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L-asparaginasa: un biocatalizador prometedor para aplicaciones industriales y

clínicas
RESUMEN

La L-asparaginasa es una enzima versátil con aplicación en alimentos y terapéuticas y en constante búsqueda de una
fuente microbiana confiable para la producción comercial. La revisión es una ayuda para comprender los hitos clave de la
L-asparaginasa desde su descubrimiento, sus fuentes potenciales, estrategias de producción económicas utilizando
sustratos alternativos disponibles a bajo costo, su purificación y procedimientos posteriores informados hasta el
momento, su caracterización y la relevancia de su aplicación en Industria alimentaria y terapéutica con una perspectiva
clínica añadida.

1. INTRODUCCIÓN así un producto intermedio betaacil-enzima. En el


siguiente paso, actúa sobre el carbono éster (R-C˭O)
El descubrimiento fortuito de la L-asparaginasa se producido por un nucleófilo activado por una molécula
informó por primera vez como la actividad antitumoral de agua, que finalmente proporciona el producto ácido L-
del suero de cobaya contra dos cepas de linfoma murino aspártico, con liberación de amoníaco. Otras reacciones
y una cepa de linfosarcoma en ratas (Kidd, 1953). Sin de hidrólisis catalizadas por la L-asparaginasa son la
embargo, Broome (1963) informó posteriormente que la hidrólisis de la L-glutamina y el péptido β-aspartil amida;
citotoxicidad del suero de cobaya se debía a la presencia sin embargo, el rendimiento de la reacción es muy bajo
de altas concentraciones de L-asparaginasa en los sueros (Cachumba et al., 2016).
de cobayas y otros miembros de especies similares. El
principio involucrado en la actividad citotóxica de la 3. FUENTES DE L-ASPARAGINASA
enzima se basó en el hecho de que las células leucémicas
no pueden sintetizar la L-asparagina requerida para la Se ha informado que la L-asparaginasa es producida por
síntesis de proteínas y, posteriormente, deben depender varias plantas, mamíferos y microbios. La Tabla 1
de un suministro externo disponible en el plasma y los enumera una gran cantidad de microbios que producen
tejidos. La administración de la enzima, L-asparaginasa, L-asparaginasa. (Peterson y Ciegler, 1969) examinaron
quita esta fuente libre de asparagina, muere de hambre y más de 123 especies bacterianas para la producción de
destruye ciertas células cancerosas. La L-asparaginasa L-asparaginasa y reportaron su actividad enzimática.
también se usó para el tratamiento de tumores sólidos Entre estas bacterias, Erwinia aroideae NRRL B-138
junto con los cánceres del sistema linfático en niños, y la proporcionó los rendimientos más altos. Desde entonces,
eficacia del tratamiento fue informada por Tallal et al. se informó que la L-asparaginasa es producida por
(1970). La enzima se revisó a principios de 1973 muchas bacterias diferentes, incluyendo Proteus vulgaris
(McCredie et al., 1973), por su farmacología, toxicidad y (Tosa et al., 1971), Pseudomonas aeruginosa (El-
el mecanismo de resistencia a la L-asparaginasa que Bessoumy et al., 2004), E.coli (Ghasemi et al., 2008 ),
implicaba el aclaramiento inmunológico. Desde su Streptomyces gulbargensis (Amena et al., 2010) etc.
descubrimiento, la L-asparaginasa continúa siendo una
Además, muchas enzimas bacterianas de importancia
búsqueda constante para los investigadores que
comercial son ampliamente preferidas y exploradas por
exploraron las fuentes microbianas que utilizaron
las propiedades versátiles de mayor tolerancia a la
materiales más baratos o fácilmente disponibles para
temperatura y el pH atribuido a los hábitats extremos
producir la enzima con relativa facilidad en su
que habitan estas bacterias (Herbert, 1992). Muchos de
purificación. En los últimos años, se ha explorado la
estos hábitats que son prospectados para bacterias que
eficacia terapéutica estable y mejorada, como se analiza
producen L-asparaginasa incluyen, bacterias luminosas
en esta revisión.
marinas (Ramaiah y Chandramohan, 1992) donde los
2. L-ASPARAGINASA- MECANISMO DE ACCIÓN. autores informaron que aunque la producción de la
enzima L-asparaginasa no es uniforme entre la cepa de la
El mecanismo del proceso de hidrólisis de la L- especie Vibrio examinada por ellos, y que no se informó
asparagina por asparaginasa se produce en dos pasos a que ninguno de los Photobacterium phosphoreum
través de una enzima beta-acilo intermedia (Fig. 1). En el produjeran L-asparaginasa antes de este informe, y
primer paso, el residuo nucleofílico de la enzima se también informan que, comparativamente, la enzima
activa por una base fuerte (NH2) y, por lo tanto, ataca el secretada por los procariotas luminosos fue mayor que
átomo de carbono amida de la L-asparagina, generando la reportada para otras especies bacterianas.
Fig. 1. Mecanismo de acción de la L-asparaginasa

Shome y Shome informaron a los productores de L- para explorar un potencial ilimitado para los
asparaginasa de los manglares de las islas Andamán en productores de L-asparaginasa (Izadpanah et al., 2018).
(2001), y entre los aislamientos, 87.9% y 33.3% fueron
capaces de crecer a pH 10 y 12 respectivamente y se 4. DETECCIÓN DE L-ASPARAGINASA
informó que el 6.6% era termotolerante, lo que produce
La detección de bacterias productoras de L-asparaginasa
Los candidatos ideales para ser aprovechados para la
ha sido prospectada por muchos métodos. La actividad
producción industrial de L-asparaginasa, que requiere la
de la L-asparaginasa se acompaña de un aumento del pH
estabilidad del producto en condiciones de producción
debido a la liberación de amoníaco. Esta propiedad se
de pH y temperatura altas (Shome y Shome, 2001). Los
usó y exploró al idear una técnica de detección rápida de
informes de actinomicetos marinos hiperproductivos
placas utilizando un medio incorporado con indicador de
capaces de una mayor actividad de la L-asparaginasa
pH que contiene L-asparagina como única fuente de
incluso cuando se utiliza un sustrato barato de bajo costo
nitrógeno (Gulati et al., 1997). El indicador de rojo fenol
como la harina de soya son notables en este contexto
que es amarillo en condiciones ácidas se vuelve rosa en
(Basha et al., 2009), Otro tipo de extremófilos, los
condiciones alcalinas debido a un aumento en el pH.
halófilos o la sal Los organismos que aman a menudo
Recientemente (Mahajan et al., 2013) informaron sobre
habitan en ambientes hipersalinos que poseen la
un método mejorado para la detección de
capacidad de equilibrar la presión osmótica del ambiente
microorganismos que producen L-asparaginasa
hostil y, por lo tanto, resisten los efectos
extracelular en donde el azul de bromotimol (BTB) se
desnaturalizantes de las sales. Bacillus sp. Las bacterias
incorpora como indicador de pH en un medio que
halófilas BCCS 034 aisladas de Maharloo Salt Lake
contiene Lasparagine en lugar de rojo de fenol. Además,
mostraron una atractiva perspectiva para ser
BTB da un color verde transitorio a pH neutro, 7.0 y
aprovechadas para la producción comercial de L-
color azul oscuro a pH más alto 8.0–9.0, lo que indica la
asparaginasa (Ebrahiminezhad et al., 2011).
potencia del microorganismo para la producción de
Aparte de la aplicación clínica, la L-asparaginasa es Lasparaginase.
comercialmente importante en la industria alimentaria.
El ensayo cuantitativo de L-asparaginasa implica la
La necesidad de la termoestabilidad de la L-asparaginasa
detección de amoníaco liberado que se libera durante la
utilizada en altas temperaturas de procesamiento de
reacción catalizada por Lasparaginasa en su sustrato
alimentos para prevenir la formación de acrilamida es un
natural L-asparagina. Brevemente, este método de
requisito que no puede ser subestimado. La L-
nesslerización implica que la fuente de la enzima
asparaginasa producida por la cepa hswx88 de Bacillus
(sobrenadante crudo si el lisado extracelular o celular si
subtilis, aislada de la fuente Taptapani de Odisha, India,
es intracelular) se incuba con el sustrato durante 10
definitivamente es un potente candidato para tal
minutos, el amoníaco liberado se prueba mediante la
aplicación (Pradhan et al., 2013), etc. Por lo tanto, se
adición de reactivo de Nessler en la mezcla de sustrato
puede prever que ubicaciones geográficas de las cuales
de enzima diluida. La formación de coloración debida a la
Los productores de asparaginasa que están aislados
presencia de amoníaco se usa de forma cualitativa y
juegan un papel importante en la estabilidad, a pesar de
cuantitativa para determinar la actividad enzimática
las diferentes condiciones y propiedades de las L-
(Mashburn y Wriston, 1964). Una unidad de actividad
asparaginasas. Entre los otros hábitats, los microbios
enzimática se define como la cantidad de enzima que
marinos siguen siendo una perspectiva muy atractiva
produce 1 μmol de amoníaco por minuto a pH 8,6 y 37 ° factores críticos como los nutrientes, la aireación, la
C. Otros métodos de detección incluyen ensayos temperatura y el pH. Las condiciones de fermentación
continuos de L-asparaginasa mediante su acoplamiento varían de un organismo a otro para la producción de L-
con la reacción glutámica deshidrogenasa y mediante un asparaginasa, y puede producirse de forma constitutiva
electrodo de vidrio catiónico (Ferguson y Phillips, 1974). (Mesas et al., 1990) o después de la inducción utilizando
La Tabla 2 enumera parte de la actividad significativa de un sustrato o condiciones adecuadas. La cinética de la
la L-asparaginasa de varios organismos. fermentación para la producción de L-asparaginasa ha
sido una parte esencial del estudio donde los factores y
5. CARBONO - METABOLISMO DEL NITRÓGENO DE LA parámetros limitantes de la velocidad se optimizan para
L-ASPARAGINASA EN MICROORGANISMOS. obtener una producción continua de la enzima. Este
estudio se ha realizado desde las últimas tres décadas
Como se informó anteriormente, varios
para organismos como Erwinia sp. (Deokar et al., 2010;
microorganismos se presentan como productores de
Liu y Zajic, 1973)
Lasparaginasa; sin embargo, las bacterias E. coli y E.
chrysanthemi son los principales agentes microbianos La elección del método que se utilizará para la
actuales para la producción a escala industrial en el área fermentación bacteriana, por estado sólido (SSF) o por
farmacéutica, mientras que la L-asparaginasa del hongo tipo sumergido (SmF), depende de la capacidad del
Aspergillus oryzae es la más utilizada en la industria microorganismo para utilizar el sustrato directamente
alimentaria. Para la producción de Lasparaginasa a gran en estado sólido o de si el sustrato se puede tratar
escala, muchos factores se consideran para optimizar un previamente y Proporcionado a los microbios en forma
proceso con mayor rendimiento y viabilidad económica. fácilmente accesible respectivamente. Sin embargo,
Los factores como el tipo y la concentración de las algunos actinomicetos marinos han sido reportados
fuentes de carbono y nitrógeno, pH, aireación, tanto para SmF como para SSF para la producción de L-
temperatura, tiempo de fermentación, tienen una gran asparaginasa por Basha et al. (2009).
influencia en el proceso. Se han explorado diferentes
tipos de medios de cultivo para la producción de L- Las fermentaciones sumergidas sufren las desventajas de
asparaginasa. Sin embargo, la fuente de carbono y la producir un rendimiento menor, mientras que las SSF
fuente de nitrógeno son los componentes que más son más rentables. Sin embargo, el uso de nutrientes de
influyen, ya que la enzima que es una hidrolasa de desperdicio más baratos en fermentaciones sumergidas
aminoácidos es inducida por el contenido de puede ayudar a mejorar la rentabilidad. Un ejemplo de
aminoácidos en el medio de producción. Por ejemplo, tal estudio de fermentación sumergida es cuando el
varios estudios han demostrado que los mejores extracto de pastel de cacahuete se optimizó para la
inductores para mayores rendimientos de L- producción de L-asparaginasa por Streptomyces
asparaginasa son L-asparagina, L-glutamina y L-prolina, gulbargensis (Amena et al., 2010). Se ha reportado
y la fuente de carbono más común es la glucosa, además fermentación en estado sólido para organismos como
de otras fuentes nativas como el almidón y maltosa Serratia marcescens (NCIM 2919) mientras se usa la
(Baskar y Renganathan, 2009; Tippani y Sivadevuni, torta de aceite de coco (Ghosh et al., 2013) y Bacillus
2012), y la importancia de dichos componentes del subtillis mientras se usa la mazorca de maíz (Makky et
medio son revisados por Cachumba et al. al., 2014). La fermentación en estado sólido (SSF) y la
fermentación sumergida (SmF) se reportan para
6. MEDIOS DE FERMENTACIÓN PARA LA diferentes organismos por Batool et al. (2016).
PRODUCCIÓN DE L-ASPARAGINASA POR BACTERIAS.
De este modo, el uso de diferentes sustratos para la
Con un conocimiento profundo de las fuentes de carbono producción de L-asparaginasa determina el tipo de
y nitrógeno requeridas para la producción de L- condiciones de fermentación.
asparaginasa, es imperativo diseñar un medio de
producción que pueda tener un balance de todos los

Tabla 1. Lista de diferentes fuentes microbianas de L-asparaginasa.


7. UTILIZACIÓN DE RESIDUOS PARA LA PRODUCCIÓN los desechos, resolviendo así los problemas asociados
RENTABLE DE L-ASPARAGINASA con su eliminación. La actividad de la L-asparaginasa
también se informa en el suelo de arroz sumergido
En India, aproximadamente 960 millones de toneladas modificado con compost de desechos sólidos
de desechos sólidos se generan anualmente como municipales y estiércol de vaca descompuesto, lo que
subproductos durante procesos industriales, agrícolas y sugiere que los desechos pueden tener una profunda
otros. De los cuales, alrededor de 350 millones de influencia en la producción de L-asparaginasa por parte
toneladas son desechos orgánicos de origen agrícola; de los microbios (Bhattacharyya et al., 2007). Por lo
290 millones de toneladas son residuos inorgánicos de tanto, también se sabe que los microbios desempeñan un
los sectores industriales y mineros y casi 4,5 millones de papel crítico en la descomposición de la materia orgánica
toneladas son de naturaleza peligrosa (Pappu et al., y en el ciclo de los nutrientes, y por lo tanto, pueden
2007). En 2017, Kumar et al. Informaron sobre un aprovecharse para la producción comercial de productos
seminario internacional sobre 'Gestión sostenible de industrialmente importantes utilizando nutrientes más
residuos sólidos para ciudades: oportunidades en países baratos y una política de cero desperdicios (Das et al.,
de la Asociación de Asia Meridional para la Cooperación 2013). .
Regional (SAARC)' organizado por el Consejo de
Investigación Científica e Industrial-Instituto Nacional de Tal intento de utilización de muchos residuos agrícolas
Investigación de Ingeniería Ambiental y la Royal Society, como sustratos alternativos para la producción de L-
donde la prioridad era cambiar de la dependencia de los asparaginasa como la mazorca de maíz también ha
vertederos que no ofrecen protección ambiental a la resultado en un aumento del rendimiento de L-
gestión de desechos. asparaginasa por parte de las bacterias (Makky et al.,
2014). Algunas de estas estrategias de utilización de
El uso de desechos disponibles a bajo costo como fuentes desechos aplicadas para la producción de L-asparaginasa
de nutrientes en el medio de producción para las se enumeran en la Tabla 3. Por lo tanto, es una
bacterias puede ser otro método de producción rentable perspectiva valiosa utilizar los desechos disponibles a
de L-asparaginasa. Diferentes tipos de desechos bajo costo para producir una enzima con tal valor
industriales y agroalimentarios pueden servir a este comercial al tiempo que se logra una biorremediación y
propósito al ser el sustrato nutricional para la una preocupación económica favorable.
fermentación bacteriana, así como a la remediación de

Tabla 2 Lista de microorganismos que producen L-asparaginasa y su rendimiento (Cachumba et al., 2016).

Tabla 3. Producción de L-asparaginasa utilizando materiales de desecho.


Caseína y licor de maíz.
Cultivos leguminosos
Harina de soja y astillas de madera
Harina de soja
Pastel de nuez molida
Salvado de trigo, salvado de arroz y bagazo
Elote
Pastel de aceite de coco
Pastel de aceite de palma
Efluente industrial
Cáscaras de ajo cebolla
Harina De Piel De Pasión
Fig. 2. Pasos implicados en la producción de L-asparaginasa.
8. MÉTODOS DE OPTIMIZACIÓN ESTADÍSTICA PARA interacción de los factores en cuestión. ANOVA también
MEDIOS Y PARÁMETROS PARA LA PRODUCCIÓN DE ayuda a comprender la importancia del modelo diseñado
L-ASPARAGINASA. y los factores de interacción en términos de los valores F
y p. Como un paso adelante en la optimización, se puede
Los métodos convencionales utilizados para probar los utilizar un algoritmo genético junto con RSM. La
parámetros de fermentación individuales son laboriosos optimización de las condiciones de cultivo para la
y requieren mucho tiempo y, sin embargo, no producción de Lasparaginasa por fermentación
proporcionan información sobre la interacción entre los sumergida de Aspergillus terreus MTCC 1782 se estudió
factores para el aumento de la productividad general. La utilizando un diseño compuesto central de 3 niveles de
importancia de los métodos estadísticos, por lo tanto, no RSM y un algoritmo genético artificial vinculado a redes
se puede descartar. Las operaciones estadísticas ayudan neuronales que se encontró que era más eficiente que la
a la evaluación de cada parámetro como significativo o metodología de superficie de respuesta sola (Gurunathan
insignificante para afectar el rendimiento final y se y Sahadevan , 2012). Las ventajas de RSM sobre el
pueden expresar simplemente en formas matemáticas de enfoque de factor a tiempo convencional (OFAT) se han
ecuación. Los métodos estadísticos son rápidos y demostrado claramente en un estudio comparativo para
confiables, pueden identificar nutrientes significativos, la producción de L-asparaginasa por Serratia
ayudan a comprender las interacciones entre los marcescens, utilizando parámetros de cantidad de
nutrientes en diversas concentraciones y también sustrato de torta de aceite de coco, contenido de
reducen enormemente el número total de ensayos humedad inicial, pH y temperatura, donde El enfoque de
experimentales. Uno de los diseños más antiguos, el optimización de RSM mejora la producción de enzimas al
Plackett-Burman (PBD) ayuda a identificar los 33% en comparación con el método clásico (Ghosh et al.,
compuestos más significativos y sus concentraciones a 2013). El diseño rotativo compuesto central (CCRD) se
partir de una gran cantidad de factores para la informa más comúnmente como uno de los pasos en la
optimización del proceso (Plackett y Burman, 2018). optimización secuencial que involucra factores distintos
a los constituyentes del medio como el pH inicial óptimo
El diseño de PB permite la evaluación de cada variable
del medio de cultivo y la concentración de inóculo que
en dos niveles, a saber, "alto" (+1) y "bajo" (−1). Factores
muestran un aumento notable en el rendimiento de L-
ANOVA como los valores F y p ayudan a decidir la
asparaginasa (Dias y Sato , 2016). Los informes más
idoneidad del modelo para el diseño. La representación
recientes de da Cunha et al. (2018) también sugieren que
gráfica como la tabla de Paretos ayuda a comprender el
mediante la optimización del proceso se obtuvo un
factor más significativo en el orden descendente de
aumento (57%) en la actividad de Lasparaginasa
importancia. Se informó que el diseño factorial de
(3746.78 U / gds) utilizando las condiciones optimizadas
Plackett Burman optimiza varios parámetros de medios
de la harina de cáscara de fruta de la pasión con un
y para múltiples aislamientos que se convierten así en
contenido de humedad inicial y concentraciones de
ahorro de tiempo y uno de esos informes fue donde el
inóculo, otros factores, en comparación con el Los
pH, el hidrolizado de caseína y el licor de maíz fueron los
valores iniciales se obtuvieron en el método de "un
factores más importantes que mejoraron el proceso de
factor a la vez".
producción de enzimas en la selección entre 15
condiciones de cultivo para Pseudomonas Aeruginosa Otro diseño en la metodología de superficie de respuesta,
para producir L-asparaginasa (Abdel-Fattah y Olama, los diseños de Box-Behnken se usan generalmente
2002). Venil et al. (2009) informaron un método de cuando tenemos menos puntos de diseño que los diseños
optimización que combinaba el diseño de Plackett- centrales compuestos y, por lo tanto, son menos costosos
Burman, un diseño factorial y el método de superficie de de ejecutar. Los diseños de Box-Behnken tienen 3 niveles
respuesta, que se utilizó para optimizar el medio para la por factor, a diferencia de los diseños centrales
producción de L-asparaginasa por Serratia marcescens compuestos que pueden tener hasta 5, ya que no
SB08. El impacto de las fuentes de carbono y nitrógeno incluyen carreras donde todos los factores están en su
en la producción de L-asparaginasa se informó utilizando configuración extrema. Sin embargo, el método se ha
una herramienta estadística llamada Plackett and informado para la optimización de la producción de L-
Burman (Hymavathi and Sathish, 2010). asparaginasa incluso recientemente para los factores de
los parámetros de cultivo, como el pH, la temperatura y
La metodología de superficie de respuesta (RSM) implica
el contenido de humedad, y dio un resultado significativo
el uso de diferentes factores que se evalúan en los
(Doriya y Kumar, 2018).
niveles α + 1 y −1 y el resultado resultante en términos
de rendimiento se analiza estadísticamente para Por lo tanto, las optimizaciones estadísticas dan como
determinar su importancia y el proceso biológico se resultado un mayor rendimiento de la producción de L-
puede dar como una ecuación matemática en una asparaginasa a escala comercial.
cuadrática. o de manera lineal dependiendo de la
9. PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA L- filtración por gel utilizando materiales como el gel
ASPARAGINASA. Sephadex G-100 se utiliza cuando la enzima se separa
fácilmente basándose únicamente en el tamaño
La purificación de la L-asparaginasa hasta casi la molecular. Las fracciones obtenidas de este modo se
homogeneidad se informa a partir de diversas fuentes analizan para determinar la presencia de la enzima
bacterianas e implica múltiples pasos dependiendo de la mediante protocolos de ensayo y luego las fracciones que
naturaleza intracelular o extracelular de la enzima. En contienen la enzima se pueden agrupar, concentrar y
cualquier caso, las proteínas se eliminan mediante seguir aplicando a la matriz de cromatografía de
técnicas de precipitación como el sulfato de amonio. La intercambio iónico como la resina de intercambio iónico
proteína precipitada se dializa luego y se somete CM-Sephadex C50 y eluir en un gradiente. de
adicionalmente a cromatografía en columna. La elección concentración de NaCl (0.1–0.5 M) para lograr una
de la cromatografía en columna varía según el separación basada en la carga. Por lo tanto, los métodos
microorganismo fuente y el tamaño de la L-asparaginasa de purificación han sido casi convencionales durante un
involucrada. Pueden involucrarse múltiples etapas de la largo período de tiempo (El-Bessoumy et al., 2004;
cromatografía utilizando dos o más tipos de métodos de Gaffar y Shethna, 1977). La estrategia general de
columna. La separación basada en cromatografía de purificación puede ser la que se enumera en la Tabla 4.

Tabla 4 Purificación y caracterización de la L-asparaginasa a partir de diferentes microorganismos.

Se han explorado muchos métodos novedosos para contiene El gen ASP3 de Saccharomyces cerevisiae.
purificar la L-asparaginasa. Uno de estos métodos es la Obtuvieron altos rendimientos de extracción y
extracción in situ de L-asparaginasa intracelular que recuperación de enzimas utilizando ciclos de congelación
utiliza un sistema de dos fases acuosas de separación y descongelación, tratamiento con etanol y extracción
térmica que produce un mayor rendimiento y una mayor alcalina en presencia y ausencia de cisteína.
actividad específica cuando se compara con el proceso de
extracción de dos fases acuosa convencional (Zhu et al., Se idean estrategias de purificación de proteínas
2007). ). Además, Zhu et al. (2007) informaron una similares para obtener L-asparaginasa purificada que se
recuperación mejorada de la enzima en la confirma aún más mediante técnicas electroforéticas. La
homogeneización a alta presión combinada con homogeneidad de la proteína purificada se confirma
extracción acuosa de dos fases para la purificación de la mediante una banda única de proteína en la PAGE nativa
L-asparaginasa I intracelular (Ferrara et al., 2010) seguida del tamaño de la subunidad obtenida en la SDS
informaron la extracción de la L-asparaginasa PAGE. Los tamaños así inferidos dan una idea del
periplásmica de Pichia pastoris recombinante que carácter de la enzima como homo o hetro-mer.
10. MASA MOLECULAR DE LA L-ASPARAGINASA que el gen ansB codifica la L-asparaginasa II. Dado que la
PURIFICADA. asparaginasa II tiene una alta afinidad por la L-
asparagina, es de gran interés en la quimioterapia.
Los tamaños de la L-asparaginasa varían de cada
organismo a otro en términos de género y especie. En el Los intentos de clonar ansB y la sobreexpresión de L-
caso de las bacterias Gram negativas Serratia sp. existe asparaginasa se han realizado con éxito y dieron como
como pentámero o hexámero con un peso molecular resultado la producción de una enzima funcional (Vidya
promedio de 170 a 180 kDa según lo informado por y Vasudevan, 2011). La clonación del gen Tk1656 que
(Stern et al., 1976). Mientras que la L-asparaginasa se codifica la L-asparaginasa termófila de Thermococcus
encontró que era un homotetramer con subunidades kodakarensis KOD1 se realizó en Escherichia coli BLR
idénticas (38,000 Da) en E. coli (Muller y Boos, 1998). El (DE3). La proteína recombinante se sobreexpresó,
tamaño molecular y las subunidades de la L- purificó y caracterizó con éxito (Hong et al., 2014).
asparaginasa en Pseudomonas varían de una sola
subunidad de 34–33 kDa en condiciones de En Bacillus sp. La L-asparaginasa está regulada por dos
desnaturalización y desnaturalización, respectivamente. genes controlados diferencialmente. Los estudios con
La L-asparaginasa también existe como un monómero Bacillus subtilis revelaron que la expresión de los dos
con un tamaño de 160 kDa en Pseudomonas según lo conjuntos de genes que codifican la L-asparaginasa está
informado por (El-Bessoumy et al., 2004). Por lo tanto, la controlada por factores reguladores independientes,
L-asparaginasa muestra una amplia variación estructural donde se demostró que el gen ansZ codifica una L-
en las subunidades de las bacterias mencionadas asparaginasa funcional cuya expresión se activa durante
anteriormente. La tabla .4 enumera los pasos de el crecimiento limitado por el nitrógeno por el TnrA.
purificación y las propiedades de la enzima purificada. factor de transcripcion. TnrA regula la expresión de ansZ
mediante la unión a un sitio de ADN que se encuentra
11. GENÉTICA MOLECULAR DE LA L-ASPARAGINASA aguas arriba del promotor ansZ.
Y CLONACIÓN Y SOBREEXPRESIÓN DE LA L-
ASPARAGINASA. Sin embargo, la expresión del gen ansA, que codifica otra
Lasparaginasa, fue inducida por asparagina. El gen ansA
La L-asparaginasa está regulada por diferentes se encuentra en un operón junto con ansB, que codifica
elementos moleculares en diferentes organismos. la L-aspartasa y la expresión del operón ansAB es
Escherichia coli produce dos L-asparaginasas con reprimida por AnsR, y se ha hipotetizado que la actividad
propiedades notablemente diferentes, donde la L- de AnsR está regulada por la asparagina o el aspartato
asparaginasa I tiene una baja afinidad por la L- (Fisher y Wray, 2002). Se demostró con éxito la
asparagina, es citoplásmica y se produce de manera clonación del gen que codifica Lasparaginasa (ansZ) de
constitutiva, mientras que la L-asparaginasa II es una una cepa no patógena de Bacillus subtilis B11-06 y su
enzima de alta afinidad y es se secreta en el periplasma, y sobreexpresión y purificación de la proteína
su expresión está regulada positivamente por diferentes termoestable (Jia et al., 2013). La lista de organismos
inductores, a saber, la proteína del receptor de AMP cuyos genes se han clonado para la expresión excesiva de
cíclico y la anerobiosis (la Fumarate and Nitrate L-asparaginasa se ha incluido en la Tabla 5.
Reductase o la proteína FNR) (Jennings y Beacham,
1990). Las secuencias de estos dos genes codificantes de Por lo tanto, la tecnología de ADN recombinante se ha
L-asparaginasa son bastante diferentes. La comprensión aplicado con éxito para producir una producción de L-
molecular de la genética de la L-asparaginasa ha asparaginasa mucho mayor y para poseer propiedades
revelado que ansA codifica la L-asparaginasa I, mientras mejoradas de actividad y estabilidad (Zuo et al., 2015).

Tabla 5 Tecnología de ADN recombinante en la clonación de genes de L-asparaginasa de origen microbiano.


12. EFECTOS DEL PH, LA TEMPERATURA Y LOS Lasparaginasa, que se interpretó que la enzima no era
EFECTORES SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA L- una metaloproteína. Este informe también fue apoyado
ASPARAGINASA Y LOS ESTUDIOS DE CINÉTICA DE LA por los informes de Jia et al. (2013), Kumar et al. (2011),
L ASPARAGINASA Singh et al. (2013).

Las L-asparaginasas de diferentes organismos difieren De manera similar, la inhibición de la actividad


en sus propiedades bioquímicas. la temperatura óptima enzimática en presencia de Hg2 +, Cd2 + y Zn2 +,
general para la actividad de la L-asparaginasa está entre incrementó la activación con agentes reductores como el
30 y 40 ° C; sin embargo, varias especies de Yersinia y 2-mercaptoetanol (2-ME), el ditiotreitol (DTT) y la
Streptomyces tienen temperaturas óptimas más altas reducción del glutatión (GSH) y la inhibición en
(40–60 ° C), mientras que las L-asparaginasas presencia de bloqueo del grupo tiol. Los reactivos, a
hipertermofílicas de la archaea Thermococcus saber, PCMB (benzoato de p-cloro mercurio) fueron
kodakarensis KOD1 y P. furiosus tienen temperaturas indicativos del papel de los grupos sulfhidrilo de la
óptimas a 85 ° C y 80 ° C, respectivamente. La L- enzima para la catálisis productiva. Kumar et al. (2011)
asparaginasa es generalmente activa en un amplio rango documentaron la inhibición completa de la actividad de
de pH, con una actividad óptima en el rango de 6.0 a 9.5; la L-asparaginasa de P. carotovorum MTCC 1428 en
sin embargo, la mayoría de ellos son activos a pH presencia de los cationes di-valentes Cu2 +, Cd2 + y Hg2
alcalino. La L-asparaginasa de Streptomyces + (Jia et al., 2013) informaron que Fe3 + inhibió
gulbargensis se mantuvo estable a pH alcalino, mientras fuertemente la Bacillus subtilis B11-06 L Actividad de la
que mantuvo una actividad del 55% a 80 ° C durante 1 h asparaginasa.
(Amena et al., 2010).
Estudio de la cinética de la L-asparaginasa con respecto a
Se encontró que la L-asparaginasa purificada a partir de su sustrato Lasparagina proporciona una idea de la
Bacillus licheniformis está activa en el rango de pH 6.0- afinidad por el sustrato. Los valores de Vmax y Km son
10.0 y temperatura de 40 ° C (Mahajan et al., 2014). L- una indicación de la velocidad de reacción y la afinidad
asparaginasa producida por Streptobacillus sp. KK2S4. del sustrato en bajas concentraciones. Los valores de km
mostró que la actividad óptima de la enzima purificada de asparaginasas de diferentes fuentes varían
se registró a pH 8,5 y 35 ° C (Makky et al., 2014). La L- ampliamente. Los parámetros cinéticos Km se calculan
asparaginasa de Pseudomonas otitidis mostró que la mediante análisis de regresión no lineal de datos
actividad óptima de la asparaginasa se logró a 40 ºC y pH experimentales de estado estacionario. El conocimiento
7,5, que está cerca del entorno interno del cuerpo de la afinidad enzimática por la L-asparagina puede
humano (Husain et al., 2016). abordar el potencial de la enzima para interactuar con su
sustrato en la menor concentración disponible como en
Por otro lado, diferentes iones tienen diferentes los sueros humanos. Por lo tanto, la enzima con el Km
influencias en la actividad de la L-asparaginasa y el más bajo es la más buscada para la aplicación
conocimiento de tales efectores ayuda en la comprensión terapéutica en tiempo real. El valor de Km por lo tanto
del sitio activo de la enzima, que puede llevar a estudios sirve como una denominación de comparación de la
en ingeniería de la especificidad o actividad de su enzima de varias fuentes para su afinidad de sustrato. La
sustrato. Warangkar y Khobragade (2010) informaron el Tabla 6 enumera algunos de los organismos que
efecto de mejora del EDTA sobre la actividad de producen L-asparaginasa y sus parámetros cinéticos.
Tabla 6 Parámetros cinéticos de la L-asparaginasa por su sustrato natural L-asparagina.
13. APLICACIONES DE LA L-ASPARAGINASA EN LA una gran cantidad de asparagina para un crecimiento
INDUSTRIA ALIMENTARIA. rápido y maligno. De esta manera, las células cancerosas
necesitan el aminoácido de la dieta. Sin embargo, los
La acrilamida está clasificada por la IARC como linfoblastos leucémicos y algunas otras células tumorales
"probablemente carcinogénica para los humanos" y se son auxótrofos de la L-asparagina y tienen un bajo nivel
forma como resultado de la reacción de Maillard entre la de sintetasa de L-asparagina necesaria para la síntesis de
asparagina y los compuestos carbonílicos, como la la L-asparagina. Por lo tanto, estas células malignas
reducción de azúcares en productos como los productos dependen del suministro exógeno de L-asparagina del
de papas fritas y otros productos alimenticios, incluidos suero sanguíneo para su proliferación y supervivencia
los productos de cereales. Bocadillos de café, chocolate y (Fig. 4). La L-asparaginasa hidroliza la asparagina del
papas (Vinci et al., 2011). suero sanguíneo, causando la muerte de las células
tumorales al carecer de un factor esencial para las
Sin embargo, las reacciones de Milliard sí imparten
proteínas sintetasas (apoptosis dependiente de p53). Sin
muchos cambios favorables en la industria alimentaria
embargo, las células sanas no se ven afectadas, ya que
aparte de la formación de acrilamida y debido a que su
pueden producir asparagina utilizando la L-asparagina
formación no puede erradicarse completamente. Sin
sintetasa presente en cantidades suficientes.
embargo, la aplicación de la L-asparaginasa proporciona
un posible método alternativo para la mitigación de la Se probaron ensayos clínicos extensos para el
acrilamida que debería tener un efecto muy limitado en tratamiento de muchos tipos de tumores malignos,
la formación general de los productos de Maillard. La L- incluidos los de las enfermedades hematopoyéticas, la
asparaginasa de varias fuentes ha sido evaluada para la leucemia linfoblástica aguda (LLA) y los linfomas no
mitigación de la acrilamida. La L-asparaginasa de Hodgkin, en los que la L-asparaginasa fue una de las
Aspergillus oryzae se probó en una amplia gama de combinaciones en quimioterapia. El tratamiento de la
productos alimenticios, incluidas las aplicaciones LLA en pacientes pediátricos mostró una alta tasa de
basadas en masa (galletas semidulces, galletas de supervivencia (70%) junto con informes muy bajos de
jengibre, pan crujiente) donde se observó una reducción reacciones de hipersensibilidad e interferencias
del 34–92% del contenido de acrilamida, en papas fritas, inmunológicas. (Muller y Boos, 1998)
aproximadamente 60–85%. y se documentaron
rebanadas de papas fritas hasta un 60% de reducción La sensibilidad de las células cancerosas al tratamiento
(Hendriksen et al., 2009). Mahajan et al. (2012) con L-asparaginasa se ha atribuido a más que la
demostraron la degradación de la acrilamida por la L- auxotrofia para la L-asparagina sintetasa. La principal
asparaginasa de Bacillus licheniformis que inhibió la limitación del tratamiento con L-asparaginasa en la LLA
formación de poliacrilamida en solución de acrilamida al es el rápido desarrollo de la resistencia clínica, ya sea
10% y redujo la formación de acrilamida en papas fritas debido al rápido aclaramiento de la L-asparaginasa por
en un 80%. Además, la L-asparaginasa termófila un mecanismo inmunológico, o la síntesis activa de la L-
recombinante de Thermococcus kodakarensis KOD1 asparagina que conduce a un suministro suficiente del
mostró una reducción en los contenidos de acrilamida en aminoácido necesario para la célula. supervivencia. En
la masa horneada se redujo a sesenta por ciento después las células leucémicas humanas, la resistencia está
del tratamiento con TkAsn recombinante en relacionada, al menos en parte, con la actividad sintetasa
comparación con el control no tratado (Hong et al., de la asparagina, donde hay un aumento de siete veces
2014). El impacto de la acrilamida en las potencias en la actividad sintetasa de la asparagina cuando se
neurológicas y el efecto mitigador de la L-asparaginasa administró la asparaginasa como tratamiento (McCredie
se demostró de manera eficiente utilizando C.elegans et al., 1973).
como modelo animal al estudiar el efecto de la
exposición a la acrilamida sobre la capacidad La última década ha conducido a una comprensión más
quimiotáctica de los nematodos. Este estudio demostró profunda de la comprensión molecular de la razón de la
la aplicabilidad de la L-asparaginasa y la necesidad de la sensibilidad de la LLA al tratamiento con L-asparaginasa.
mitigación de acrilamida (Shakambari et al., 2017). Por La translocación t (12; 21) que resulta en la fusión del
lo tanto, la L-asparaginasa encuentra una aplicación en la gen TEL / AML1 está presente en aproximadamente el
industria alimentaria para prevenir la acumulación de 25% de los pacientes con leucemia linfoblástica aguda
acrilamida (Fig. 3). pediátrica (LLA) pediátrica de precursor B, que puede
causar sensibilidad a la L-asparaginasa sola, en dosis que
14. APLICACIÓN DE LA L-ASPARAGINASA COMO aseguran Completar el agotamiento de la asparagina
RÉGIMEN DE TERAPIA DEL CÁNCER. (Woerden et al., 2000).

Los efectos anti linfoma de la L-asparaginasa se han Por lo tanto, la L-asparaginasa está actualmente
informado desde 1968 (Broome, 1968). Las células disponible para el tratamiento en tres formas, a saber, la
cancerosas, principalmente de origen linfoide, requieren L-asparaginasa nativa de Escherichia coli (asparaginasa
de E. coli), una forma PEGilada (PEG: polietilenglicol) de 15. INMOVILIZACIÓN Y FORMULACIÓN DE L-
L-asparaginasa (PEG-asparaginasa) y L- asparaginasa de ASPARAGINASA PARA AUMENTAR LA EFICACIA.
Erwinia chrysanthemi (asparaginasa de Erwinia). E. coli
asparaginasa o PEGasparaginasa se usa como La inmovilización de la L-asparaginasa se realiza con la
tratamiento de primera línea de la LLA infantil en los perspectiva de aumentar su vida media, disminuir las
protocolos de tratamiento actuales y Erwinia reacciones inmunológicas y la eficiencia. El uso de la
asparaginasa se adoptó en los protocolos europeos y técnica de mutagénesis dirigida al sitio seguida por el
estadounidenses para tratamientos de segunda o tercera acoplamiento covalente del éster N-hidroxisuccinimida
línea (Zuo et al., 2015). Hasta la fecha, la L-asparaginasa de succinato de metoxipoli (etilenglicol) a L-
sigue siendo prospectiva en el tratamiento de muchas asparaginasa de E. carotovora mostró una mejor
neoplasias malignas debido al mecanismo de resistencia a la tripsina y una mayor termoestabilidad.
agotamiento de la acumulación de L-asparagina en las
Kotzia y Labrou inmovilizaron la L-asparaginasa
células que conduce a la muerte celular (Shrivastava et
recombinante de E. chrysanthemi 3937 en Sefarosa CL-
al., 2016).
6B activada con epoxi, que exhibió alta estabilidad a 4 ° C
Investigaciones recientes sobre el mecanismo de acción (Kotzia y Labrou, 2011). Zhang et al. (2008), idearon un
de la L-asparaginasa por agotamiento de la asparagina método para preparar nanopartículas de fibroína de
revelaron que una nueva variante de baja L-glutaminasa seda y L-asparaginasa inmovilizada mediante
que se desarrolló en la columna vertebral de la L- reticulación con glutaraldehído. Además, Zhang et al.
asparaginasa aprobada por la FDA de Erwinia (2011) publicaron otra novela y un método para
chrysanthemi fue altamente eficaz contra la T de todas procesar nanopartículas de fibroína de seda cristalina
las células T y B. mientras que muestra características fina que albergan bio-conjugados de L-asparaginasa en
reducidas de toxicidad aguda. Estos resultados allanan el presencia de solventes orgánicos. Mientras que las
camino para el desarrollo de una nueva generación de nanopartículas de óxido metálico sufren las desventajas
Lasparaginasas sin actividad de L-glutaminasa para un de la toxicidad aguda a veces, los bio-conjugados de
tratamiento más seguro de la LLA humana (Nguyen et al., ácido graso L-asparaginasa mostraron aplicabilidad para
2018). la administración intravenosa de L-asparaginasa, se
evaluaron y se encontró que su cinética era mejor que la
L-asparaginasa nativa. . Además, esta forma modificada
de enzima ha mejorado la vida media biológica, ha
anulado la toxicidad aguda y ha preservado la actividad
antitumoral incluso cuando se probó in vivo con
respecto a la L-ASNasa nativa (Ashrafi et al., 2013). La
Tabla 7 enumera los métodos para la inmovilización de
la L-asparaginasa.

Fig. 3. Aplicación de la L-asparaginasa en la industria alimentaria para la mitigación de la acrilamida, que se forma
espontáneamente durante la cocción y la exposición a altas temperaturas.
16. PERSPECTIVA FARMACÉUTICA Y CLÍNICA DE LA disminuir la inactivación silenciosa de pegaspargase (Pui
TERAPIA ACTUAL CON LASPARAGINASA. et al., 2018).

Biobetter o biosuperior es un término genérico, para Como justificación de la sugerencia, se evidenció la


referirse a los productos biológicos de valor agregado, quimioterapia con tratamiento con Dexamethasone,
representa una ventaja de un mecanismo establecido de Methotrexate, Ifosfamide, L-Asparaginase y Etoposide
acción, seguridad y perfil de eficacia de un biológico seguida de radioterapia para el linfoma natural killer / T
conocido. Tal bio mejor aprobada para la L-asparaginasa en estadio temprano con invasividad de tumores local
es el Oncaspar aprobado por la FDA, para el tratamiento como protocolo tolerable con eficacia. sin mortalidad
de pacientes con leucemia aguda hipersensibles a la (Gupta et al., 2018).
asparaginasa. Este Oncaspar es una L-asparaginasa
derivada de E. coli conjugada covalentemente con En una nota similar, una nueva terapia de inducción
monometoxi polietilenglicol (mPEG) para reducir la llamada Tandem HiCHOP-LA que involucró la
frecuencia de dosificación una vez cada 2 semanas y administración de ciclofosfamida por vía intravenosa los
también reducir la incidencia de reacciones de días 2 y 23; daunorubicina por vía intravenosa los días 3,
hipersensibilidad en los pacientes (Singh, 2017). 4, 24 y 25; vincristina por vía intravenosa en los días 1, 8,
15 y 22; L-asparaginasa intravenosa o intramuscular los
Pegcristantaspase, una asparaginasa PEGilada días 8, 10, 12, 15, 17, 19, 22, 24 y 26; prednisolona por
recombinante de Erwinia con farmacocinética mejorada, vía oral en los días 7–28; y metotrexato, citarabina y
fue desarrollada para pacientes con hipersensibilidad a prednisolona por vía intratecal en los días 1 y 21 a
la pegasparie, sin embargo, cuando los pacientes adolescentes y adultos jóvenes con pacientes con LLA
pediátricos con LLA o linfoma linfoblástico e negativos para Filadelfia, y fue seguido por un trasplante
hipersensibilidad a la pegaspase, recibieron pegrosis de sangre de cordón umbilical (TCC). El estudio informó
sexual en el Children's Oncology Group, una serie de que todos los pacientes lograron una remisión completa
011), los resultados mostraron una inmunogenicidad y procedieron a un trasplante de sangre de cordón
preexistente contra el resto PEG de pegaspargase que umbilical sin casos de mortalidad observada o
condujo a hipersensibilidad a la manifestación de recurrencia (Kojima et al., 2018).
pegcrisantaspase y un rápido aclaramiento de la
actividad de asparaginasa sérica. Esto plantea la cuestión En conclusión, se puede percibir que la L-asparaginasa
de si la PEGilación puede ser una estrategia efectiva para es un candidato eficaz en un régimen de tratamiento
optimizar la administración de la asparaginasa de para enfermedades malignas del sistema linfático. Esta
Erwinia (Rau et al., 2018). revisión sostiene, por lo tanto, que los estudios
microbiológicos, biológicos y biológicos y clínicos
Las revisiones recientes sobre este tema para abordar realizados hasta el momento dejan una enorme
los problemas asociados con la hipersensibilidad búsqueda para que los investigadores exploren para
sugieren que la asparaginasa nativa de E. coli se debe descubrir una posible fuente de organismo de L-
usar en pacientes sin anticuerpos anti-asparaginasa y asparaginasa, una estrategia de producción más
pegcrisantaspasa para aquellos sin anticuerpos contra económica y rentable mediante la utilización de
PEG, sin embargo, el uso de fármacos inmunosupresores desechos, la optimización estadística y Preparación
adicionales que preceden la administración de biocompatible para liberación sostenida y estabilidad
pegasparga , estaba garantizado para reducir la aumentada de la enzima. Estas estrategias hacen que la
frecuencia de las reacciones de hipersensibilidad o L-asparaginasa sea un candidato rentable, confiable y
competente para la aplicación farmacéutica.

Fig. 4. Modo de citotoxicidad de la L-asparaginasa en células cancerosas.


Tabla 7 Inmovilización de L-asparaginasa microbiana Fuente: (Zuo et al., 2015).

Fuente microbiana de la L-asparaginasa.

Método de preparación

Acoplamiento covalente de metoxipol (etilenglicol) succinato éster N-hidroxisuccinimida


Sefarosa CL-6B activada con epoxi reticulado
Nanopartículas de fibroína de seda que reticulan glutaraldehído
Inmovilizado por nanofibra de polianilina.
Albúmina de suero bovino, ovoalbúmina por reticulación usando glutaraldehído, N-bromosuccinimida y
monometoxioxietilenglicol

EXPRESIONES DE GRATITUD

Los autores agradecen a la Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería (SERB), Departamento de Ciencia y Tecnología,
India (Ref. No SB / EMEQ-128/2013), la Comisión de Subvenciones Universitarias UGC India-17-06 / 2012 (i) EUV, DST -
PURSO y UGC - SAP y UGC UPE para el apoyo financiero.