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Informe #1: Investigacin diseada de Respiracin celular

Abstracto:
La respiracin celular es un proceso catablico, exergnico y espontaneo en donde la
descomposicin de glucosa y oxgeno libera energa en forma de ATP (Adenosina trifosfato). La
respiracin celular se lleva a cabo en tres pasos distintos, primero por la gluclisis, segundo el
ciclo de cido ctrico y por ltimo, la fosforilacin oxidativa. En este experimento se le dio
nfasis al paso del ciclo del cido ctrico para medir el cambio de respiracin celular por medio
del DPIP, un aceptador de electrones. Se prepararon cuatro celdas con sustancias especficas
en donde se utiliz un espectrofotmetro para medir el por ciento de transmitancia de ellas en un
periodo de 30 minutos. Pero antes de hacer alguna medida el espectrofotmetro fue calibrado
con el blanco indicado como B. Las sustancias utilizadas fueron Buffer, suspensin
mitocondrial, DPIP y succinato. Los resultados obtenidos no fueron los esperados ya que el
blanco fue sustituido por agua debido a que el original fue derramado y el succinato fue aadido
aproximadamente 50 minutos antes de comenzar las medidas en el espectrofotmetro, por esto
nuestras medidas fueron alteradas. Por estas razones no pudimos coincidir con nuestra hiptesis
ya que el por cieno de transmitancia fue disminuyendo al pasar el tiempo cuando se supone que
fuera lo contario a esto. En adicin, no se pudo determinar el cambio correcto de la respiracin
celular.
Introduccin:
Dentro del metabolismo podemos encontrar dos vas metablicas, la anablica y la
catablica. Las vas anablicas consumen energa de su entorno para construir molculas
complejas a partir de otras ms simples. Las vas catablicas son aquellas que liberan energa a
su entorno al descomponer molculas complejas en molculas ms simples. Un ejemplo de una
va catablica es la respiracin celular, en donde se descompone la glucosa y el oxgeno para
producir energa en forma de ATP (Adenosina trifosfato). En la siguiente reaccin podemos
observar el proceso de la respiracin celular en el cual la glucosa se oxida y el oxgeno se reduce:
C6H12O6 + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O + Energa. El proceso de la respiracin celular se lleva a cabo
en tres etapas. La primera esta es la gluclisis, esta se lleva a cabo en el citosol en donde se
rompe la glucosa en dos piruvatos. La segunda etapa es el ciclo del cido ctrico, esta se lleva a
cabo en la matriz del mitocondria en donde se completa la descomposicin de la glucosa y la
ltima etapa es la fosforilacin oxidativa en donde se lleva a cabo en la crestas de la mitocondria.
En este experimento se investig el cambio de respiracin celular, utilizando la
suspensin mitocondrial de los guisantes, mediante su cambio de color. Para esto se utiliz un
espectrofotmetro, este se utiliza para medir la cantidad de luz absorbida por una solucin con
color en por ciento de transmitancia y en absorbancia, en otras palabras mide la cantidad de luz
que un pigmento absorbe en diferentes longitudes de onda, en este caso la longitud de onda que
se utiliz fue de 600nm. El por ciento de transmitancia es la cantidad de radiacin
electromagntica que atraviesa la muestra en una longitud de onda en especfico. Para el
experimento se prepararon cuatro tubos con sustancias especficas e indicadas en donde una de

ellas fue utilizada como el control pero en nuestro caso el blanco que se utiliz fue agua debido a
que ocurri un error aleatorio y nos vimos obligados a descartar el blanco que contena el
Buffer, el DPIP, la suspensin mitocondrial y el succinato. Las soluciones en los otros tres
tubos contenan Buffer, DPIP, que vendra siendo un aceptador de electrones, suspensin
mitocondrial, que fue extrada de los guisantes y el succinato que fue aadido al comenzar las
lecturas de transmitancia por un periodo de 30 minutos. Las indicaciones especficas de estas
sustancias fueron extradas con una pipeta(0.03mL) y con su pompa. Para la preparacin de la
suspensin del mitocondria, se pesaron 50g de guisantes y se midi 150mL de Buffer. Estos se
introdujeron en una licuadora en donde se mezclaron por 1 minuto. Estos se filtraron con gazas y
se colocaron en tubos de centrifugas donde fueron centrifugados. Una vez ya los tubos
preparados, se colocaron en el espectrofotmetro para medir su transmitancia cada 5 minutos.
Mientras ms succinato hay en la solucin, mayor va a ser la transmitancia debido a que el
cambio de la respiracin celular es ms rpido.
Metodologa:
Para la preparacin de la suspensin mitocondrial, primero se utiliz una balanza digital
para pesar aproximadamente 50g de guisantes, se pesaron 50.06g. Luego en un vaso, se
midieron 150mL de Buffer. Estos se introdujeron en una licuadora y se mezclaron por 1
minuto. Ya estos mezclados, se filtraron con gasas y se introdujeron 4mL de la solucin para dos
tubos de centrfuga de 15mL. Finalmente los 2 tubos de centrfugas se centrifugaron por 10
minutos a una velocidad de 5. Para la preparacin del espectrofotmetro, primero se prendi 15
minutos antes de empezar. Usando el botn de control del largo de onda, se seleccion el largo
de onda de 600nm. Luego se oprimi el botn de modo y se seleccion Transmittance. El
instrumento se llev a cero ajustando el botn de control para que le medida sea de 0% de
transmitancia. No deber haber ninguna celda en el instrumento y la tapa del espectrofotmetro
debe de estar cerrada. Una vez ya est de esta manera, no se debe cambiar este ajuste. Se
obtuvieron 4 celdas y se etiquetaron como B, 1, 2, 3, en donde el b vendra siendo el blanco. Se
obtuvieron 4 tubos pequeos de ensayo y se etiquetaron tambin como B, 1, 2, 3. Se prepar el
blanco midiendo primero 4.6mL de buffer, 0.3mL de suspensin mitocondrial y 0.1 mL de
succinato, luego se introdujeron en el tubo de ensayo B, donde se mezclaron las sustancias. El
contenido fue transferido a su celda correspondiente (B).
Para la calibracin del
espectrofotmetro, primero se limpi la celda B con kimwipe y se insert en el
espectrofotmetro, se cerr la tapa y se ajust el control de luz hasta que ley 100% de
transmitancia. La medida se grab y se removi la celda B. Para nuestro caso debido a un error
aleatorio se utiliz agua como el blanco en la celda B. Para la preparacin de las celdas
experimentales, se midi el buffer, el DPIP y la suspensin mitocondrial en los tubos de
ensayos 1, 2 y 3 de acuerdo con la tabla # 1. Luego se le aadi la cantidad especfica de
succinato a cada tubo de ensayo. Las sustancias se mezclaron en cada tubo de ensayo y se
transfirieron a sus celdas correspondientes. Las celdas fueron limpiadas con kimwipe y se
insertaron una a la vez en el espectrofotmetro y se grab la transmitancia en la tabla # 2. Antes
de cada medida el espectrofotmetro se calibr. Finalmente se anotaron las medidas en un
intervalo de 5 minutos durante 30 minutos y se grabaron los resultados en la tabla # 2

Resultados:
Tabla # 1: Contenido de los Tubos Experimentales (Volumen en mililitros)
Tubos

Buffer

DPIP

1
2
3

4.4
4.3
4.2

0.3
0.3
0.3

Suspensin
Mitocondrial
0.3
0.3
0.3

Succinate
(aadida al final)
0
0.1
0.2

Tabla # 2: Porciento de Transmitancia durante un periodo de tiempo


Tubos
1
2
3
Grfica # 1:

0
28.2
29.4
22.5

5
27.4
29.0
22.7

10
26.9
28.8
22.6

Tiempo (min.)
15
26.4
28.4
22.5

20
26.0
28.2
22.3

25
25.6
28.0
22.3

30
25.1
27.8
22.2

Las disistintas medidas de Transmitancia en las diferentes concentraciones de succinato


30
29
28
27
26

Por ciento de Transmitancia (%T)

Tube 1

25

Tube 2

24

Tube 3

23
22
21
20
0

10

15

20

Tiempo (s)

25

30

35

Anlisis:
Los resultados no fueron los esperados ya que se cometieron varios errores aleatorios y
como podemos observar en la tabla # 2 y en la grfica #1, el por ciento de transmitancia iba
disminuyendo cuando se supone que fuera aumentando porque mientras ms concentracin de
succinato hay en una solucin, mayor va a ser la lectura del por ciento de transmitancia en el
espectrofotmetro. Al comenzar el experimento el blanco indicado fue derramado por error en el
minuto 15. El experimento se repiti pero esta vez se us agua como blanco para la celda B
afectando nuestra lectura de por ciento de transmitancia en el instrumento. Para el tubo 1, 2 y 3
podemos ver que el por ciento de transmitancia fue disminuyendo, estos resultados se deben a
que el succinato fue aadido aproximadamente 50 minutos antes de comenzar la lectura porque
el espectrofotmetro que se iba a utilizar estaba daado, debido a esto se esper a que otro
espectrofotmetro estuviera disponible para poder llevar a cabo nuestras medidas de por ciento
de transmitancia. Una vez disponible, este fue calibrado con el agua y se colocaron las celdas
rpidamente en el instrumento, donde se llevaron a cabo las medidas de por ciento de
transmitancia.
Para el tubo 1 la transmitancia siempre estuvo disminuyendo, esto se debe al que el
succinato ya haba dejado de reaccionar en la solucin. Al igual que el tubo 1, el tubo 2 estaba
disminuyendo debido a las mismas causas. Finalmente en el tubo 3 la transmitancia lleg a su
medida ptima en el minuto 5, en otras palabras el succinato dej de reaccionar en el minuto 5 y
la transmitancia comenz a disminuir. Debido a que se utiliz agua como blanco en la celda B y
que el succinato fue aadido a la solucin aproximadamente 50 minutos antes de hacer las
medidas, no pudimos concordar con nuestra hiptesis, nuestra prediccin no fue la esperada y no
se logr ver el cambio de la respiracin celular en las soluciones preparadas.
Conclusin:
Para concluir, en este experimento nuestra hiptesis no fue lo demostrado ya que el por
ciento de transmitancia disminuy debido a los errores aleatorios cometidos, como utilizar agua
como blanco debido a que el blanco indicado fue derramado. No se pudo determinar el cambio
de la respiracin celular en las soluciones con distintas concentraciones de succinato porque este
fue aadido aproximadamente 50 minutos con anterioridad de realizarse las medidas y esto
afect nuestras lecturas en el espectrofotmetro. Dejndonos llevar por estos datos a mayor la
adicin de succinato disminuye el por ciento de transmitancia, en donde esto es totalmente
errneo.
Referencias:
1. Campbell, N and J. Reece. 2010. Biology. 10th ed. Glenview (IL): Pearson. 142 and 163.

2. Morohashi Y, Derek J. Development of Mitochondrial Activities in Pea Cotyledons

during and following Germination of the Axis, Plant Physiology, 66, 70-73.