometría. La
espectrofotometría es una técnica que mide la interacción de moléculas con la
radiación electromagnética. La luz que se encuentra en la luz visible y la luz ultravioleta
de los espectros electromagnéticos presenta una energía de 150- 400 kJ/mol.
La energía de la luz es usada para promover electrones de un estado de excitación a
otro. Un espectro es obtenido cuando la absorción de luz es medida en función de una
frecuencia o longitud.
La espectrofotometría de absorción es usualmente usada con moléculas disueltas en
un solvente transparente. La absorbancia de un soluto depende linealmente de la
concentración y por consiguiente la espectrofotometría de absorción es ideal para
hacer mediciones cuantitativas.
La longitud de absorción y la fuerza de absorbancia de una molécula no sólo depende
de la naturaleza química, si no del ambiente molecular en donde se encuentre.
2. RESUMEN

En esta experiencia se usó el espectrofotómetro para determinar el espectro de


absorción del colorante E-142(verde), el cual se obtuvo usando la solución de mayor
concentración y observando la gráfica absorbancia vs longitud de onda propia del
espectrofotómetro. Este espectro de absorción mostro un pico bastante definido con
una absorbancia máxima para una longitud de onda de 248nm. También hallamos el
coeficiente de absortividad molar a través de una regresión lineal de la absorbancia vs
concentración y se obtuvo un valor de k=5.4. Finalmente determinamos la
concentración de una muestra problema con un valor de absorbancia conocido. Este
experimento nos muestra una forma práctica de conocer concentraciones
desconocidas de una manera más sencilla y rápida. Esta práctica de laboratorio
también nos sirve para conocer la importancia del análisis de los productos, ya que es
importante cuidar la salud de los consumidores, evitar desperdicios de productos y
proveer de productos de buena calidad.

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LABORATORIO N°1 DE CINETICA BIOQUÍMICA UNIVESIDAD NACIONAL DE INGENIERÍA

3. OBJETIVOS
3.1. Objetivos General
➢ Conocer algunos métodos de determinación colorimétrica y
espectrofotométrica para el cálculo de la concentración de proteínas.

3.2. Objetivos específicos


➢ Obtener el espectro de absorción del colorante E123.
➢ Determinar el coeficiente de absortividad molar K del colorante E123.
➢ Representar gráficamente el espectro de absorción del colorante
(absorbancia frente a longitud de onda)
➢ Determinar la concentración de una muestra problema.

4. MARCO TEÓRICO
Las biomoléculas requieren de técnicas que permitan su identificación cualitativa y
cuantitativa. También se necesita caracterizarlos físico-química y biológicamente. El
método de análisis óptico más usado en las investigaciones bioquímicas es la
espectrofotometría, debido a que es un método sencillo y útil.
Un espectrofotómetro es un instrumento que tiene la capacidad de manejar un haz de
Radiación Electromagnética (REM), comúnmente denominado Luz, separándolo en
facilitar la identificación, calificación y cuantificación de su energía. Su eficiencia,
resolución, sensibilidad y rango espectral, dependerán de las variables de diseño y de
la selección de los componentes ópticos que lo conforman.
En la región visible apreciamos el color visible de una solución y que corresponde a la
a las longitudes de onda de la luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe
es el complementario del color que transmite.
El color de las sustancias se debe a que estas absorben ciertas longitudes de onda de
la luz blanca que incide sobre ellas, y sólo vemos aquellas longitudes de onda que no
fueron absorbidas. (Juanto, 2005)
Componentes de un espectrofotómetro
Una fuente de energia radiante: lampara de deuterio y tungsteno.
Un monocromador para la selección de radiaciones de una determinada longitud de
onda: filtros, prismas, redes de difracción.
Un compartimiento donde se aloja un recipiente transparente( cubetas o tubos) que
contenga la muestra. Puede ser de vidrio, cuarzo o plastico transparente. Para medir
en UV se deben usar las de cuarzo o silice fundido, porque el vidrio no transmite la
radiacion UV.
Un deflector de luz y un amplificador convertidor de señales luminosas en señales
eléctricas.
Un registrador o sistema de lectura de datos.

Colorantes
El colorante verde empleado en la experiencia corresponde al verde s con el codigo
E-142. Los colorantes usados son colorantes alimenticios que deben cumplir con
ciertos parametros de concentracion y se puede determinar la presencia de colorantes
no permitidos mediante el uso del espectrofotometro. La presencia de colorantes no
permitidos genera problemas a los consumidores y perdidas economicas a la industria
debido al rechazo de lotes de productos e incluso sanciones de parte de agencias
gubernamentales. Por ello se debe ser cuidadoso en el analisis de los colorantes
durante todo el proceso.
Hay muchos factores que pueden hacer que los colorantes de alimentos cambien de
color. Si se exponen al oxígeno o la luz durante mucho tiempo, o si se mezclan
accidentalmente con otros colorantes, incluso pequeñas desviaciones en la tonalidad

del colorante pueden provocar grandes cambios en el color de los productos finales
(Konica Minolta, 2017)

Transmitancia y absorbancia
Cada sustancia tiene su propio espectro de absorción, el cual es una curva que
muestra la cantidad de energía radiante absorbida, Absorbancia, por la sustancia en
cada longitud de onda del espectro electromagnético, es decir, a una determinada
longitud de onda de la energía radiante, cada sustancia absorbe una cantidad de
radiación que es distinta a la que absorbe otro compuesto.(Fundamentos de
espectrofotometria,2017)

Transmitancia (T) : Es la razón entre la luz monocromática transmitida (P) por una
muestra y la energía o luz incidente (Po) sobre ella. Tanto la energía radiante
incidente como la transmitida deben ser medidas a la misma longitud de onda.
Se acostumbra a considerar la transmitida como la razón de la luz transmitida por la
muestra y la luz transmitida por un estándar arbitrario. Este estándar puede ser el
liquido (solvente) en que esta disuelta la muestra, aire, blanco analítico (solución que
contiene todos los componentes de la solución problema menos la sustancia
problema) u otra sustancia elegida arbitrariamente. Debido a que la transmitancia de
este estándar no es necesariamente 100%, es necesario especificar el estándar con
el cual la muestra es comparada.
Absorbancia(A) : Se define como la cantidad de energía radiante absorbida por una
sustancia pura o en solución. Matemáticamente, corresponde al logaritmo negativo de
la transmitancia.T, transmitancia expresada como fracción decimal %T, transmitancia
expresada como porcentaje.
A = - log T = 2 – log %T
Pero.

Luego

A = abc
Esta ecuación indica que la absorbancia es una función lineal de la concentración,
donde a es una constante de proporcionalidad llamada absortividad. La magnitud de a
depende de las unidades de b y c. Si la concentración c está expresada en moles por
litro y la longitud de la cubeta b en centímetros, la constante a recibe el nombre de
absortividad molar( ξ ) .
A= ξbc

Ley Lambert-Beer
1.- Ley de Lambert. :
Esta ley establece que cuando pasa luz monocromática por un medio homogéneo, la
disminución de la intensidad del haz de luz incidente es proporcional al espesor del
medio, lo que equivale a decir que la intensidad de la luz transmitida diminuye
exponencialmente al aumentar aritméticamente el espesor del medio absorbente:

La siguiente relación matemática da cuenta de esta ley:


Po : Intensidad de la luz incidente P : Intensidad de la luz transmitida
b : Espesor del medio absorbente k : Constante, cuyo valor depende de la
naturaleza del soluto, de la longitud de onda de la luz incidente, del espesor del
medio absorbente y de la naturaleza del medio.
2.- Ley de Beer :
La intensidad de un haz de luz monocromática disminuye exponencialmente al
aumentar aritméticamente la concentración de la sustancia absorbente, cuando este
haz pasa a través de un medio homogéneo.

La relación matemática que da cuenta de esta ley se muestra a continuación:

Dónde: :
Po: Intensidad de la luz incidente
P:Intensidad de la luz transmitida
c: Concentración de la solución
k : Constante, cuyo valor depende de la naturaleza del soluto, de la longitud de onda
de la luz incidente, de la concentración de la solución, y frecuentemente, de la
naturaleza del medio.
Ambas leyes se combinan en una sola, generando la Ley de Lambert-Beer
log P0 / P = a b c ó A = a b c
A = log P0 / P = - log T
Dónde:
a : Absortividad b : Longitud o espesor del medio (longitud de la cubeta)
c : Concentración de la solución P/Po= T : Transmitancia
Curva de Calibración
Para realizar la curva de calibracon primero se analiza una muestra en la cual la
absorbancia es maxima y recibe la la denominacion de Lamda maximo (λ max).
Uno de los métodos más utilizados para determinar la concentración de una muestra
problema, es el método de la curva de calibración. Esta curva de calibración es una
gráfica que relaciona la concentración de al menos cinco soluciones de estándar de
concentraciones conocidas, con la absorbancia de cada uno de ellos a la longitud de
onda máxima. (λ max).

De la grafica podemos determinar la funcion matematica:


A=mc+n
A: Absorbancia.

n: Intercepto de la recta
m: Pendiente de la recta y que corresponde al producto entre absortividad A de la
muestra y el espesor b de la cubeta.
Al hacer la curva de calibración, se debe emplear la longitud de onda de máxima
absorbancia (λ max.), para obtener una recta con la máxima pendiente y así tener
mayor sensibilidad y precisión al hacer las mediciones
LABORATORIO N°1 DE CINETICA B5.UNIVESIDAD NACIONAL DE INGENI
5. Datos y cálculos:

Representar gráficamente el espectro de absorción del colorante (absorbancia frente a


longitud de onda)

Graf: Espectro de absorción del colorante

Representar la absorbancia en el máximo de las Disoluciones 1-4 frente a la molaridad y


ajustar los 4 puntos a una recta por el método de mínimos cuadrados
PM=576.62
Tubo Nº 1 2 3 p
Colorante 1 ml 2ml 3 ml 5ml
Agua
destilada 50 ml 50 ml 50 ml 50 ml
Absorbancia 0.285 0.291 0.339 0.470
Grafica. Concentración- Absorbancia
Determinación de la concentración de la muestra problema
Datos de la muestra problema:
Absorbancia= 0.47
Con la ecuación obtenida en la gráfica, hallaremos la concentración de la muestra
problema:
y=5.4 x + 0251
0.47=5.4 x + 0251
X=0.040 M
Concentración calculada con la ecuación obtenida = 0.040M
El coeficiente de absortividad molar k del colorante E-123 a la longitud de onda escogida.
El coeficiente de absortividad es el valor de la pendiente de la ecuación hallada igual
K= 5.4
6. RESULTADOS

 Para determinar el espectro de absorción se usó el verde con una concentración


estándar de 100mg/ml.
 En las 4 muestras, la longitud de onda donde se halla la máxima absorbancia es de
428 nm.
 La mayor absorbancia observada fue de 0.42.
 El coeficiente de absortividad hallado es 5.4
 La concentración de la muestra problema es de 0.040 M.
 Se obtuvo una ecuación lineal entre la absorbancia y la capacitancia, con R igual a
0.8322.
 El espectro de absorción hallado posee un notable pico. INETICA BIOQUÍMICA
UNIVESIDAD NACIONAL DE INGENIERÍA

7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

- La absorbancia es directamente proporcional a la concentración, por tanto,


siempre que la concentración de colorante se aumente, la absorbancia
aumenta también.
- La mayor absorbancia se dio en la muestra 1, ya que esta estaba más
concentrada en comparación con las otras.
- La pendiente de la ecuación hallada representa el coeficiente de
absortividad.
- El experimento tenía que realizarse con mucha precisión en cuanto a las
muestras ya que cualquier error hacia que lo volviéramos a repetir.
- En la gráfica obtenida en el espectrofotómetro, la longitud y la absorbancia
son proporcionales hasta alcanzar el punto máximo y de allí empieza a
descender.
- Se obtuvo un bajo r debido a la manipulación del material o error en el
aparato.

8. CONCLUSIONES
➢ La pendiente de la relación entre concentración y absorbancia siempre será
positiva.

➢ La ley de Beer-Lambert para hallar el coeficiente de absorbancia relaciona


la intensidad de luz entrante en un medio con la intensidad saliente
después de que en dicho medio se produzca absorción, con el valor hallado
vemos que la intensidad saliente es más de 5 veces la intensidad entrante.
➢ Variando la cantidad de agua destilada se puede disminuir la absorbancia.
➢ El espectrómetro es muy útil para medir concentraciones de sustancias
desconocidas, que ayudarían a solucionar diversos problemas de impacto
ambiental.

9. RECOMENDACIONES

Para complementar nuestra experiencia se puede experimentar desnaturalizando


proteínas mediante la variación del PH o la temperatura y compararlo compararlos
con nuestros resultados obtenidos.

Se puede hacer el experimento en una solución acida (HCl), básica (NaOH) o una
solución buffer para poder determinar las condiciones óptimas para las enzimas
estudiadas también podemos determinar el PH en el cual esta enzima empieza a
desnaturalizarse ya que esta también es una proteina. También puede hacerse el
experimento variando las condiciones de temperatura y con esto podríamos
determinar las condiciones óptimas para las enzimas y el rango de temperatura en
el cual la enzima se desnaturaliza.
9. CUESTIONARIO:

¿Por qué, en el caso concreto del colorante considerado, no era necesario usar un tampón de
pH, sino que se realizaron las medidas en agua destilada sin tampón? Recurrir a datos de la
literatura para contestar a esta pregunta.

Para la determinación de la concentración de proteínas por lo general se usan colorantes


capaces de teñir proteínas como es el caso del comassie blue. ¿explique su mecanismo de
acción molecular? ¿Qué aplicaciones prácticas tiene este colorante?

La absortividad molar de una solución del complejo formado por Bi(III) y tiourea es 9,32x103
L/mol x cm a 470 nm. ¿Cuál es la absorbancia de una solución 3,79x10-5M de este complejo
si se mide a 470 nm en una celda de 1 cm?

La tabla corresponde a Absorbancia de soluciones estándares de la sustancia x ¿Se cumple


la Ley de Lambert Beer en este intervalo de concentraciones? Si no fuera así, ¿cuál es el
límite superior de concentración del rango lineal? Determinar la concentración de X cuya Abs
es 0,116 medida en las mismas condiciones experimentales.

Una solución de clorofila en etanol cuya concentración es de 0,08 mg/mL tiene una Abs de 0,8
y una solución de clorofila de concentración desconocida tiene una Abs de 0,120. Diga: a)
¿Qué coloca en el tubo blanco? b) ¿Cuántos mg de clorofila hay en un mL de la solución
problema? c) ¿Cuántos mg en un L?

Una solución de glucosa de concentración desconocida dio, por el método de la O-toluidina,


una Abs=0,45 (Testigo/estándar de concentración 1 g/L, Abs=0,55; Blanco, Abs=0,05). Si de
dicha solución se desea obtener 40 mg de glucosa, ¿qué volumen de solución se debe
pipetear?

SOLUCIONARIO:
9.1. No fue necesario la utilización de un tampón, debido a que se consideró el mismo
error en el proceso para todas las muestras; además de que la baja concentración
de cada muestra no causará una considerable variación del pH al ionizarse el
colorante con el agua.
9.2. A través de un medio ácido se genera entre las moléculas del tinte azul de
Coomassie y las proteínas gracias a los grupos amino una atracción de tipo Van
Der Walls, generando un complejo tinte-proteína reversible, dándole la coloración
azul del tinte. Originalmente se utilizó en la industria textil, pero actualmente se
emplea principalmente en bioquímica para teñir proteínas en geles de electroforesis,
por ejemplo del tipo SDS-PAGE, y en la estimación de concentraciones de proteína
empleando el método de Bradford. Ambas aplicaciones se basan en la capacidad de
este colorante para unirse a todo tipo de proteínas.
9.3. De los datos dados:
K=9.32x103 L/mol.cm (λ=470nm)
[B]=3.79x10-5M
L=1cm
De la ley de Lambert Beer:

Reemplazando los datos en la ecuación:

9.4. Llevando los datos a una gráfica Concentración vs Absorbancia:

Se nota de la gráfica que se cumple la Ley de Lambert Beer para los 4 primeros datos.
El límite superior de la recta graficada se da en la coordenada (0.00312; 0.495).
Calculando la concentración pedida reemplazando en la ecuación:

Reemplazando el valor pedido de A=0.116:

9.5. Calculando la concentración de la muestra desconocida:

Entonces en 1mL de muestra desconocida’:


En 1L de muestra desconocida:

10. FUENTES DE INFORMACIÓN:

 Juanto, S. (2005). Espectrofotómetro. La Plata: Universidad Tecologica Nacional.


 Konica Minolta. (19 de 10 de 2017). Obtenido de Sensing Americas:
http://sensing.konicaminolta.com.mx/2013/10/identificando-colorantes-alimenticios-
con-espectrofotometros/

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10. Anexos:

Fig 1. Espectrofotometro de la FIA

Fig 2. Muestra la máxima longitud de onda hallada.


Fig 3. Curva donde se ve la máxima longitud de onda

Fig 4. Muestra madre, muestra problema (5), muestras

Fig 6. Bureta utilizada


 11.1. DIAGRAMA DE FLUJOS:

Preparación de 4 disoluciones patrón


de colorante E-123 a partir de una
disolución concentrada del colorante
(concentración 0,15 g/l de colorante
rojo E-123) que se proporciona ya
preparada. Calcular la molaridad de
cada disolución.

Luego se introduce una


cubeta con la disolución 4 (la
más concentrada) y se mide
la absorbancia en el intervalo
de longitudes de onda fijado
tomando valores cada 20 nm.

Establecer, a partir de
esta medida, dónde se
encuentra el máximo de
absorción del colorante.
Repetir la medida, a la misma
longitud de onda (máximo de
absorción del colorante) para
las disoluciones 3, 2, 1.
Representar gráficamente el
espectro de absorción del
colorante (absorbancia frente
a longitud de onda).
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