Purificación de proteína con la aplicación

PROTEINA A PURIFICAR: Default mixture -1

DESCRIPCION DE LA PROTEINA 1

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Imagen 1 y 2. En la imagen (1) la aplicación de purificacion de la proteina nos da caracteristicas importantes de la proteina a
purificar.En la imagen (2)nos da el peso inicial de la proteina con su enzima total y el rendimiento.

PASOS PARA PURIFICAR

1.Fraccionamiento por sulfato de amonio

Porcentaje de saturacion :45 % , se precipito 29.5% de la proteina pero 0% de enzima , por eso se trabaja con el sobrenadante .
Esta tecnica me permite a remover contaminantes para concentrar la muestra .

Imagen 3. Se puede ver que la proteina total se ha reducido y purificado a 1.4

2.Cromatografia de intercambio ionico - Q-Sepharose

Gradiente :pH , pH buffer:7 , Limites de Gradiente (pH) :5-8

Cromatografia de Intecambio Ionico – Q-Sepharose

Grafica 1. Purificación de la proteína 1 utilizando cromatografía de Intercambio Iónico utilizando una columna Q-Sepharose, la
corrida cromatográfica se siguió midiendo la Absorbancia a una  = 280 nm y con un gradiente de pH 5-8. Se le ensayo su
actividad enzimática (pico rojo) también hay que aplicar una combinación de fracciones para obtener su rendimiento y
enriquecimiento.
Resultado

Imagen 4. Resultados del método donde se obtiene un rendimiento de 100% y un aumento de purificación lo cual puedo decir
que el método empleado con sus límites de gradientes de pH 5-8 es óptimo para esta proteína.
3.Cromatografia Hidrofóbico – Octyl -Sefarosa CL-4B

Con un limite de gradiente en molar :2-1 molar (en ese orden)

Cromatografía de Interacción Hidrofóbica – Octyl-Sepharose CL -4B

Grafica 2. Purificación de la proteína 1 utilizando Cromatografía de Interacción Hidrofóbica – Octyl-Sepharose CL -4B, la corrida
cromatográfica se siguió midiendo la Absorbancia con una  = 280 nm y con un gradiente molar de 2-1 molar (línea rosada). Se
le ensayo su actividad enzimática (pico rojo) también hay que aplicar una combinación de fracciones para obtener su
rendimiento y enriquecimiento
Resultado

Imagen 5. Resultados del método donde se obtiene un rendimiento de 99.2% lo cual a reducido muy poco y un aumento de
purificación a 29.7 lo cual puedo decir que el método empleado con sus límites de gradientes molares de 2-1 molar es óptimo
para esta proteína.

4.Pagina en dos dimensiones y Western Blot

Este paso lo hice para verificar cuantas proteínas mas tengo que eliminar para purificar mi proteína y con el western blot me
indica en que rango de pH se encuentra la proteína que quiero purificar.
Imagen 6 .La imagen de la izquierda es pagina en dos dimensiones y el de la derecha es el western blot donde resalta la proteína
que se desea obtener.

5.Filtracion por Gel -Sephadex G-100

Permite la separación de moléculas en función de su tamaño.

Filtración por Gel- Sephadex G-100

Grafica 3. Purificación de la proteína 1 utilizando Filtración por Gel -Sephadex G-100, donde mide la absorbancia con una 0280
nm. Se le ensayo su actividad enzimática (pico rojo) también hay que aplicar una combinación de fracciones para obtener su
rendimiento y enriquecimiento

Resultado

Imagen 7. Resultados del método donde se obtiene un rendimiento de 98.9% lo cual se redujo muy poco y un aumento de
purificación a 34.3 lo cual puedo decir que el método empleado es óptimo para esta proteína.

6.Cromatografia de Afinidad

Método basado en la interacción específica y reversible entre la proteína y un ligando específico unido a la matriz
cromatográfica. El ligando tiene una alta capacidad para unir a la proteína de interés

Ligando: Anticuerpo monoclonal Inmobilizado MC01A

Eluir con Tris /HCl 2mM, pH 7,4

Cromatografía de afinidad -Anticuerpo monoclonal MC01A

Grafica 4. Purificación de la proteína 1 utilizando Cromatografía de afinidad -Anticuerpo monoclonal MC01A, donde mide la
absorbancia con una 0280 nm, el aplicativo también nos informa que el buffer de elución eluye (extrae) en la fracción 40. Se le
ensayo su actividad enzimática (pico rojo) también hay que aplicar una combinación de fracciones para obtener su rendimiento
y enriquecimiento
Resultado

Imagen 7. Resultados del método donde se obtiene un rendimiento de 74.1% lo cual se redujo poco y un aumento
de purificación a 51.1 lo cual puedo decir que el método empleado es óptimo para esta proteína, también se puede
observar que la masa de la proteína se redujo a un peso de 7.4 mg.

7.Pagina en dos dimensiones

Se hace por segunda vez este paso para comprobar si la proteína se encuentra purificada.

Imagen 8. Pagina 2D de las fracciones agrupadas de la proteína, se aprecia solo una enzima que esta entre los rangos de pH 8-
8.4 lo cual es nuestra proteína ya purificada.

RESULTADOS DE METODOS DE PURIFICACION DE PROTEINAS OBTENIDOS CON EL APLICATIVO

Imagen 9. Se observa que se emplearon 5 métodos de purificación de proteínas para la proteína 1 y se obtuvo una purificación
de 51.1 de enriquecimiento de la proteína con un rendimiento del 74.1 %. La selección del método debe tener en cuenta,
además de los requerimientos de pureza, la necesidad de obtener elevados rendimientos durante el proceso de aislamiento.

BIBLIOGRAFIA

http://www.agbooth.com/pp_ajax/index.html?locale=es