Departamento de Ciencias Analíticas

MÉTODOS DE SEPARACIÓN EN QUÍMICA ANALÍTICA

Pruebas de Evaluación Continua 2017/2018

PRIMERA PRUEBA DE EVALUACIÓN

CUESTIONARIO DE RESPUESTA

TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS: CG Y HPLC

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Presentación

La presente prueba de evaluación continua (PEC) pretende profundizar y

trabajar los contenidos desarrollados en la asignatura.

Estas actividades son obligatorias para los estudiantes que opten por la
evaluación continuada.

Aquellos estudiantes que decidan NO REALIZAR las Pruebas de

Evaluación Continua (PEC), deberán comunicarlo al inicio del curso al
Equipo Docente de la Sede Central. En el caso de que no entreguen la
primera PEC en el plazo fijado, el Equipo Docente entenderá que el
estudiante renuncia a este tipo de evaluación.

Para la realización de las pruebas de evaluación continua, el estudiante

encontrará dos documentos: el Enunciado de la actividad (en formato pdf),
que recoge objetivos, fundamentos y orientaciones, y el Cuestionario de
respuesta. Este segundo documento debe ser cumplimentado por el
estudiante y enviado a través de la plataforma virtual aLF antes de la fecha
fijada para su entrega. El cuestionario de respuesta deberá ser enviado en
formato pdf.

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PEC 1 Técnicas cromatográficas: CG y HPLC

ACTIVIDAD 1: Cromatografía de elución en columna

En el laboratorio virtual del profesor Maxwell se llevará a cabo una elución en

columna (http://www.ncbionetwork.org/iet/chromatography/).
Para ello se preparará una disolución de sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) disolviendo
3,19 g de este producto en 20 mL de agua desionizada. También se preparará una
disolución de ácido clorhídrico 5 M añadiendo 30 mL de HCl al 37,3% a 60 mL de
agua. También la resina que rellena la columna debe ser preparada. Posteriormente
se rellena la columna cromatográfica utilizando la bomba de vacío y se lava la resina
con agua desionizada. Una vez preparada la columna se inicia el experimento.

a) Antes de realizar la actividad revise el mapa conceptual de la U.D. 1 y

realice el cuestionario y los problemas que encontrará en la plataforma
aLF para esta Unidad. Refleje la puntuación obtenida en cada apartado y
comente sus principales dificultades.

Cuestionario........ 88%


Problema 1 ..........100%


Problema 2...........100 %

Problema 3...........100%

Problema 4...........100%

Problema 5...........100%

b) Entre en el laboratorio virtual del profesor Maxwell y realice el

experimento siguiendo las indicaciones dadas. Responda las siguientes
cuestiones:

1. ¿En qué consiste el experimento que ha realizado, de qué tipo de

cromatografía se trata?

2+
Mediante cromatografía de intercambio iónico, se va a separar los iones Cu
de una disolución de CuSO4 utilizando HCl en concentración 5 M como
eluyente.

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PEC 1 Técnicas cromatográficas: CG y HPLC

2. Explique de forma esquemática en qué consiste el ensayo completo

(tal y como si se tratase de su cuaderno de laboratorio, fíjese en el
que se proporciona en la propia aplicación).

- Preparar una disolución de sulfato de cobre ( CuSO4 ) añadiendo 3,19 g a

20 mL de agua desionizada.

- Preparar 60 mL de HCl 5M añadiendo 30 mL de HCl al 37,7 % a 30 mL de

agua desionizada.

- Añadir la resina a la columna usando un embudo.

- Lavar la columna con agua hasta que se alcance un pH aproximado de 5.

- Cambiar el vaso situado al final de la columna por otro limpio.

- Añadir 5 mL de CuSO4 (verde) en la columna.

- Lavar con agua hasta que el CuSO4 deje de bajar por la columna, la
resina restante desaparece.

- Añadir despacio 20 mL de la solución de HCl hasta que el menisco de

agua esté a punto de desaparecer de la columna. El CuSO4 debe quedar
debajo y el HCl encima.

- Lavar con HCl hasta que la banda verde es recogida totalmente. Recoger
el vaso que contiene el CuSO4.

- Lavar con agua desionizada hasta que el volumen de la columna haya

eluido.

3. Haga un dibujo esquemático del montaje utilizado.

c)

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PEC 1 Técnicas cromatográficas: CG y HPLC

4. Responda a las preguntas que realiza el Profesor Maxwell en el cuaderno de

laboratorio e inclúyalas en este apartado.

¿ Qué se observa en la columna antes de añadir el CuSO4?

Al añadir el sulfato aparece una banda verde que queda encima de la resina. Al
lavar con agua, el CuSO4 baja hasta aproximadamente la mitad de la columna.
La resina desaparece.

¿Qué se observa en la columna al añadir el HCl?

El HCl ( eluyente) queda arriba con color amarillo, CuSO4 baja hasta el final de
la columna.

¿Qué se observa en la columna desde que se añade el agua desionizada hasta

el final?

Se recoge la resina restante en un vaso. La columna queda limpia.

Observaciones generales del experimento.

La finalidad de este experimento es proporcionar práctica en las técnicas de

intercambio iónico empleando iones coloreados que pueden observarse a
simple vista.

d) Responda a las cuestiones de respuesta múltiple que aparecen al final del

experimento, en la siguiente sección, e inclúyalas en este apartado.
Indique la puntuación obtenida.

1. La cromatografía de filtración en gel separa las partículas en base a su:


a) tamaño b) Peso c) densidad d)Viscosidad

2. En cromatografía de filtración en gel, las partículas más pequeñas eluyen:

a) más despacio que las mayores  b) igual que las mayores

c) más rápido que las mayores d) a mayor T que las mayores

3. La cromatografía se usa para:

a) purificar productos  c) cambiar el pto. de fusión

b) secar materiales
 d) cambiar el pto. de ebullición

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PEC 1 Técnicas cromatográficas: CG y HPLC

4. La cromatografía de afinidad es específica por:

a) para cada producto ✔ b)por el peso molecular

c) por la densidad d) por el tamaño

5. En este procedimiento, la banda del material era:


a) roja b) verde ✔ c) azul d) amarilla

6. ¿Qué se usa para eluir el producto de la columna en este procedimiento?

a) CuSO4 b) HCl ✔ c) Agua desionizada d) Aire

7. ¿Cúal no es un tipo de cromatografía?

a) Afinidad b) Lyophitizacion ✔ c) Intercambio iónico d) Filtración en gel

8. La cromatografía de intercambio iónico separa las moléculas en base a:


a) tamaño b) viscosidad c) densidad d) carga ✔

9. ¿Cuál no es un aparato usado en cromatografía?


a) compresor ✔ b) columna c) resina d) bomba

10. ¿Cuál es la mayor ventaja de la filtración en gel?

a) cambia la densidad de la partícula b) modifica las partículas

c) hace decrecer la pureza de la partícula

d) no interfiere con la actividad biológica.✔

Puntuación 100

e) Defina brevemente los siguientes términos: elución, fase móvil, fase

estacionaria, coeficiente de distribución, tiempo de retención, factor de
retención, factor de selectividad, eluyente.

Elución: transporte de una especie a través de una columna por la adición

continua de una fase móvil.

Fase móvil: gas, líquido o fluido supercrítico que permite desplazar la muestra a
través de la columna.

Fase estacionaria: sustancia fija en una posición durante la cromatografía.

Coeficiente de distribución: cociente entre la concentración molar del soluto en

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PEC 1 Técnicas cromatográficas: CG y HPLC

la fase estacionaria y su concentración molar en la fase móvil.

Tiempo de retención: tiempo que transcurre después de la inyección de la

muestra hasta que el pico de concentración del analito alcanza el detector.

Factor de retención: parámetro utilizado para describir las velocidades de

migración de los solutos en las columnas.

Factor de selectividad: término que define cuánto selectiva es una columna

para separar dos picos.

Eluyente: fase móvil adicional que se introduce en la columna para transportar

componentes de una mezcla a través de la fase estacionaria.

f) Describa el problema general de la elución.

Cuando se trabaja con mezclas de varios componentes , los picos obtenidos en

los cromatogramas pueden aparecer tras demasiado tiempo, con picos muy
ensanchados, o muy agrupados, dificultando su identificación.

Por ello, es frecuente cambiar las condiciones que determinan los valores de
factor de retención mientras tiene lugar la separación. Estos cambios se
pueden realizar por etapas o de forma continua.

En cromatografía de líquidos, las variaciones de k se obtienen por variaciones n

la composición de la fase móvil durante la elución ( elución con gradiente o
programación del disolvente). En cromatografía de gases, el incremento de la
temperatura ( programación de la temperatura) permite conseguir las
condiciones óptimas para las separaciones.

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PEC 1 Técnicas cromatográficas: CG y HPLC

ACTIVIDAD 2: Cromatografía de gases

La cromatografía de gases es una técnica de separación de mezclas complejas. Los

compuestos presentes en un líquido volátil o solutos gaseosos son aislados después
de pasar a través de la columna gracias a su diferente tamaño o interacción
intermolecular.
El tiempo de retención puede identificar el componente de la muestra. Diferentes
factores condicionan el tiempo de retención. Los compuestos más volátiles
(compuestos con bajo punto de ebullición) se mueven más rápidamente a través de la
columna porque fluyen en la fase móvil y no interaccionan fuertemente con la fase
estacionaria. También los grupos funcionales presentes en el compuesto condicionan
el tiempo de retención. Por ejemplo, los alcoholes son capaces de formar puentes de
hidrógeno. El peso molecular de los compuestos también juega un papel importante,
pues el mayor peso molecular hace que el paso a través de la columna sea más
lento.

a) Antes de realizar la actividad revise el mapa conceptual de la U.D. 2 y realice

el cuestionario que encontrará en la plataforma aLF para esta Unidad. Refleje
la puntuación obtenida en cada apartado y comente sus principales
dificultades.
Cuestiones 93%

b) En el presente ejercicio se realiza la detección cromatográfica de una mezcla

de metanol, propilacetato, butilacetato, 2-butanona y 4 metil-2-pentanona,
obteniéndose el siguiente cromatograma:

Complete la siguiente tabla y prediga el tiempo de retención de los distintos

compuestos.

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PEC 1 Técnicas cromatográficas: CG y HPLC

Punto de Peso molecular Grupo tR

Compuesto
ebullición (C) (g/mol) funcional (min)

Metanol 64,7 32,04 Alcohol 6,8

Propil acetato 102,13 102 Éster 2,2

Butil acetato 126,1 116,16 Éster 1,4

2-Butanona 80 72,11 Cetona 5,0

4-Metil-2-pentanona 117 100,2 Cetona 3,5

c) La separación analítica de tres ésteres se representa en el siguiente

cromatograma.

Se ha llevado a cabo en una columna GLC en las siguientes condiciones de

trabajo:
Columna: 1,10 m x 2,0 mm rellena con Chromosorb P
Peso de fase estacionaria líquida añadida 1,40 g
Densidad del líquido 1,02 g/mL.
Presiones: entrada 26,1 psi por encima de la atmósférica, P atmosférica: 748
torr
Caudal de salida: 24,3 mL/min.
Temperaturas: ambiente, 21,2ºC; columna 102,0ºC
Tiempos de retención: aire, 18,0 s; acetato de metilo, 1,98 min; propionato de
metilo, 4,16 min; n-butirato de metilo, 7,93 min.

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PEC 1 Técnicas cromatográficas: CG y HPLC

Anchura de pico en su base de los ésteres, respectivamente: 0,19; 0,39 y

0,79 min.
Calcular:
• El caudal promedio de la columna.
• Los volúmenes de retención netos para el aire y para los tres ésteres.
• Los volúmenes de retención específicos para los tres componentes.
• Los coeficientes de distribución de cada uno de los ésteres.
• El volumen de retención neto y el tiempo de retención para el n-
hexanoato de metilo.

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PEC 1 Técnicas cromatográficas: CG y HPLC

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PEC 1 Técnicas cromatográficas: CG y HPLC

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PEC 1 Técnicas cromatográficas: CG y HPLC

d) ¿Cuál será en los siguientes casos el efecto sobre la altura de plato de una
columna? Justificar la respuesta.
▪ Al aumentar el peso de la fase estacionaria en relación al peso del
relleno.

El aumento de Vs/VM conduce a un aumento en el espesor de la película. A

su vez, esto provoca un aumento en el término Csu y, por tanto, en la altura
del plato.

• Al disminuir la velocidad de inyección de la muestra.

Provocará una ampliación de la banda porque todas las moléculas no

comienzan a atravesar la columna en el mismo instante. Se produce una
reducción en la capacidad y un aumento en H.

• Al aumentar la temperatura del bloque de inyección.

Tenderá a disminuir H debido a que la velocidad de evaporación aumenta.

• Al aumentar el caudal.

Puede aumentar o disminuir H, dependiendo de la velocidad del flujo.

• Al reducir el tamaño de partícula del relleno.

Esta reducción aumenta el tamaño de la superficie y , por tanto, disminuye el

espesor de la película. Una disminución en el tamaño de las partículas también
hace que el término CMu se haga más pequeño. Ambos efectos conducen a una
altura plato más pequeño.

• Al disminuir la temperatura de la columna.

En la mayoría de los casos, H aumenta a medida que la temperatura disminuye.

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PEC 1 Técnicas cromatográficas: CG y HPLC

ACTIVIDAD 3: Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC)

La cromatografía líquida de alta resolución es una cromatografía en fase líquida en

columna a la cual se aplica una sobrepresión que permite acelerar el proceso de
separación. Es considerada la técnica analítica de separación más ampliamente
utilizada.
Sus grandes ventajas se centran en su sensibilidad, su facilidad para realizar
determinaciones cuantitativas y su idoneidad para la separación de especies no
volátiles o termolábiles, así como su gran aplicabilidad a compuestos de gran
importancia e interés en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la
sociedad en general.

a) Antes de realizar la actividad revise el mapa conceptual de la U.D. 3 y realice

el cuestionario y los problemas que encontrará en la plataforma aLF para
esta Unidad. Refleje la puntuación obtenida en cada apartado y comente sus
principales dificultades.

Cuestiones 100%

b) Mediante la cromatografía de líquidos de alta resolución, HPLC, se consigue

separar tres compuestos dados, A, B y C, empleando una columna cuya
longitud es de 24.7 cm. Se dispone de los siguientes datos:

Especie Tiempo de retención Anchura de la base de pico

(min) (min)
A 5.4 0.41
B 13.3 1.07
C 14.1 1.16
No retenida 3.1 --

Se obtiene el siguiente cromatograma:

mAU

A B
C

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PEC 1 Técnicas cromatográficas: CG y HPLC

Calcular:

1. El factor de capacidad para cada pico.

2. El factor de selectividad.
3. La altura del plato de la columna.
4. La resolución de la columna.

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PEC 1 Técnicas cromatográficas: CG y HPLC

c) El área del pico correspondiente al compuesto B es de 29.3 mm2 después de

haber realizado una dilución 1:5 de la muestra inicial. Conociendo los
resultados correspondientes al análisis de 5 disoluciones estándar de B a
diferentes concentraciones que se recogen en la siguiente tabla, calcular la
concentración de este compuesto en la muestra inicial.

CB (mgL-1) Blanco 1 2 3 4 5
Área pico (mm2) 0 19.7 39.9 61.0 80.5 98.7

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PEC 1 Técnicas cromatográficas: CG y HPLC

d) Las alturas de pico en una muestra que contiene las especies A y C son de
56 y 40 unidades, respectivamente. En idénticas condiciones analíticas, un
estándar de A de 0.5 mgL-1 produce un pico de 93 unidades, y un estándar
de C de 0.3 mgL-1 produce un pico de 98 unidades. ¿Podría predecir la
concentración de ambos compuestos en la muestra?

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