FOSFATASA ALCALINA I y II

Universidad de Antioquia
Facultad de ciencias farmacéuticas y alimentarias
Química farmacéutica - Tecnología en Regencia de Farmacia
Medellín
2022- 1
INTRODUCCIÓN

El estudio de las velocidades de reacción es de gran importancia en el análisis de las enzimas

y proteínas debido a que con esta información te pueden determinar el buen funcionamiento
de la síntesis que ocurren en el cuerpo, porque te darse una mayor activación, disminución o
falta de actividad en algunas enzimas puede ser determinante para la detección de alguna
enfermedad esto es de gran relevancia debido a que la síntesis hacen parte del mecanismo de
la vida ya que sin la síntesis que ocurren dentro del organismo la vida sería inviable.

Para este experimento se busca analizar la velocidad de reacción de la fosfatasa alcalina, así
como su reacción al adicionar un inhibidor, la fosfatasa alcalina la cual es una proteína que se
encuentra en todos los tejidos corporales. Los tejidos con cantidades más altas de la fosfatasa
alcalina abarcan el hígado, las vías biliares y los huesos.(1) La fosfatasa alcalina es una
enzima que cataliza la hidrólisis del enlace éster fosfórico entre un grupo orgánico y un grupo
fosforilo a pH alcalino, lo que libera fosfato al medio(Figura 1) (2).

La medida de niveles anormales de fosfatasa alcalina en el suero indica la existencia de

enfermedades óseas degenerativas (raquitismo, osteomalacia, hiperparatiroidismo secundario,
osteosarcoma) o bien daños hepáticos. El aumento fisiológico de los niveles plasmáticos de
fosfatasa alcalina se produce en animales en fase de crecimiento (se está formando tejido
óseo) o en hembras gestantes (fosfatasa alcalina de la placenta).(2)

Como sustrato de la fosfatasa alcalina utilizaremos un compuesto artificial:

p-Nitrofenil-fosfato que, al poseer un resto orgánico con un grupo fosfato unido, puede ser
reconocido por la enzima. El sustrato al ser hidrolizado origina un producto, el p-Nitrofenol,
compuesto coloreado que en solución alcalina absorbe a una longitud de onda de 405 nm, por
lo que su aparición en el transcurso de la reacción (Figura 1) (2) puede seguirse
colorimétricamente. Para detener la reacción se añadirá fosfato, ya que el exceso de este
producto de la reacción inhibe la actividad enzimática.(2)
RESULTADOS

Fosfatasa alcalina I:

Curva de calibración:

Volumen inicial: 2 mL
Volumen final: 4 mL
Concentración inicial: 0,5 M

Lectura:

Proporción Absorbancia
PNP

1:1 1,287

1:2 0,637

1:4 0,379

1:8 0,176

1:16 0,123

Fórmula modelo para encontrar la concentración (p-nitrofenol, PNP) según su dilución:

*Con este método se encontraron todas las concentraciones reemplazando la C1 por el
resultado C2 inmediatamente previo

𝐶1 * 𝑉1
𝐶1 * 𝑉1 = 𝐶2 * 𝑉2 – Despeje de C2 – 𝐶2 = 𝑉2

0,0001 * 2
𝐶2 = 4
= 0, 00005 𝑀𝑜𝑙𝑎r

Proporción Absorbancia Concentración PNP

1:1 1,287 0,0001

1:2 0,637 0,00005

1:4 0,379 0,000025

1:8 0,176 0,0000125

1:16 0,123 0,00000625

Ecuación de función lineal: y = 12416 x + 0,0393

Fosfatasa alcalina II:

Lectura NO INHIBIDOR:

Proporción PNPP Concentración Absorbancia

PNPP PNP

1:1 0,005 0,754

1:2 0,0025 0,898

1:4 0,00125 0,716

1:8 0,000625 0,573

1:16 0,0003125 0,386

Fórmula modelo para encontrar la concentración (p-nitrofenol, PNP) a partir de su

absorbancia, usando la ecuación de función lineal:

𝑦 (𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎) − 0,0393
𝑥 = 12416

0,898 − 0,0393
[𝑃𝑁𝑃] = 12416
= 6,91608x10^-5

Fórmula modelo para encontrar la velocidad inicial:

6,91608𝑥10^−05
𝑉0 = 15
= 4,6107 x 10^-6
 Concentración Absorbancia [PNP] Velocidad Inicial M/minutos
PNPP PNP

0,005 0,754 5,75628x10^-5 3,8375 x 10^-6

0,0025 0,898 6,91608x10^-5 4,6107 x 10^-6

0,00125 0,716 5,45023 x10^-5 3,6335 x10^-6

0,000625 0,573 4,29849 x10^-5 2,8657 x 10^-6

0,0003125 0,386 2,79236 x 10^-5 1,8616 x 10^-6

*No se ha tenido en cuenta la proporción 1:1 de la lectura con el objetivo de mejorar el
comportamiento lineal en la gráfica

Se invertirán los valores de velocidad inicial y concentración de producto, con el objetivo de

hallar el Km y velocidad máxima:
1/V0 1/[PNPP]

260584,86 200

216885,99 400

275217,97 800

348960,10 1600

537179,18 3200
*No se ha tenido en cuenta la proporción 1:1 de la lectura con el objetivo de mejorar el
comportamiento lineal en la gráfica

Cálculo de Km y Vmax (Sin inhibidor):

y = 112,36x + 176015

0 = 112,36x + 176015

−176015
𝑥 = 112,36
= -1566,53

−1
𝐾𝑚 = −1566,53
= 6,38 x 10^-4

y = 112,36(0) + 176015

y = 176015

1
𝑉𝑚𝑎𝑥 = 176015
= 5,681 x 10^-6
Lectura CON INHIBIDOR:
Proporción PNPP Concentración Absorbancia
PNPP PNP

1:1 0,005 0,644

1:2 0,0025 0,695

1:4 0,00125 0,503

1:8 0,000625 0,364

1:16 0,0003125 0,303

Después de usar las fórmulas modelo para hallar la concentración de PNP y velocidad:

Concentración Absorbancia [PNP] Velocidad Inicial

PNPP PNP M/minutos

0,005 0,644 4,8703x10^-5 3,2469 x 10^-6

0,0025 0,695 5,2811 x 10^-5 3,5207 x 10^-6

0,00125 0,503 3,7347 x 10^-5 2,4898 x 10^-6

0,000625 0,364 2,6158 x 10^-5 1,7434 x10^-6

0,0003125 0,303 2,1239 x 10^-5 1,4159 x 10^-6

*No se ha tenido en cuenta la proporción 1:1 de la lectura con el objetivo de mejorar el

comportamiento lineal en la gráfica
Después de usar las fórmulas modelo para hallar la concentración de 1/V0 y 1/[PNPP]:
1/V0 1/[PNPP]

307987,4318 200

284032,3319 400

401638,9907 800

573575,6083 1600

706257,1104 3200
*No se ha tenido en cuenta la proporción 1:1 de la lectura con el objetivo de mejorar el
comportamiento lineal en la gráfica

Cálculo de Km y Vmax (Con inhibidor):

y = 144,44x + 274720

0 = 144,44x + 274720

−274720
𝑥 = 144,44
= -1901,96

−1
𝐾𝑚 = −1901,96
= 5,26 x 10^-4

y = 144,44(0) + 274720

y = 274720
 1
𝑉𝑚𝑎𝑥 = 274720
= 3,64 x 10^-6

ANÁLISIS DE RESULTADOS

El mecanismo de la fosfatasa alcalina permite la hidrolización de fosfodiesteres, liberando un

fosfato inorgánico en el proceso. La enzima no es muy específica con su sustrato, por lo que
el sitio activo naturalmente acepta entre radicales de carácter fenólico o alquílico y dentro de
estos pueden ser un alcohol, fenol o alcohol cíclico. En este laboratorio en particular se
utilizará el sustrato PNPP (p-nitrofenilfosfato), el cual con el cofactor Zn2 + y agua catalítica
darán como productos PNP (p-nitrofenol) y ácido metafosfórico.

La práctica puede ser dividida en 2 partes principales: Construcción de la curva y reacción de

la asistida por la fosfatasa alcalina (con y sin inhibidor)

Construcción de la curva (PNP):

Con el objetivo de obtener la concentración de los productos (PNP) en el momento de la

reacción asistida por la enzima, primero se necesitará obtener una curva de calibración en la
cual se logrará cuantificar la cantidad de producto producida en la reacción. Para este primer
paso se necesita partir de cantidades conocidas y similares a la que serán usadas en la
reacción.

Desde una concentración de 0,5 Molar y diluciones que van a la mitad de la previa solución,
se obtuvo una función lineal de y = 12416 x + 0,0393 con un R cuadrado de 0,998, por lo que
se obtuvo un comportamiento lineal estipulada por la ley de beer. Se procuró usar
concentraciones bajas para evitar interferencias. A su vez se utilizó este rango de lecturas
debido a que las concentraciones del producto en la reacción esperada estarán dentro de la
curva.

A partir de la fórmula obtenida se espera determinar con buena aproximación la

concentración del producto PNP en la segunda parte de la práctica, y así obtener de la
velocidad inicial, velocidad máxima y Km de la enzima.

Reacción de la enzima (Sin inhibidor):

La velocidad inicial de la reacción y la concentración deben de actuar en una forma lineal

hasta que se encuentra con una velocidad máxima, en donde todas las enzimas son saturadas
y alcanzan una velocidad máxima, en este punto la gráfica se comporta parecido a una
función logarítmica. En nuestro caso con las concentraciones de PNP se obtuvieron gracias a
la función lineal previamente mencionada, después se obtuvieron las velocidades iniciales
teniendo en cuenta los 15 minutos de reacción simultánea (a 37 grados centígrados). Después
se graficaron la velocidad y la concentración del reactivo para obtener la gráfica y así
determinar la velocidad máxima y Km del sustrato de forma visual.
La similitud con la función logarítmica se evidenció con el gráfico obtenido, en donde se
obtuvo un comportamiento como el establecido teóricamente, por lo que se puede afirmar que
se llegó a una saturación de enzimas y por lo tanto a velocidad máxima. Se obtiene un R de
0,9975 en esta gráfica.

Posteriormente se invirtieron las velocidades iniciales y concentración del reactivo con el

objetivo de obtener una gráfica de Michaelis-Menten, así se conocerán las Km y Vmax al
tener intercepciones en los ejes X(Km) y Y(Vmax). Se obtuvieron los valores de:

Km = 6,38 x 10^-4

Vmax = 5,681 x 10^-6

Estos valores son cercanos a los reportados teóricamente ( Km de 8.0 x 10^-4 M (3) y Vmax
de 20 x 10-6 M/min (4) ) por otros artículos que también describen la naturaleza de la
enzima.

Reacción de la enzima (Con inhibidor):

Para esta reacción se presenta un Km y una velocidad máxima más baja que en la reacción
enzimática sin inhibidor, pues presenta un Km de 5,26 x 10^-4 y una velocidad máxima de
3,64 x 10^-6 lo cual era de esperarse, pues el inhibidor entra a competir con PNPP
generando un cambio en la cinética enzimática, pues este altera la afinidad que posea la
enzima frente al sustrato sea aumentandola o disminuyendola y la velocidad máxima en la
cual la enzima alcanza su saturación, para este caso no se puede asegurar qué tipo de
inhibición realiza el fosfato de sodio, pues a pesar de haber un cambio en el km y en la
velocidad máxima, no se mantiene ninguna de las dos variables, pues en inhibición
competitiva la velocidad máxima se mantiene pero el Km aumenta, en la inhibición no
competitiva la velocidad máxima aumenta y el km permanece igual que sin el inhibidor y en
la inhibición mixta el Km aumenta y la velocidad máxima disminuye, sin embargo al
contrastar con la literatura(5) en concentraciones no diluidas del sustrato el fosfato sódico
realiza una inhibición competitiva, este contraste se puede deber a que al momento de dejar
actuar la enzima sin inhibidor por los 15 minutos en cada tubo de ensayo se cometio un error
experimental en la reaccion de la enzima, pues a partir del tubo 3 se dejo actuar 1 minuto
menos al momento de parar la reaccion y en la reaccion con inhibicion esto no ocurrio ,
resultando esto en una alteracion a la hora de hacer los calculos, pues lo esperado era un
aumento del Km en la enzima con inhibicion puesto que el fosfato de sodio compite por el
sitio activo y disminuye la afinidad que posea el sustrato por la enzima, y su velocidad se
debio mantener pues se mantuvo condiciones de concentracion igual que en la reaccion sin
inhibicion.

CONCLUSIONES.

● El estudio y la medición de la fosfatasa alcalina juega un papel fundamental en el

estudio clínico, pues sus niveles altos o bajos son marcadores de enfermedad
hepáticas y en los huesos, así como el estudio de las velocidades de reacción los
cuales dan unos claros indicios de posibles enfermedades y problemas con las
enzimas de el organismo
 ● Los diferentes errores experimentales obtenidos durante la práctica inciden de manera
significativa en los calculos y analisis de estos, pues un mal manejo o una mala
ejecucion del tiempo de acción en cuanto a las reacciones realizadas por enzimas
generan un cambio en los parámetros que se van a estudiar, en este caso el Km y la
velocidad máxima, pues estos dependen del tiempo de reacción.

PREGUNTAS.

● ¿Cuál es la importancia clínica de la fosfatasa alcalina?

R/= La fosfatasa alcalina es una enzima presente en las membranas celulares de diferentes
tejidos principalmente en hígado, huesos, riñones, aparato digestivo, cumpliendo como
función la precipitación del fosfato cálcico en los huesos, la absorción de fosfato en el
intestino y la síntesis de proteína hística e hidrólisis de los ésteres fosfóricos del riñón y el
hígado(6), es por esto que es importante su medición, pues es un importante marcador de
enfermedades en los diferentes tejidos que se encuentra, pues el aumento de esta nos lleva
indicar daño hepático o enfermedades en los huesos, pues al estar presente en estos y poseer
altos niveles puede filtrarse al torrente sanguíneo. (7)

● En este caso, ¿se puede considerar el fosfato como un inhibidor por producto?

R/= Si es posible considerar al fosfato como un inhibidor por producto mediante la inhibición
por retroalimentación(8), de esta forma al haberse generado mucho producto en este caso
p-nitrofenol y fosfato, la fosfatasa alcalina será inhibida por el mismo fosfato para evitar la
formación del producto nuevo hasta usar el que ya existe.(2)

● ¿Sería posible revertir la inhibición provocada por el fosfato aumentando la

concentración de PNPP?

R/= Si es posible, esto debido a que es una inhibición competitiva por lo tanto reversible, en
este caso no es posible que el sustrato o el inhibidor se unan al mismo tiempo a la enzima, el
que se encuentre en mayor concentración será el que más probabilidades tenga de unirse al
sitio activo. Por lo tanto, si se aumenta la concentración de PNPP habrá mayores
probabilidades de que este se adhiera al sitio activo dejando por fuera al fosfato. (9)
REFERENCIAS

(1)Examen de sangre para fosfatasa alcalina: MedlinePlus enciclopedia médica [Internet].

[citado el 22 de junio de 2022]. Disponible en:
https://medlineplus.gov/spanish/ency/article/003470.htm
(2)Ruiz JAB, Alfonso CG, Peña CAP, Galisteo EM, Dapena JD. 30. Caracterización cinética
de la fosfatasa alcalina. :13.
(3)Yeh MF, Trela JM. Purification and characterization of a repressible alkaline phosphatase
from Thermus aquaticus. Journal of Biological Chemistry. mayo de 1976;251(10):3134–9.
(4)Njoku, V, Chikezie, P., Kaoje, A. M. Kinetic studies of alkaline phosphatase extracted
from rabbit (Lepus townsendii) liver [citado el 22 de junio de 2022] Disponible en:
https://academicjournals.org/AJB
(5)Coburn SP, Mahuren JD, Jain M, Zubovic Y, Wortsman J. Alkaline phosphatase (EC
3.1.3.1) in serum is inhibited by physiological concentrations of inorganic phosphate. J Clin
Endocrinol Metab. noviembre de 1998;83(11):3951–7.
(6)Determinación cuantitativa de fosfatasa alcalina (FAL) [citado el 22 de junio de 2022].
Disponible en: https://www.spinreact.com.mx/public/_pdf/41242.pdf
(7)Sánchez Rodríguez J, Soriano Suárez E, Girona Bastús R, Pérez Muñoz P, Viñets Gelada
C. ¿Por qué aumentan las fosfatasas alcalinas? Aten Primaria. el 15 de marzo de
2002;29(4):241–5.
(8)Regulación enzimática (artículo) | Khan Academy [Internet]. [citado el 22 de junio de
2022]. Disponible en: https://es.khanacademy.org/_render
(9)Inhibidor enzimático – Eugenomic [Internet]. [citado el 22 de junio de 2022]. Disponible
en: https://eugenomic.com/recursos/glosario/inhibidor/