Interpretación de una tabla de purificación

a) En este problema se nos pide completar la tabla de purificación añadiendo

las columnas de actividad específica, las veces de purificación y el
rendimiento obtenido en cada paso. Aquí, hay que ver que significan las dos
columnas que nos dan y que información se nos pide.

Primero, la columna de "actividad total" expresa cuanta de la enzima que se

desea purificar está presente en cada paso; la segunda columna expresa
cuantas proteínas de entre el total de ellas, la que nos interesa incluída, están
siendo recobradas con cada paso de purificación.

Es evidente que deseamos obtener lo más posible de la acetilcolinesterasa, al

tiempo que recobremos tan pocas de las otras proteínas como sea posible. Así,
la actividad específica es el cociente entre la actividad total y la cantidad total
de proteína presente en esa preparación. Este valor será mayor si se recupera
más acetilcolinesterasa y menos de otras proteínas. Para la acetilcolinesterasa
100% pura, este valor alcanzará un número constante, ya que al no haber
contaminantes ya no será posible eliminar proteína sin que desaparezca la
actividad correspondiente a la enzima perdida. El valor se obtiene
símplemente dividiendo el valor de la celda en la columna 1 por el valor de la
columna 2 correspondiente a la misma fila (vease la tabla más abajo).

Luego, para calcular las veces de purificación, bastará considerar que entre
más pura esté la proteína, mayor su actividad específica, de manera que si
dividimos la actividad específica recuperada en cada paso por la que
encontramos en la preparación original, sabremos cuantas veces se ha
enriquecido nuestra preparación en colinesterasa, con respecto a otras
porteínas. Es decir dividimos el valor de cada celda en la columna 3 de la
tabla inferior, por el valor de la primera celda en esa misma columna,
evidentemente el valor de la primera fila será igual a la unidad, porque ahí la
enzima conserva la pureza correspondiente al extracto original, puesto que no
ha sido tratada.

Finalmente, la última columna corresponde al rendimiento, es decir cuanto del

compenente que se intenta purificar se está recobrando en cada paso, aquí
basta referirnos a la actividad total recuperada de la columna 1, ya que este es
el valor que cuantifica componente deseado. Así, expreando el valor de cada
una de estas celdas como porcentaje del valor presente en el extracto crudo (es
decir la fila 1 de esta columna), se genera la columna 5.
 Actividad
Actividad totalProteína Veces deRendimiento
específica
(µmol/min) total (µg) purificación (%)
Paso de purificación µmol/(min mg)
Homogenizado de tejido fresco. 556.7 33340 1.67 1 100
Precipitación con (NH4)2SO4 556.7 1070 52.03 31.16 100
DEAE-celulosa 289.5 124 233.47 139.82 52
concentración y díalisis 278.4 115 242.09 144.98 50.01
sephadex-G200 233.8 56 417.5 250.04 42
Cellex-P (intercambio catiónico)139.2 55.4 251.26 150.48 25
DEAE-celulosa 89.1 11.3 788.5 472.22 16.01
DEAE-sephadex 66.8 11.1 601.8 360.41 12
cromatografía de afinidad 46.8 4.8 975 583.91 8.41

b y c) Al analizar la tabla se observa que hay varios pasos en los que se

obtiene un rendimiento razonable con respecto al paso anterior y además hay
una ganacia en la veces de purificación. En particular, La precipitación con
sulfato de amonio mejora la pureza 31 veces y nos dá un rendimiento del
100%, la DEAE celullosa permite incrmentar la pureza, aunque se pierde
bastante actividad. La concentración y diálisis es un paso que no añade nada,
pero tampoco se pierde la proteína y que es necesario para poder aplicar la
muestra a la siguiente columna. El paso de filtación en gel por sephadex G200
mejora la pureza y mantiene un buen rendimiento. El paso de intercambio
catiónico siguiente, es malo, porque se pierde bastante actividad y se recupera
con menos pureza de la que se tenía. La siguiente cromatografía repite el paso
de DEAE-cellulosa, que a pesar de todo representa una mejora con respeto a
la proteína obtenida del paso de filtración, sin embargo, otro paso de más
intercambio aniónico (DEAE-suphadex, mismo grupo químico, diferente
soporte inerte) no mejora más la pureza, sino que incluso hay cierta pperdida
de pureza y de actividad. Finalmente, el paso de cromatografía de afinidad si
es bueno, ya que se recupera una proteína 900 veces más pura que la original
y el rendimento pasa tan sólo de 12 a 8.4 %, es decir casi 60% de lo aplicado a
este último paso. En resumen, sería conveniente eliminar los pasos de Cellex-
P y DEAE-sephadex (letra magenta, fondo amarillo), con lo cual, en teoría,
sería posible obtener una proteína de pureza semejante, con menos trabajo y
con una mejora en el rendimiento final.