Manual de Laboratorio

Universidad de San Carlos de Guatemala
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia

Escuela de Química Farmacéutica
Departamento de Farmacognosia y Fitoquímica
Manual de Laboratorio de
FITOQUÍMICA 2020
Dra. Sully Margot Cruz Velásquez

Licda. Lesbia Mengala Guerra Urizar
Br. Lesli Pahola Ramírez Duarte
ÍNDICE
1. 1
2. 5
3. 6
4. 7
5. 8
7. 10
PRÁCTICA NO. 1 “Obtención de Extractos Naturales” 12
PRÁCTICA NO. 2 “Investigación de Alcaloides en Corteza de Quina o Raíz de Ipecacuana” 18
PRÁCTICA NO. 3 “Investigación de Cumarinas en Pericón o Canela” 21
PRÁCTICA NO. 4 “Investigación de Aceites Volátiles en Hojas de Canela y Evaluación de la
Actividad Citotóxica” 24
PRÁCTICA NO. 5 “Investigación de Taninos y/o Compuestos Fenólicos en Corteza de Encino”
30
PRÁCTICA NO. 6 “Investigación de Flavonoides en Hojas de Ruda y Tilof” 34
PRÁCTICA NO. 7 “Investigación de Antraquinonas en Raíz de Ruibarbo” 38
PRÁCTICA NO. 8 “Investigación de Principios Amargos en Hojas de Salvia y Extracción de
Bixina en Semillas de Achiote” 40
PRÁCTICA NO. 9 “Investigación de Saponinas en Zarzaparrilla y Caléndula” 44
7. 47
8. 48
Anexo No. 1.“Diagrama gráfico de Cromatografía en Capa Fina” 48
Anexo No.2 “Resumen Guía APA” 49
Anexo No.3 “Servicios de Emergencia” 53
1. PROGRAMACIÓN DE PRÁCTICAS
Domingo Lunes Martes Miércoles Jueves Viernes Sábado
29 30 1 2 3 4
JULIO
5 6 7 8 9 10 11
12 13 14 15 16 17 18
Instrucciones Generales del
Laboratorio
19 20 21 22 23 24 25
Práctica No. 1 Obtención de
Extractos Naturales.
26 27 28 29 30 31 1
Práctica No. 2 Investigación
de Alcaloides en Corteza de
Quina o Raíz de Ipecacuana.
Manual de Fitoquímica, 2020

1
2 3 4 5 6 7 8
Práctica No. 3 Investigación de
Cumarinas en Pericón o
Canela.
9 10 11 12 13 14 15
Aceites Volátiles en Hojas de FERIADO DÍA
Menta y Evaluación de DE LA
Actividad Citotóxica ASUNCIÓN
16 17 18 19 20 21 22
taninos y/o compuestos
fenólicos en corteza de encino
23 24 25 26 27 28 29
Planta Piloto: Extracción de
aceites esenciales
30 31
1° PARCIAL (Práctica 1 a 5)

AGOSTO
Flavonoides en Hojas de Ruda
y Romero
Manual de Fitoquímica, 2020 2

1 2 3 4 5
SEPTIEMBRE
6 7 8 9 10 11 12

de Antraquinonas en raíz de
Ruibarbo
13 14 15 16 17 18 19
ASUETO POR EL DÍA
CII ANIVERSARIO DE LA
DE LA INDEPENDENCIA
FACULTAD
DE GUATEMALA
20 21 22 23 24 25 26
ACTO ACADÉMICO POR VIII CONGRESO DE LA ESCUELA DE QUÍMICA
CII ANIVERSARIO DE LA FARMACÉUTICA
FACULTAD DÍA MUNDIAL DEL
QUÍMICO FARMACÉUTICO
27 28 29 30

de Principios Amargos en
Hojas de Salvia y Extracción
de Bixina en semillas de
Achiote

1 2 3
OCTUBRE
4 5 6 7 8 9 10
de Saponinas en Zarzaparrilla
y Caléndula
11 12 13 14 15 16 17
2° PARCIAL
(Práctica 6 a 9)
Trabajo de Integración
18 19 20 21 22 23 24
Trabajo de Integración
ASUETO POR EL DÍA
DE LA REVOLUCIÓN
25 26 27 28 29 30 31
Entrega de Trabajo de
Integración

2. INSTRUCCIONES GENERALES DEL LABORATORIO DE
FITOQUÍMICA
1. Las prácticas de laboratorio cubrirán los cuatro aspectos siguientes: ensayos físicos para
identificación de sustancias, métodos cromatográficos para caracterización de plantas, ensayos
para extracción de materiales vegetales y para cuantificación de principios activos. El desarrollo
de las prácticas será en el orden antes mencionado, y de acuerdo a la planificación
correspondiente.
2. De la organización del laboratorio
2.1. Grupos de trabajo: los estudiantes se integrarán en grupos de tres o cuatro miembros
cada uno (según indique el instructor de laboratorio), los cuales serán responsables de
trabajar las prácticas asignadas, elaborar los informes respectivos, cuidar del material y
equipo de laboratorio que se les proporcione.
2.2. Días y hora de práctica: cada grupo realizará las prácticas correspondientes,
únicamente en el horario asignado. Se pondrá especial atención en la evaluación de la
puntualidad, tanto de ingreso como de egreso del laboratorio.
3. De la zona
El porcentaje de zona que corresponde al laboratorio es de 28.6%, es decir 20 puntos de 70,

distribuidos de la siguiente forma:
Reportes 8 pts.
Exámenes cortos 8 pts.
Exámenes parciales (2) 2.5 pts. (1.25 c/u)
Diagramas de flujo 1.5 pts.
TOTAL 20 Puntos

3. INSTRUCCIONES PARA ELABORAR REPORTES DE
LABORATORIO
Los informes de laboratorio se entregarán una semana después de efectuada la práctica, antes de
entrar al laboratorio. NO SE ACEPTARÁN INFORMES DESPUÉS DE LA FECHA CALENDARIZADA.
Serán escritos en base al formato que se proporcionará en el laboratorio, tamaño carta, en
computadora.
Los informes deberán incluir:
● INTRODUCCIÓN: (10 pts.)

Una breve descripción de la práctica y los aspectos más importantes.
● RESULTADOS: (25 pts.)

Se deben presentar los resultados de los experimentos en forma descriptiva o en tablas. Para el
caso de análisis cromatográficos, se deben de tabular los Rf’s y adjuntar la cromatoplaca en
anexos. Debe evitarse describir procedimientos y es necesario citar todas las tablas.
● DISCUSIÓN DE RESULTADOS: (30 pts.)

Se analizarán los resultados obtenidos, comparándolos con los probables, de acuerdo con la
información obtenida a partir de la literatura debidamente citada. Se deben discutir los factores
que expliquen los resultados encontrados.
● CONCLUSIONES: (15 pts.)

Se presentan las deducciones obtenidas de los resultados y de la discusión de los mismos. En
base a ellos se concluirá si el material vegetal analizado contiene los metabolitos secundarios
característicos de la especie, y si por lo tanto cumple con el requisito mismo de identidad,
indispensable para su comercialización.
● REFERENCIAS: (10 pts.)

Anotar los libros utilizados. Su presentación se debe hacer de acuerdo a la guía APA (American
Psychological Association) de la Facultad de C.C.Q.Q. y Farmacia.
● ANEXOS: (10 pts.)

Los anexos deben incluir la cromatoplaca realizada durante la práctica. Además pueden agregar
información sobre avances científicos que posee la especie en mención.
Pueden incluir un resumen de las metodologías analíticas de las plantas utilizadas según:
USP Herbal Medicines Compendium:
https://hmc.usp.org/monographs/all
American Herbal Products Association:
http://www.botanicalauthentication.org/index.php/Main_Page

Se incluirán las características propias de las plantas analizadas y su contenido de metabolitos
secundarios, según el siguiente formato:
4. FORMATO MONOGRAFÍA
Nombre común de la planta (Nombre científico)
1. SINÓNIMOS:
Se debe colocar los diferentes sinónimos de la especie

en mención.
FOTO
2. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA:
Características botánicas de la especie (tamaño de

hojas, tallo, si posee flores, etc.)
3. HÁBITAT:
En qué lugar podemos encontrar la especie en Guatemala.
4. COMPOSICIÓN QUÍMICA
Contenido de metabolitos secundarios. (Comparar con resultados y discutir)
5. USOS POPULARES
Usos otorgados por la población.
6. BIBLIOGRAFÍA
Anotar el o los libros utilizados. Su presentación se debe hacer de acuerdo a la guía APA
(American Psychological Association) de la Facultad de C.C.Q.Q. y Farmacia.

5. TRABAJO DE INTEGRACIÓN DE LABORATORIO
Parte A. Afiche “Promoción de estilo de vida saludable”
Introducción
Como un complemento de la evaluación del laboratorio de Fitoquímica, se tiene
programado el tema “Promoción de estilo de vida saludable”, para ser desarrollada por
medio de actividades estudiantiles de investigación científico-bibliográfica y difusión de la
investigación a los diferentes sectores de la sociedad guatemalteca.
La temática está dirigida específicamente a jóvenes de edades comprendidas entre 10 a 18

años, sobre estilos de vida saludable, los cuales consisten en el desarrollo de habilidades y
actitudes de las personas para que tomen decisiones pertinentes frente a su salud, su
crecimiento y su proyecto de vida, y que aporten a su bienestar individual y al colectivo.
Objetivos: Que los estudiantes del curso de Fitoquímica, al desarrollar la unidad

programática del laboratorio logren:
General
Promover las especies vegetales que contribuyan a llevar un estilo de vida saludable,
abordándolo de forma integral con actividad física y disminución de malos hábitos.
Específicos
● Diseñar un afiche ilustrativo de las especies vegetales asignadas con información básica
y acorde a la población objetivo.
● Identificar los hábitos que no contribuyan a un estilo de vida saludable y que puedan
ser modificados para contribuir al objetivo general.
Calificación (1.5 puntos de zona)

Presentación y publicación de afiches de plantas con uso alimenticio y medicinal, en página
de la Escuela.
Debe incluir:
● Logo de la Universidad, Facultad y Escuela.
● Título
● Información de la especie vegetal debe incluir: Nombre común, nombre científico,
composición química de acuerdo al tema asignado, indicaciones, dosis y
precauciones.
● Diseño a discreción del grupo, imágenes con buena definición.
● Bibliografía (APA)
● Tamaño 45 x 60 cm

Parte B. Proyecto de Investigación
Temas de Investigación
Los trabajos serán presentados por grupos de trabajo de laboratorio correspondientes a los
días de práctica.
Las especies vegetales que deberán investigar serán asignados por sorteo.
Calificación (2 puntos de zona)

● Trabajo de laboratorio 25%
● Informe final escrito 70%
● Monografía de la planta 5% (Descripción botánica, Hábitat, Usos Medicinales,
Farmacología, Composición Química, Farmacognosia, Toxicología, Indicaciones
Terapéuticas, Referencias)
Fecha de entrega: según calendarización, se contará con dos semanas para la parte
experimental y la siguiente semana se deberá entregar el informe.

7. INTRODUCCIÓN A FITOQUÍMICA
En años recientes la fitoquímica, o química de las plantas, se ha desarrollado como una

disciplina distinta, íntimamente relacionada con la química de productos orgánicos de
origen natural y la bioquímica de plantas. Estudia la enorme variedad de sustancias
orgánicas que son elaboradas y acumuladas por las plantas, así como sus estructuras
químicas, su biosíntesis y metabolismo, su distribución y función biológica.
Para efectuar todas estas operaciones, es necesario contar con métodos para separación,
purificación e identificación de los diferentes componentes presentes en las plantas.
Muchas veces el problema consiste en encontrar la manera de desarrollar estos
procedimientos contando únicamente con cantidades sumamente pequeñas de material.
Es por ello importante, disponer de métodos suficientemente sensibles.
La importancia de la fitoquímica dentro de los estudios de farmacia resulta obvia, si se

considera que muchos de los compuestos activos presentes en los medicamentos
provienen de plantas. Algunos ejemplos son la digitoxina, papaína, morfina, codeína,
papaverina, atropina, escopolamina, quinina, quinidina, reserpina, ergotamina, ergonovina,
cocaína, vincristina, leucocristina, tubocurarina, efedrina, pilocarpina, colchicina, las cuales
poseen un amplio rango de actividades farmacológicas.
Es importante establecer la relación entre actividad biológica y constituyentes químicos

presentes en una planta, con el objeto de determinar sus constituyentes activos, lo cual
contribuirá a obtener información respecto a dosis y efectuar un adecuado control de
calidad de la planta. Por otro lado, el descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos puede
representar nuevas fuentes de ingreso económico. Una nueva estructura química aislada
de fuentes vegetales a menudo conduce al investigador a la obtención de una serie sucesiva
de compuestos semisintéticos modificados, los cuales pueden ser de utilidad medicinal o
comercial.
A través de las prácticas de laboratorio de fitoquímica se aplicarán distintos métodos de

tamizaje fitoquímico, para detectar aquellos compuestos generalmente responsables de
actividades farmacológicamente importantes, tales como alcaloides, aceites volátiles,
saponinas, taninos y polifenoles, flavonoides, antraquinonas, cumarinas y principios
amargos.

PREPARACIÓN DEL EXTRACTO PARA SELECCIÓN FITOQUÍMICA
GENERALIDADES:
Idealmente el análisis fitoquímico debería realizarse sobre tejidos vegetales frescos, y extraerse el
material recién colectado con alcohol, en caliente. Sin embargo, muchas veces la planta a estudiar
proviene de lugares distantes, o quizás fue colectada en otro continente. En tales casos la planta
debe ser secada antes de extraerse. Es esencial que la operación de secado se efectué bajo
condiciones controladas para evitar que ocurran cambios químicos en los constituyentes. Debe
secarse lo más pronto posible, evitando usar altas temperaturas, y preferiblemente con una
adecuada circulación del aire. Una vez desecadas, las plantas pueden ser almacenadas con mayor
seguridad. Sin embargo, durante el almacenamiento pueden ocurrir cambios cuantitativos en los
distintos componentes. Por ejemplo, los aceites volátiles tienden a disminuir con el transcurso del
tiempo. Por el contrario, se ha encontrado que los flavonoides y alcaloides presentes en
especímenes de herbario son bastante estables. Por ejemplo, una muestra de hojas de Strychnos
nuxvomica colectada en 1,675 fue analizada en 1,982 y aún contenía 1 a 2% en peso de alcaloides.
Debe cuidarse que el material vegetal bajo estudio se encuentre libre de contaminación con otra
planta. Asimismo, es esencial emplear plantas sanas, que no estén infectadas por virus, bacterias u
hongos. La razón de esto es que no sólo podrían detectarse productos de síntesis microbiana, sino
que además estas infecciones podrían alterar seriamente el metabolismo de la planta y formarse
productos inesperados, quizá en grandes cantidades.
Por otro lado, previo al estudio fitoquímico, debe asegurarse la identidad botánica de la planta, para
lo cual se deberá acudir a autoridades reconocidas en este campo. Con el objeto de evitar posibles
errores, se acostumbra depositar un espécimen de la planta a investigar en un herbario reconocido,
de manera que en caso necesario pueda hacerse referencia a la planta estudiada.
En cuanto al procedimiento de extracción depende de la textura y el contenido de agua de la planta,

así como el tipo de sustancia a aislar. En general, se acostumbra extraer con etanol o metanol, ya
que prácticamente todos los constituyentes de interés fitoquímico tienen cierta solubilidad en ellos.
Asimismo, la extracción con alcohol en caliente contribuye a prevenir la oxidación enzimática o
hidrólisis de los componentes de la planta. Cuando se desea aislar sustancias de tejidos verdes, la
eficiencia de la extracción con alcohol se relaciona directamente con la desaparición del color verde
en el solvente, luego de repetidas extracciones. Cuando esto sucede, se asume que todos los
compuestos de bajo peso molecular han sido extraídos.

PRÁCTICA NO. 1
“OBTENCIÓN DE EXTRACTOS NATURALES”
1. INTRODUCCIÓN:
Una extracción vegetal consiste en la obtención de los componentes activos de una planta a través
de técnicas específicas, utilizando para ello solventes apropiados para la extracción del
compuesto(s) de interés.
Antes de empezar un proceso extractivo en una escala piloto o industrial, se debe definir la
selectividad del solvente a ser usado en el proceso. Dependiendo del propósito al que se destine,
se puede obtener un extracto cuya composición química contiene la mayor parte de los
constituyentes químicos de la planta, o un extracto que contiene solamente constituyentes
químicos con una determinada característica.
El tipo de solventes para la extracción, y la permanencia en la composición química de la materia

vegetal, representan dos aspectos de suma importancia en cualquier proceso de fabricación de
productos fitoterapéuticos o de sustancias naturales aisladas.
Los solventes más usados en las industrias de productos fitoterapéuticos son: el agua, el alcohol
etílico, la glicerina, el propilenglicol y mezclas de estos líquidos.
● Variables del proceso extractivo:

✔ Estado de división de la droga
✔ Agitación
✔ Temperatura
✔ pH
✔ Naturaleza del solvente
✔ Tiempo de extracción
● Procesos de extracción.
Los procesos de extracción varían en función de la escala de producción, de la naturaleza y calidad
de la materia prima y de la naturaleza del solvente.
Los más comunes son:
✔ Maceración: consiste en poner en contacto la droga y el solvente, durante varios días.

Da como resultado un equilibrio de concentración entre la droga y el solvente.
✔ Percolación: consiste en hacer pasar el solvente a través de la droga, hasta su extracción
exhaustiva completa.
✔ Extracción contra corriente: consiste en que el solvente fluye en sentido contrario a la
dirección con que fluye la droga.
Luego de estos procesos, el extracto pasa por una clarificación, concentración y un secado.

Es importante mencionar que para llevar a cabo los procesos de extracción, se utiliza generalmente
la droga vegetal seca y en muy raras ocasiones se usa la droga vegetal fresca.
El tipo de producto fitoquímico depende de los solventes a utilizar. En la práctica se obtendrán 4

tipos de productos fitoterapéuticos intermediarios: Tinturas, extractos glicólicos, oleatos y enolados
(vino medicinal).
1.1 Rotavapor
El evaporador rotatorio o ROTAVAPOR, es un dispositivo que se utiliza para la eliminación eficiente

y suave de disolventes en sustancias a través de la evaporación, es decir que quita el solvente de
una mezcla o de un compuesto. También se utilizan para la preparación de destilados y extractos.
Fue inventado por Lyman C. Craig. Se comercializó por primera vez por la empresa suiza Büchi en
1957.
Es una variante de una destilación a presión reducida. Consiste en sujetar un matraz en una boca.
Una vez esto hecho, el aparato disminuirá la presión ejerciendo un vacío sobre el contenido del
matraz. Como es de esperarse, el punto de ebullición de la mezcla disminuye mucho. A veces el
punto de fusión disminuye tanto que el disolvente hierve a temperatura ambiente.
El disolvente extraído es enviado por un conducto hacia un circuito donde se enfriará. Muchos
utilizan rotavapores antiguos donde éste conducto es un tubo en espiral muy largo, y lo enfrían con
agua helada. Hay rotavapores que envían el solvente evaporado a una cámara donde entrará en
contacto con acetona y hielo seco; esta mezcla enfría cerca de los -70 °C. Aquí, evidentemente, el
solvente se condensará y pasará a un colector donde se podrá recuperar.
Finalmente, las fases quedan separadas: en el colector el disolvente y en el matraz los compuestos
sólidos que hubieran estado disueltos.
Los principales componentes de un Rotavapor son:
1. Una unidad de motor que hace girar el matraz de evaporación o el vial que contiene la muestra
del usuario.
2. Un conducto de vapor que es el eje de rotación de la muestra, y es un conducto de prueba de

vacío para el vapor que se extrae de la muestra.
3. Un sistema de vacío, para reducir sustancialmente la presión en el evaporador.
4. Una unidad de calefacción (baño maría) para calentar la muestra.
5. Un condensador, ya sea un serpentín refrigerante, o un "dedo frío" en los que se colocan las
mezclas el refrigerante como hielo seco y acetona.
6. Un frasco de recolección de condensado en la parte inferior del condensador, para atrapar el

disolvente destilado después de que se re-condensa.

7. Un balón contenedor del extracto del cual se extraerá el disolvente
1.2 Liofilizador
El secado en frío (liofilización) es un proceso importante en la preparación, conservación y

almacenamiento de muestras biológicas, farmacéuticas y alimenticias. De los distintos métodos de
deshidratación, el secado en frío (liofilización) es especialmente útil para sustancias que son
sensibles al calor.
La liofilización es un proceso en donde el agua u otro solvente es removido del material congelado
convirtiendo el agua congelada directamente a vapor. El principio de este proceso de sublimación
involucra la absorción del calor de la muestra congelada para vaporizar el hielo; el uso de vacío
mejora la eliminación de vapor de agua de la superficie de la muestra, la transferencia del vapor de
agua al colector y la eliminación del calor del colector para condensar el vapor de agua.
La eficiencia del proceso de liofilización depende del área de superficie y del grosor de la muestra,
la temperatura del colector y del vacío.

2. OBJETIVOS:
● Que el estudiante conozca los aspectos tecnológicos del procesamiento de las plantas
medicinales llevando a cabo técnicas de extracción específicas para la obtención de
productos naturales (maceración, rotavaporación).
● Que el estudiante obtenga el extracto natural en forma de tintura, extracto glicólico, oleato
y enolato.
● Que el estudiante lleve a cabo la liofilización (secado en frío) de muestras vegetales.
3. PROCEDIMIENTO:
3.1 Obtención de tintura de Pasiflora:

1. Pesar 10 gramos de material vegetal seco. Triturarlo.
2. Colocarlo en un frasco de vidrio limpio y seco.
3. Agregar 50 mL de alcohol al 95% (solvente de extracción).
4. Agitar.
5. Macerar por 7 días
6. Agitar con frecuencia.
7. Decantar el líquido exprimiendo suavemente el material vegetal.
8. Filtrarlo.
9. Medir la cantidad de extracto obtenido.
3.2 Obtención de extracto glicólico de Romero:

3. Agregar 100 mL de la mezcla de agua:propilenglicol:etanol (3:3:4) (solventes de
extracción)

4. Agitar.
8. Filtrarlo.
3.3 Obtención de enolado o vino medicinal de Quina:

3. Agregar 100 mL de vino tinto (medio de extracción).
4. Agitar.
8. Filtrarlo.
3.4 Obtención del oleato de Manzanilla:

3. Agregar 100 mL de aceite vegetal (medio de extracción).
4. Agitar.
5. Macerar por 7 días.
8. Filtrarlo.
3.5 Liofilización:
1. Antes de iniciar el proceso de liofilización, limpiar el interior de la cámara del colector
con un paño suave o una toalla de papel para eliminar la humedad acumulada en su
interior.
2. Verificar que el nivel de aceite de la bomba de vacío sea el adecuado, este debe
encontrarse en el marcador superior.
3. Verificar que la manguera de drenaje de la cámara del colector se encuentre conectada
e instalada. Además verificar que toda el agua acumulada en la cámara del colector haya
sido removida y eliminada de la manguera de drenaje.
4. Verificar que todas las válvulas de la cámara secundaria o llaves de paso estén cerradas
(la parte cóncava de la llave debe encontrarse en la parte opuesta al puerto conector
del contenedor de muestra).
5. Encender el equipo presionando el interruptor ubicado en el lado derecho de la cámara
del colector.
6. Presionar en la consola el botón de “auto”.
7. Oprimir el botón “vacum” para que el equipo empiece a generar vacío.
8. Anotar la hora en que inicia el proceso.

9. Esperar a que se establezcan (encendido de todas las luces) las curvas de temperatura
y de vacío.
10. Cuando las curvas se hayan establecido colocar el (los) contenedor(es) de muestra en
sus respectivos puertos.
11. Abrir la llave de la válvula con el lado cóncavo de la llave en dirección al contenedor de
muestra.
12. Anotar nuevamente la hora.
13. Con un paño limpiar el exceso de humedad de los frascos de liofilizador, esto ayudará a
que no se derrame agua sobre el equipo.
14. Esperar que transcurra el tiempo necesario para llevar a cabo completamente el
proceso de liofilización.
15. Antes de extraer los frascos del equipo, verificar la sequedad de la muestra. Para ello,
extraer solamente un frasco, introducir una espátula de metal y sacarla nuevamente,
verificar que no hayan partículas de muestra adheridas a ella, si este es el caso significa
que el proceso de liofilización se ha completado.
16. Si este no fuera el caso, dejar transcurrir cierto tiempo hasta que la muestra esté
completamente seca. Repetir la prueba para verificar la sequedad de la muestra.
3.6 Concentración de extracto con Rotavapor:

Trasegar (trasvasar) la tintura obtenida en la práctica No.1 a un balón de concentración de
rotavapor. Armar el equipo según le indique su instructor de laboratorio. Ajustar la presión
entre 175 mb (milibares), a una temperatura de 40°C. Ajustar el número de rotaciones por
minuto según sea necesario. Concentrar la mx a la mitad del volumen inicial. Trasvasar el
extracto a un cristalizador previamente tarado, y colocar dentro de la desecadora con sílica
gel y dejar por una semana, debidamente rotulado y empacado con aluminio perforado.
Trasvasar a un frasco el solvente recuperado.
Realizar cálculos:
% de rendimiento = (g) de extracto obtenido X 100%

(g) de material vegetal inicial
(utilizados en tintura)
(g) de extracto obtenido= (Peso cristalizador + mx) – (Tara cristalizador vacío)

PRÁCTICA NO. 2
“INVESTIGACIÓN DE ALCALOIDES EN CORTEZA DE QUINA
O RAÍZ DE IPECACUANA”
1. INTRODUCCIÓN:
Ciertos investigadores opinan que la selección inicial de plantas para posterior estudio fitoquímico
debería realizarse no solamente en base a la evidencia de una intensa actividad farmacológica, sino
además sobre la base de que dicha planta contiene cierta clase de compuestos químicos con los que
generalmente se encuentra asociada la actividad biológica de que se trate. Así, por ejemplo, algunos
investigadores seleccionarán inicialmente plantas que contienen alcaloides, tomando en cuenta
que: a) éstos generalmente ejercen algún tipo de actividad farmacológica, usualmente sobre el
sistema nervioso central; b) la gran mayoría de productos naturales usados en medicina son de
naturaleza alcaloidal; c) los ensayos para detectar este tipo de compuestos son simples, rápidos y
relativamente confiables; y d) debido a su naturaleza química los alcaloides son más fáciles de
manipular, siendo así su extracción y aislamiento menos problemáticos.
Los alcaloides representan los metabolitos secundarios más abundantes de las plantas. En la
actualidad se conocen aproximadamente 5,500 de ellos. No existe una definición del término
“alcaloide”, que sea del todo satisfactoria, pero en general puede afirmarse que son sustancias
básicas que contienen uno o más átomos de nitrógeno, que usualmente forma parte de un sistema
heterocíclico. Los alcaloides son frecuentemente tóxicos para el ser humano, y puesto que muchos
de ellos presentan marcada acción fisiológica, se emplean ampliamente en medicina. Son
generalmente incoloros, en muchos casos presentan actividad óptica; la mayor parte son cristalinos,
aunque unos pocos son líquidos a temperatura ambiente, como ocurre con la nicotina.
Desde el punto de vista químico, los alcaloides son un grupo muy heterogéneo, que va desde
compuestos simples como la coniína, el principal alcaloide de la cicuta, Conium maculatum, a la
estructura pentacíclica de la estricnina, presente en la corteza de Strychnos.
Los precursores más comunes de los alcaloides son aminoácidos, aunque muchos de ellos son de
naturaleza terpenoide, y algunos, como la solanina, alcaloide esteroidal de la papa, se consideran
desde el punto de vista biosintético como terpenoides modificados. Otros son principalmente
aromáticos, como la colchicina, alcaloide de los bulbos de Colchicum autumnale.
Puesto que los alcaloides se encuentran generalmente en las plantas como sales acuosolubles, la
extracción con agua en medio ácido podría permitir su detección al añadir reactivos precipitadores
de alcaloides. Sin embargo de esta manera se corre el riesgo de obtener un resultado positivo –
falso, debido a la presencia de sustancias interferentes tales como las proteínas, peptonas, purinas,
aminas metiladas, sales de amonio, glicósidos, carbohidratos, betaína, colina y taninos. Es por ello
necesario purificar el extracto previo a la adición de reactivo precipitante, alcalinizando y
extrayendo con un solvente orgánico inmiscible con el agua. Luego, puede empaparse un trozo de
papel filtro con la fase orgánica, secarse y asperjarse con un reactivo que detecte alcaloides
mediante coloración. Alternativamente puede extraerse la fase orgánica nuevamente con ácido
diluido y luego añadir reactivos precipitantes de alcaloides. De igual forma, la utilización de
cromatografía en capa fina o papel puede ser muy ventajosa para establecer si se encuentra

presente más de un alcaloide, y adquirir una idea respecto a la proporción relativa en que se
encuentran.
Existen varios reactivos para detectar la presencia de alcaloides, pero los más comúnmente
empleados son:
• Reactivo de Dragendorff:
Se preparan dos soluciones stock: a) 0.6 g. de subnitrato de bismuto en 2 ml. de HCl concentrado y
10 ml. de agua; b) 6 g. de yoduro de potasio en 10 ml. de agua. Estas soluciones stock se mezclan
con 7 ml. de HCl concentrado y 15 ml. de agua, luego se diluye con 400 ml. de agua.
Al emplearse este reactivo para cromatografía en capa fina, los alcaloides se detectan como
manchas naranjas sobre fondo amarillo. También es utilizado para pruebas de detección de
alcaloides en método macrométrico.
• Reactivo de Marquis:
Se utiliza sólo para cromatografía en capa fina. Consiste en 1 ml. de formaldehido en 10 ml. de ácido
sulfúrico. (Peligro: muy corrosivo). Con él se obtienen manchas de color amarillo a púrpura.
• Reactivo de yodoplatinato:
Se mezclan 3 ml. de ácido hexacloroplatínico IV al 10% con 97 ml. de agua y 100 ml. de solución
acuosa de yoduro de potasio al 6%. La solución es estable por algún tiempo en recipientes de color
ámbar. Se asperja 10 ml. de la solución sobre la cromatoplaca. Los alcaloides aparecen como
manchas violeta a azul – grisácea.
• Reactivo de Mayer (solución de yoduro de mercurio y potasio):
Se disuelve 1.35 g. de cloruro de mercurio (II) y 5 g. de yoduro de potasio en 30 ml. de agua, y se

lleva a 100 ml. con agua. Con este reactivo los alcaloides precipitan de color blanco.
Tanto el reactivo de Mayer como el de Dragendorff reaccionan formando productos de adición

insolubles a través del nitrógeno del alcaloide.
La mayor parte de alcaloides son derivados de aminas terciarias, mientras que otros contienen
nitrógeno primario, secundario o cuaternario. La basicidad de los distintos alcaloides varía bastante,
dependiendo de cuál de los cuatro tipos se encuentra presente.

• Reactivo de Wagner (yodo y yoduro de potasio):
Pesar 1.27 g. de yodo y mezclar con una solución de 2 g. de yoduro de potasio en 5 ml. de agua.
Diluir a 100 ml. con agua.
2. PROCEDIMIENTO
2.1 Ensayo macrométrico:
Pesar 1 g de material vegetal. Agregar 2 gotas de solución de hidróxido de amonio al 10 por ciento
(p/v), luego añadir 25 mL de metanol a 60C. Filtrar con papel filtro Whatman 1 y acidificar el filtrado
con ácido clorhídrico 2 N. La solución resultante dividirla en 4 tubos y evaluar de la siguiente
manera:
Tubo 1: agregar 5 gotas del reactivo de Mayer’s. (Color blanco a crema).
Tubo 2: agregar 5 gotas del reactivo de Dragendorff. (Color rojo a naranja).
Tubo 3: agregar 5 gotas del reactivo de Wagner. (Color marrón).
Tubo 4: testigo.
Usar como estándar soluciones al 1% de atropina y papaverina. Observar durante 2 horas la

existencia de precipitados, turbidez o precipitación de complejos en los tubos.
2.2 Cromatografía en capa fina:
Pesar 1 g de material vegetal seco y molido, agregar 1 mL de hidróxido de amonio al 10% (p/v) y
extraer con 5 mL de metanol. Colocar en baño maría a 60C durante 5 minutos. Filtrar y concentrar.
Aplicar en una placa de sílica gel 60 F254.
Estándar: solución de quinina al 1%.
Fase móvil: tolueno-acetato de etilo-dietilamina (70:20:10)
Detección: Sin tratamiento químico: UV 254nm fluorescencia, UV 365 nm algunos fluorescen azul o
amarillo. Reactivo de Dragendorff: zonas cafés o naranjas en vis, los colores no son estables.

PRÁCTICA NO. 3
“INVESTIGACIÓN DE CUMARINAS EN PERICÓN O CANELA”
1. INTRODUCCIÓN
Las cumarinas son compuestos ampliamente distribuidos en las plantas, principalmente en las
familias Umbeliferae y Rutaceae, pudiendo encontrarse en todas las partes de la planta, desde la
raíz a flores y frutos, siendo más abundantes en éstos últimos, presentándose a menudo como
mezclas, en forma libre o como glicósidos.
El nombre de cumarina fue asignado originalmente al compuesto aislado por primera vez en 1,820
por Vogel de la Coumarona odorata o árbol de la tonka, llamándose actualmente cumarinas a todas
aquellas que tienen como base la estructura descrita por Vogel:
Cumarina
Aunque el conocimiento de estos compuestos data desde aquella época, los progresos hechos en
este campo fueron escasos hasta hace aproximadamente 30 años; los desarrollos en los procesos
de aislamiento y análisis estructural en estos últimos años han conducido a un marcado incremento
en el número de cumarinas aisladas de plantas, ello, unido al interés despertado por el amplio rango
de actividad biológica que muchas cumarinas han mostrado, como por ejemplo la acción
anticoagulante y antibacterial del dicumarol, la acción antibiótica de la novobiocina, la aguda
hepatotoxicidad y carcinogenicidad de ciertas aflatoxinas, la actividad estrogénica del cumestrol,
la acción fotosensibilizadora de furanocumarinas como el bergapteno y la xantotoxina, la acción
insecticida de los surangin A y B; cabe destacar también las aplicaciones de las cumarinas como
saborizantes y en perfumería.
Todas las cumarinas se caracterizan por el sistema benzo-alfa-pirona y su carácter lactónico hace
que sean solubilizadas por soluciones alcalinas con la aparición de un color amarillo.
2. PROCEDIMIENTO:
2.1 Método Macrométrico:

Medir 5 mL de extracto vegetal metanólico. Agregar 1 mL de agua destilada hirviendo. Con un
capilar aplicar 2 manchas en papel filtro. A una mancha agregar 1 gota de hidróxido de potasio
0.5N.
Observar bajo luz ultravioleta de 365 nm (fluorescencia azul o verde: positivo).

2.2 Método por Cromatografía:
Cromatografía en columna: la cromatografía convencional de columna abierta es el método más
usado para la separación de productos naturales. Para el llenado de las columnas se puede hacer
lo siguiente:
a) Llenado mediante papilla: se prepara en un beaker la cantidad correcta del material de relleno
(sílica). Se agrega la cantidad suficiente del disolvente de elución escogido inicialmente, para
producir un medio acuoso bastante móvil, el cual se agita para mezclarlo bien y luego se deja
reposar aproximadamente 30 minutos, tras lo cual se revuelve de nuevo hasta que la mezcla
este uniforme y luego se vierte rápidamente en la columna cromatográfica (con una almohadilla
de algodón en el fondo y la tapa de salida cerrada) a través de un embudo. Este procedimiento
de agitar y verter tiene que continuar hasta que se haya introducido la cantidad de soporte
requerido en la columna. La tapa de salida se abre cuidadosamente y se deja correr el eluyente
hacia afuera de la columna. El eluyente corre entonces a través de la columna hasta que el nivel
superior del soporte este inmóvil. Con el fin de lavar bien la fase estacionaria se debe eluir al
menos un volumen eluyente de la columna. Es preciso tener cuidado de no dejar que la columna
se seque. Si esto llegara a pasar, se debe volver a comenzar el procedimiento de llenado. La capa
superior del soporte debe estar completamente plana. Una vez que se prepara la columna se
puede agregar la muestra.
b) Llenado en seco: el material seco de relleno se vierte directamente dentro de la columna

cromatográfica que contiene un tapón de algodón en rama. El disolvente se deja entonces
mover hacia abajo de la columna por capilaridad. Cuando alcanza el fondo de la columna se
introduce la muestra como se describió anteriormente. La ventaja de este método es su rapidez.
Sin embargo, se puede generar un calor considerable al empezar a agregar el eluyente al
material seco de relleno.
● Al tener lista la columna se le agrega 1 mL del extracto de forma circular y despacio

utilizando una pipeta Pasteur.
● Continuar agregando fase móvil de tolueno-acetato de etilo (93:7), para evitar que se seque
la sílica y para que corra la muestra.
● Recolectar 1 mL de las distintas fracciones de la muestra en varios tubos de ensayo.
● Con un capilar aplicar 2 manchas de cada fracción en papel filtro. A cada una agregar 1 gota
de hidróxido de potasio 0.5N.
● Observar bajo luz ultravioleta de 365 nm (fluorescencia azul o verde: positivo).
2.3 Cromatografía en Capa Fina:
La alícuota obtenida por cromatografía en columna con mayor fluorescencia se aplica en una placa
de sílica 60 F254.
Estándar: cumarina al 1% en metanol.

Fase móvil: tolueno-acetato de etilo (93:7)
Detección:

● Sin tratamiento químico: uv 254nm fluorescencia. Uv 365 nm todas las cumarinas muestras una
intensa fluorescencia azul o verde- azul. Las furanocumarinas fluorescen de color amarillo, café
o azul (límite de detección: 1 microgramo)
● Con tratamiento: solución etanólica de hidróxido de potasio al 5 o 10%.
LAS CUMARINAS NO SUSTITUIDAS FLUORESCEN DE COLOR AMARILLO-VERDOSO EN UV-365 NM.

SOLO DESPUÉS DE ASPERJAR CON EL REVELADOR. LA PLACA SE EVALÚA YA SEA EN VISIBLE O BAJO
LUZ UV-365 NM, CON O SIN CALENTAMIENTO. LAS CUMARINAS SE OBSERVAN AZULES A ESTA
LONGITUD DE ONDA.
2.4 Concentración de extracto con Rotavapor
Trasegar (trasvasar) la tintura obtenida en la práctica No.1 a un balón de concentración de

rotavapor. Armar el equipo según le indique su instructor de laboratorio. Ajustar la presión entre
175 mb (milibares), a una temperatura de 40°C. Ajustar el número de rotaciones por minuto según
sea necesario. Concentrar la mx a la mitad del volumen inicial. Trasvasar el extracto a un cristalizador
previamente tarado, y colocar dentro de la desecadora con sílica gel y dejar por una semana,
debidamente rotulado y empacado con aluminio perforado. Trasvasar a un frasco el solvente
recuperado.
● Realizar cálculos 8 días después y reportarlos en reporte de la práctica No.3.
(g) de extracto obtenido X 100%

% de rendimiento= (g) de material vegetal inicial
(utilizados en tintura)
(g) de extracto obtenido= (Peso cristalizador + mx) – (Tara cristalizador vacío)

PRÁCTICA NO. 4
“INVESTIGACIÓN DE ACEITES VOLÁTILES EN HOJAS DE
CANELA Y EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD CITOTÓXICA”
1. INTRODUCCIÓN:
Se llaman así los constituyentes odoríferos o “esencias” de una planta. El término aceite se origina
probablemente del hecho que el aroma de una planta existe en las glándulas o entre las células en
forma líquida, el cual al igual que los aceites grasos son inmiscibles con el agua.
Se les encuentra en muchas especies de las familias de las Umbeliferae (apio, comino, perejil, anís),
de Rutaceae (limón, naranja, lima, mandarina), de Labiateae (lavanda, romero, orégano), de
Mirtaceae (eucalipto, clavo), Piperaceae (pimienta), entre otros.
Pueden estar ubicados en las diferentes partes de la planta, por ejemplo, en las coníferas están en
todo el tejido; en la rosa sólo en el pétalo, en el comino en las semillas, en el clavo de olor en el
brote o yema, en la lima en los frutos, en la menta en los pelos glandulares de las ramas y hojas.
Algunas plantas tienen un aceite esencial que difiere en composición a través de la planta. En la
canela, por ejemplo, el aceite esencial obtenido de las hojas contiene principalmente eugenol, el de
la corteza principalmente cinamaldehído y el de la raíz alcanfor.
Los aceites esenciales derivan del isopreno; están formados en su mayoría por monoterpenos,
sesquiterpenos y compuestos aromáticos. Ejemplo:
Isopreno
Monoterpenos:
Citronelal Limoneno
Geraniol

Aromáticos:
Timol Vainillina Anisaldehído
Sesquiterpenos:
Gingerona Cedrol
β-cariofileno
Los aceites esenciales tienen múltiples aplicaciones: en perfumería, como saborizantes de

alimentos, y en medicina. Ejemplo: los aceites de anís, menta y canela son carminativos y
soporíferos; el de clavo de olor es analgésico dental y se utiliza además en la producción comercial
de vainillina; el de pino es desinfectante y desodorante; el de eucalipto es expectorante; los de
valeriana y lavanda tienen efecto sedante.
Cada uno de los componentes aislados pueden tener también una aplicación, como el citronelal,
que es repelente de mosquitos, el mentol como calmante de dolores de muela y de garganta, y
como anestésico y antiespasmódico; el citral que tiene acción antihistamínica y es analgésico en
oftalmología, etc.
Los aceites esenciales son obtenidos del material fresco que los contiene utilizando principalmente
el clásico procedimiento de destilación por arrastre de vapor; el aceite esencial obtenido es secado
posteriormente con sulfato de sodio anhidro. Otros métodos usuales son el de expresión, extracción
con solventes lipofílicos y el enflorado; este último es bastante usado en perfumería, y consiste en
que los pétalos de una flor, por ejemplo, se colocan y presionan entre dos placas de vidrio
impregnadas de grasa, en las cuales se absorbe el aceite, el cual es luego extraído con alcohol. Para

efectuar la caracterización química de aceites volátiles, la cromatografía en capa fina resulta
ventajosa.
Actividad citotóxica:
La evaluación de citotoxicidad frente a nauplios de Artemia salina (crustáceo conocido como

camarón de mar), se ha utilizado para el tamizaje y evaluación de extractos y aceites vegetales. Se
trata de una prueba utilizada para ensayar la actividad toxica general no específica de extractos
vegetales, y se utiliza como tamizaje preliminar en la búsqueda de agentes anticancerígenos dado
que se ha demostrado la existencia de una relación directa entre los valores de DL 50 (Dosis Letal
Media) calculada y las pruebas anticancerígenas realzadas utilizando sistemas de cultivo in vitro,
como las pruebas del disco de papa y células 9KB por ejemplo. Cabe recalcar que el tamizaje sobre
A. salina, se detecta actividad biológica general que puede ser traducida en una amplia gama de
actividades biológicas específicas.
A. salina es también utilizada como una prueba preliminar orientada al descubrimiento de nuevos
insecticidas.
2. PROCEDIMIENTO:
2.1 IDENTIFICACIÓN POR CCF
Extraer 1 g de material vegetal pulverizado con 10 mL de diclorometano agitando por 15 minutos.

Filtrar y evaporar en baño maría (60°C) a sequedad.
Disolver en 1 mL de tolueno y aplicar sobre la cromatoplaca de silicagel 60 F254.
Estándar: solución de tolueno 1:30 de eugenol.
Fase móvil: tolueno-acetato de etilo (93:7).
Este sistema es útil para el análisis y comparación directa de todos los aceites esenciales de
importancia.
Detección:
Sin tratamiento químico: Luz UV 254 nm, todos los compuestos que contienen por lo menos dos
dobles enlaces conjugados fluorescen. Los derivados del fenilpropano poseen esta propiedad,
ejemplo: el anetol, safrol, apiol, eugenol. Otros compuestos que fluorescen son el cinamaldehído,
anisaldehído, timol y piperitona.
Bajo luz UV a 365 nm el metil- antranilato muestra intensa fluorescencia azul.
Con tratamiento químico: vainillina-ácido sulfúrico.
● Solución I: ácido sulfúrico al 5% en etanol.

● Solución II: vainillina al 1% en etanol.

Asperjar vigorosamente la placa con la solución I, e inmediatamente con la solución II. Después de
calentar a 110°C durante 5 – 10 minutos, bajo observación, evaluar la placa en visible.
El reactivo detecta los componentes de los aceites esenciales (terpenoides, derivados de

fenilpropano, fenoles, etc.). Las coloraciones observadas en visible varían entre azul intenso, verde,
rojo y café.
2.2 EVALUACION DE ACTIVIDAD CITOTOXICA
2.2.1 Cultivo de Artemia salina
El cultivo de nauplios de Artemia será realizado por los instructores 48 horas antes de realizar el
ensayo, utilizando agua de mar aereada por 30 minutos y bajo un régimen continuo de luz artificial
(lámpara de 25W). Los nauplios de no más de 18h de nacimiento serán utilizados para la prueba de
toxicidad.
2.2.2 Preparación del extracto a ensayar
● Medir 25 µl del aceite y disolver con 1mL de agua pura. Añadiendo 0.1% de dimetilsulfóxido.
● Sonificar la solución por 5 min para optimizar la solubilidad.
2.2.3 Sembrado
● Colocar por triplicado en cada pocillo de una microplaca, 100 µl de agua de mar conteniendo
10 individuos (nauplios) con la ayuda de una pipeta automática.
Nota: Pescar los nauplios de dos en dos por 5 veces con un tip amarillo, utilizando una pipeta
automática de 20 µl para asegurarse de que queden 10 individuos/100ul. Cortar la punta
del tip si fuese necesario. Ver esquema del diseño experimental del bioensayo.
● Agregar 100 µl del aceite a ensayar.
Nota: Al final cada pocillo debe contener: 100 µl de aceite + 100 µl de agua de mar con 10
nauplios. Con sus respectivas repeticiones (triplicado).
● Si el extracto muestra actividad, es decir, mata al 100% de nauplios, realizar diluciones de

la concentración inicial.
● Realizar diluciones:
Solución a Diluciones Concentración de las

ensayar (µl) diluciones (ppm)
12 1.500
Aceite 5 0.625
2 0.025
*ppm= µg/L

● Al final cada pocillo debe contener: la cantidad de µl de la solución de aceite según su
dilución + 100 µl de agua de mar con 10 nauplios + los µl suficientes para completar un
volumen de 200 µl por pozo. Con sus respectivas repeticiones (triplicado).
Figura 1. Diseño experimental:

Control C1 C2 C3
Repetición 1
Repetición 2
Repetición 3
Controles
● Control negativo para cada tratamiento: 100 µl de agua de mar + 100 µl de agua de mar con
10 nauplios.
● Control positivo para extractos: 100 µl de alguna sustancia de actividad citotóxica
reconocida. Puede utilizarse algún extracto que haya mostrado actividad en estudios
previos u otros + 100 µl de agua de mar con 10 nauplios.
● Control de disolventes utilizados en la elaboración de las soluciones de extractos. Realizar
controles con los solventes utilizados para disolver las respectivas muestras a analizar. Por
ejemplo:
o Etanol al 95%:
o Diclorometano:
2.2.4 Incubado
● Incubar la microplaca (nauplios + aceites a ensayar) a temperatura ambiente con luz
artificial por 24 horas.
● Pasadas las 24 horas, contar en el estereoscopio o con lupa el número de nauplios muertos.
● Si se observan nauplios muertos en el control negativo la prueba no es válida y hay que
repetirla.
2.2.5 Determinación de la Citotoxicidad

Calculo del % de nauplios muertos:
Sumar el número de nauplios muertos en los tres pozos (X)
Sumar el número total de nauplios en los tres pozos (Y)
Dividir X dentro de Y y multiplicarlos por 100.
Si el % de camarones muertos es mayor del 50%, repetir la prueba utilizando dosis de 1.0, 0.5 y 0.25
mg/mL. Si el % es menor del 50% la citotoxicidad es mayor de 1 mg/mL.
2.2.6 Calculo de DL50 y otros parámetros con Statgraphics

Consultar documento en sitio web del curso

PRÁCTICA NO. 5
“INVESTIGACIÓN DE TANINOS Y/O COMPUESTOS
FENÓLICOS EN CORTEZA DE ENCINO”
1. INTRODUCCIÓN:
Los compuestos fenólicos se refieren a un grupo de sustancias que poseen en común un anillo
aromático con uno o más sustituyentes hidroxilos, y que se encuentran frecuentemente formando
glicósidos, combinados con unidades de azúcar. Son relativamente polares y tienden a ser solubles
en agua, pudiendo ser detectados por el intenso color verde, púrpura, azul o negro que producen
cuando se les agrega una solución acuosa o alcohólica del cloruro férrico al 1%. Dada la naturaleza
aromática de estos compuestos fenólicos, muestran intensa absorción en la región ultravioleta del
espectro, siendo este método espectral especialmente importante para su identificación y análisis
cuantitativo. Los compuestos fenólicos que se tratarán en este manual son los taninos, flavonoides,
antocianinas, antraquinonas y cumarinas.
Los taninos están ampliamente distribuidos en plantas vasculares, sobre todo en las angiospermas,
en las que se hallan localizados en la corteza. Estos compuestos se caracterizan por reaccionar con
proteínas, formando polímeros estables e insolubles en agua. Desde el punto de vista industrial, los
taninos son sustancias de origen vegetal, que debido a su propiedad de enlazarse a las proteínas,
son capaces de transformar piel de animales en cuero. También se ha encontrado evidencia de su
valor potencial como agentes citotóxicos y/o antineoplásicos.
Desde el punto de vista químico, existen dos tipos de taninos: los “condensados”, que se encuentran
en helechos y gimnospermas, y ampliamente distribuidos en las angiospermas, sobre todo en
especies madereras. Por el contrario, los taninos hidrolizables se limitan a las plantas dicotiledóneas,
en donde se les halla en relativamente pocas familias. Sin embargo, ambos tipos de taninos pueden
encontrarse juntos en la misma planta, tal como ocurre en la corteza y hojas del encino.
Los taninos hidrolizables son ésteres de ácidos aromáticos carboxílicos, los cuales por hidrólisis ácida
o enzimática producen un azúcar y un residuo fenólico de ácido gálico o su dímero, el ácido elágico.
Se presentan como sustancias higroscópicas amorfas de color café-amarillento, solubles en agua
caliente, formando dispersiones coloidales. Los taninos condensados no son ésteres, sino unidades
de estructura flavonoide polimerizadas. Los más importantes son las catequinas,
leucoanticianidinas, y el producto de su copolimerización, los biflavanos. En cuanto a sus
propiedades generales son similares a los taninos hidrolizables, pero no son muy solubles en agua,
y el tratamiento mediante ebullición con ácido diluido, da lugar a la formación de polímeros
insolubles de color café-rojizo, conocidos como flobafenos o taninos rojos.
Los taninos pueden ser detectados fácilmente en extractos vegetales mediante el test de “gelatina-
sal”. En dicho ensayo se agrega una solución de gelatina a una porción de extracto acuoso, y una
solución de gelatina-cloruro de sodio a una segunda porción. La formación de precipitado, ya sea
con el último de los reactivos o con ambos, indica la presencia de taninos. La reacción se basa en
que los taninos precipitan en presencia de proteínas, en este caso gelatina. La sensibilidad de la

reacción se incrementa mediante la adición de cloruro de sodio, ya que se induce “salting-out”,
favoreciendo la precipitación del complejo, formado entre taninos y proteínas.
Los resultados positivos se confirman mediante la adición de solución de cloruro férrico a otra
porción de extracto, obteniéndose coloraciones que varía entre azul, negro-azulado, verde o verde-
azulado, y formación de precipitado. Estos cambios de color se deben a la reacción química entre el
cloruro férrico y las funciones fenólicas de los taninos. En caso que no se encuentren presentes
taninos, pero sí compuestos fenólicos no tanínicos se obtendrá resultado negativo con el reactivo
de gelatina-sal. Sin embargo, sí se producirán soluciones coloreadas al adicionar cloruro férrico.
Extracción con Fluidos Supercriticos (SFE)
Es una técnica que se empezó a desarrollar en la década de los 80 y que ha sido muy empleada en
la industria agroalimentaria para la obtención de aromas y sabores de especias y hierbas aromáticas,
de café y té sin cafeína, de bebidas sin alcohol, de productos animales sin colesterol y de aceites de
semillas. También se ha empleado en el análisis de pesticidas, aunque en menor proporción. Los
fluidos supercríticos tienen densidades similares a las de los líquidos pero con coeficientes de
difusión mayores y viscosidades más bajas, similares a la de los gases, por lo que la extracción es
más rápida que con líquidos orgánicos (Ahmed, 2001).
El poder disolvente de un fluido supercrítico puede modificarse por los cambios de la presión y, en
menor proporción, por la temperatura. Por el contrario, el poder disolvente de un líquido orgánico
es prácticamente constante e independiente de las condiciones. El dióxido de carbono ha sido el
fluido de elección en la mayoría de los estudios ya que es un disolvente adecuado para analitos no
polares. Para compuestos más polares es necesaria la introducción de modificadores, como el
metanol o el agua, para aumentar la polaridad del CO2 y mejorar la extracción de estos compuestos.
En la extracción con fluidos supercríticos, las muestras se colocan en una celda de extracción y se
bombea el fluido correspondiente hasta alcanzar la presión y la temperatura deseadas (mayores
que su punto crítico). Después de la extracción, el fluido se despresuriza y se recoge el extracto
limpio en una trampa adsorbente o en un disolvente para su análisis. Las muestras deben ser
previamente desecadas, para evitar la posible obstrucción de la válvula restrictora por la formación
de hielo, lo que se puede llevar a cabo mediante la liofilización de las muestras o bien añadiendo un
agente desecante. Lehotay y Garcia-Valverde (1997) emplearon el sulfato magnésico mezclado con
Hydromatrix con muy buenos resultados para más de cincuenta pesticidas de distintos tipos, aunque
también se han utilizado otros agentes desecantes como el sulfato sódico anhidro y la Celita en la
determinación de pesticidas polares en manzanas (Stefani y col, 1997).
La técnica SFE presenta una serie de ventajas entre ellas la posibilidad de obtener extractos
concentrados y puros al vaporizarse el fluido supercrítico a presión atmosférica.

2. PROCEDIMIENTO:
2.1 Método macrométrico:

Llevar a ebullición 25 mL de agua y agregarla a una muestra de 5 g de corteza de encino. Ebullir
durante 5 minutos.
Dejar enfriar a temperatura ambiente. Agregar de 3 a 4 gotas de solución de cloruro de sodio al

10%, con el objeto de precipitar cualquier compuesto no tanínico, y evitar obtener un resultado
falso- positivo.
Filtrar y adicionar 3 mL del filtrado a 4 tubos de ensayo:
Tubo 1: testigo.
Tubo 2: agregar 4 a 5 gotas de solución de gelatina al 1% en agua.
Tubo 3: agregar 4 a 5 gotas de gelatina-sal (1% de gelatina + cloruro de sodio al 10%).
Tubo 4: agregar 3 a 4 gotas de solución de cloruro férrico al 10% en agua
Observar la formación de precipitado y/o cambio de coloración.
2.1.2 Determinación de taninos y compuestos fenólicos en vino:

Filtrar en papel y adicionar 3 mL del filtrado a 4 tubos de ensayo:
Tubo 1: testigo.
Tubo 2: agregar 4 a 5 gotas de solución de gelatina al 1%
Tubo 3: agregar 4 a 5 gotas de gelatina-sal (1% de gelatina + cloruro de sodio al 10%).
Tubo 4: agregar 3 a 4 gotas de solución de cloruro férrico al 10%
Observar la formación de precipitado y/o cambio de coloración.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
● La ausencia de reacción con cloruro férrico, implica carencia de taninos y compuestos fenólicos.
● Un color grisáceo o negro-grisáceo al reaccionar con cloruro férrico (asumiendo que se forma
precipitado luego del test de sal-gelatina), implica presencia de taninos del tipo catecol.
● Un color negro-azulado al añadir cloruro férrico (asumiendo que hubo precipitado en el ensayo
de sal-gelatina) implica la presencia de taninos del tipo pirogalol.
● Un resultado negativo con el test de sal-gelatina, pero producción de color grisáceo o negro-
azulado, luego de añadir cloruro férrico, implica ausencia de taninos, y los cambios de color se
atribuyen a otros constituyentes fenólicos del vegetal.
2.2 Método por Cromatografía en Capa Fina (CCF)
A. Extracción por Fluidos Supercríticos

Pulverizar 10g de corteza de encino. Introducir la materia vegetal a la celda de extracción. Agregar
como cosolvente 10mL de etanol al 95%. Armar el equipo. Presurizar entre 1000 a 1500 psi con
gas supercrítico (mezcla de nitrógeno y dióxido de carbono) a 40-45°C durante una hora.
Despresurizar lentamente y recuperar el extracto en un erlenmeyer.
B. Extracción por maceración

Extraer 1 g. de corteza de encino con 5 mL. de etanol al 95%, macerando por 5 min. Filtrar y
concentrar en baño de maría (60ºC).
C. Vino de Uva
Filtrar en un tubo de ensayo 5 mL de vino de uva, y concentrar en baño maría hasta la mitad del
volumen.
Evaluar los tres extractos por CCF:

Estándar: solución de taninos 1%.
Fase móvil: acetato de etilo-ácido fórmico-ácido acético-agua (17:2:2:5).
o cloroformo-metanol (6:4)
Detección:
Sin tratamiento químico: Luz UV 254 nm, todos los compuestos que contienen por lo
menos dos dobles enlaces conjugados fluorescen. Los derivados del fenilpropano poseen
esta propiedad, ejemplo: el anetol, safrol, apiol, eugenol. Otros compuestos que
fluorescen son el cinamaldehído, anisaldehído, timol y piperitona.
Bajo luz UV a 365 nm el metil- antranilato muestra intensa fluorescencia azul.
Con tratamiento químico: FeCl3 10 %

PRÁCTICA NO. 6
“INVESTIGACIÓN DE FLAVONOIDES EN HOJAS DE RUDA Y
TILOF”
1. INTRODUCCIÓN
Los pigmentos flavonoides, uno de los grupos más numerosos y ampliamente distribuidos en las
plantas, conocidos algunas veces como antoxantinas, aparecen frecuentemente revisados bajo
diferentes aspectos en la literatura química, especialmente en los últimos treinta años. Hasta hoy
se conocen diez clases de flavonoides, todos contienen quince átomos de carbono en su núcleo
básico, denominado “flavona”, y están arreglados bajo un sistema C 6C3C6, en el cual 2 anillos
aromáticos llamados A y B están unidos por una unidad de tres carbonos que pueden o no formar
un tercer anillo, que en caso de existir, es llamado anillo C.
Núcleo básico: Flavona
Cada una de las clases de flavonoides suele encontrarse bajo la forma de glicósidos con una a tres
unidades de azúcar, generalmente en los carbonos 3 y/o 7. Los flavonoides se encuentran en todas
las partes de las plantas, algunas clases se hallan más ampliamente distribuidas que otras, siendo
más comunes las flavonas y flavonoles, y más restringidas en su ocurrencia las isoflavonas, chalconas
y auronas.
Como características generales de estos compuestos puede señalarse su solubilidad en agua.

Pueden ser extraídos con etanol al 70%, y el extracto obtenido someterse a partición con éter de
petróleo. Debido a su carácter fenólico, muestra intensa absorción en la región ultravioleta y visible
del espectro, debido a la presencia de sistemas aromáticos conjugados.
Asimismo, son fácilmente detectados, ya sea en cromatogramas o en solución, ya que sufren cambio
de color al ser tratados con álcali o con amoníaco.
Los flavonoides se emplearon durante mucho tiempo como colorantes de lana, y actualmente se
usan en la conservación de grasas o jugos de frutas debido a las propiedades antioxidantes de
algunas polihidroxiflavonas. Así mismo, los glucósidos de dihidrochalconas se emplean como
edulcorantes, la rotenona como insecticida, etc.

La acción farmacológica es también extensa y variada. Así, por ejemplo, la rutina y sus derivados
actúan contra la fragilidad capilar, las proantocianidinas de Crataegus y Arnica son dilatadores de
las coronarias, los glicósidos de apigenina espasmolíticos, mientras que otros poseen acción
antihepatotóxica, antimicrobiana y fungitóxica.
Por otra parte, las antocianinas, heterósidos estrechamente relacionados con los flavonoides,
constituyen el grupo de pigmentos más importante y más ampliamente distribuido en las plantas.
Son pigmentos acuosolubles responsables de casi todos los colores rosados, escarlata, rojos, violetas
y azules en pétalos, hojas y frutos. Las antocianinas provienen químicamente de una sola estructura
aromática, la de la cianidina, y todas derivan de este pigmento por adición o sustracción de grupos
hidroxilo o por metilación o glicosilación.
Cianidina
Actividad Antioxidante:
El estudio de los radicales libres (RL) y de los antioxidantes ha cobrado un gran auge particularmente
en el último decenio. En este contexto los compuestos polifenólicos, y dentro de estos los
flavonoides, ocupan un lugar destacado. Los mecanismos a través de los cuales ejercen su acción
antioxidante resultan de una combinación de sus propiedades quelatantes de metales de transición
y secuestradoras de RL, así como de la inhibición de oxidasas y acción sobre otras enzimas. Sin
embargo, estos compuestos pueden actuar como agentes prooxidantes, rasgo probablemente
responsable de los efectos mutagénicos y genotóxicos también encontrados para algunos de estos
metabolitos en diversos sistemas experimentales.

2. PROCEDIMIENTO:
Extraer 3 g de material vegetal pulverizado con 10 mL de etanol o metanol al 80 por ciento,

filtrar y concentrar. Enfriar a temperatura ambiente y triturar el residuo con 15 mL de éter de
petróleo hasta que la extracción sea incolora. Disolver el residuo en 30 mL de metanol al 80
por ciento, filtrar y dividir en 5 tubos:
Tubo 1: agregar 0.5 mL de ácido sulfúrico concentrado.

Tubo 2: agregar 3 a 5 gotas de cloruro férrico al 10 % (p/v).
Tubo 3: agregar 0.5 mL de ácido clorhídrico concentrado y calentar en baño de maría por
5 minutos (prueba para leucoantocianinas).
Tubo 4: agregar magnesio metálico y 0.5 mL de ácido clorhídrico concentrado.
Tubo 5: agregar un álcali a un extracto acuoso.
Tubo 6: testigo.
Evaluar las reacciones, cambios de color y/o formación de precipitado comparados con el
testigo. Desarrollo inmediato de color flavonas y flavonoles (amarillo a rojo), flavanonoles (rojo
a magenta), flavanonas (rojo, magenta, violeta, azul), isoflavonas (amarillo); isoflavononas,
chalconas y auronas no dan coloración.
Extraer 1 g de material vegetal seco pulverizado con 15 mL de metanol por 5 minutos en baño
de maría a 60°C. Filtrar la solución y aplicar sobre las cromatoplacas de silicagel 60 F254.
Estándar: solución de rutina al 0.05% en metanol. El límite de detección promedio para
flavonoides es 5 – 10 microgramos.
Fase móvil: acetato de etilo - ácido fórmico - ácido acético glacial - agua (100:11:11:27)
Detección:
Sin tratamiento químico: UV 254nm fluorescencia, zonas azules o amarillas. UV 365 nm,
dependiendo la estructura fluorescen amarillo, azul o verde. Algunos extractos de plantas,
como la ruda, frecuentemente contienen otros materiales, tales como ácidos de plantas y
cumarinas, que forman zonas fluorescentes de color azul.
Con tratamiento químico:

1. Reactivo de Productos Naturales (NP/PEG):
Asperjar Solución 1 y luego la Solución 2.
Solución 1: solución metanólica al 1 por ciento de difenilboriloxietilamina (NP).
Solución 2: solución etanólica al 5 por ciento de polietilenglicol 4000 (PEG).
2. Aplicar a la placa vapores de amoniaco para intensificar el color de las manchas.

Se produce intensa fluorescencia a 365 nm, ya sea inmediatamente, o después de 15
minutos.
El polietilenglicol incrementa la sensibilidad desde 10 hasta 2.5 microgramos.

La fluorescencia es dependiente de la estructura.
Las hojas de ruda se caracterizan por la presencia de rutina (color naranja, Rf 0.35), y las
zonas fluorescentes azul-violáceas de las cumarinas.
3. Para determinar poder antioxidante de flavonoides:
Extraer 1 g de material vegetal seco pulverizado con 15 mL de metanol por 5 minutos en baño
de maría a 60°C. Filtrar la solución y aplicar sobre las cromatoplacas de silicagel 60 F254.
Estándar: solución de rutina al 0.05% en metanol. El límite de detección promedio para

flavonoides es 5 – 10 microgramos.
Fase móvil: acetato de etilo - ácido fórmico - ácido acético glacial - agua (100:11:11:27)
Detección: Asperjar cromatoplaca con el reactivo de difenilpicrilhidrazilo (DPPH) como

revelador. Asperjar con una solución de DPPH en metanol (1mg/1ml). Esperar 15 minutos.
Observar decoloración de las manchas en la placa.

PRÁCTICA NO. 7
“INVESTIGACIÓN DE ANTRAQUINONAS EN RAÍZ DE
RUIBARBO”
1. INTRODUCCIÓN
Las quinonas son pigmentos naturales que varían desde el color amarillo pálido hasta casi negro.
Existen cuatro grupos de quinonas: las benzoquinonas, naftoquinonas, antraquinonas y quinonas
isoprenoides. Los primeros tres grupos son hidroxilados, con propiedades fenólicas, y pueden
encontrarse in vivo ya sea formando glicósidos o a veces en forma de quinol. Las quinonas
isoprenoides se involucran en la respiración celular (ubiquinonas), y en la fotosíntesis
(plastoquinonas), y por lo tanto se encuentran distribuidas universalmente en las plantas.
De todas ellas, las antraquinonas constituyen el grupo más grande de sustancias del tipo quinona
presentes en la naturaleza. Suelen ser compuestos de color rojo-anaranjado, que en ocasiones
pueden observarse “in situ” (ejemplo: en los radios medulares del ruibarbo y cáscara sagrada). Se
les encuentra además en las hojas de sen y la cochinilla. Aunque se les usa ampliamente como
colorantes, su principal valor medicinal proviene de su acción catártica. Los derivados
antraquinónicos presentes en las drogas purgantes pueden ser dihidroxifenoles, como el crisofanol;
trihidroxifenoles como la emodina; o tetrahidroxifenoles, como el ácido carmínico. Cuando estas
sustancias se hallan formando heterósidos, el azúcar puede estar unido en posiciones diversas.
Antraquinona
Las antraquinonas son solubles en agua caliente o alcohol diluido. Pueden detectarse mediante
cromatografía en capa fina por sus colores originalmente amarillos y café-amarillentos cambian a
rojo, violeta, verde o púrpura.
2. PROCEDIMIENTO
Prueba de Bornträger: Extraer 3 g de material vegetal pulverizado con 10 mL de etanol al 80 por

ciento, filtrar y concentrar en baño de maría (60°C). Disolver el residuo con 30 mL de agua destilada
y filtrar. Extraer con 10 mL de tolueno. A la fase orgánica añadir 5 mL de solución de test de amonio

(NH4OH 10% / H20) y agitar. Observar cambios de color en la fase alcalina (color rojo, rosado:
positivo).
Prueba de Bortränger modificado: Agregar 0.3 g de material vegetal pulverizado a 10 mL de

hidróxido de potasio alcohólico 0.5 N y 1 mL de peróxido de hidrógeno al 3 por ciento y calentar 10
minutos en baño de maría a 60°C. Añadir 10 gotas de ácido acético glacial para acidificar. Extraer
con 10 mL de tolueno. A la capa orgánica adicionar 5 mL de solución de prueba de amonio y agitar.
Observar cambios de color en fase alcalina (color rojo, rosado: positivo).
2.2 Cromatografía en Capa fina:
Extraer 0.5 g de hojas de sen con 5 mL de metanol en baño maría (60°C) por 5 minutos. Filtrar y
aplicar en la cromatoplaca de silicagel 60 F254.
Estándar: solución al 0.1 por ciento en metanol de antraquinonas (10 μL). (Aloína, flangulina A/B,
glucofrangulina A/B y sus agliconas, reina, aloe-emodina, extracto de sen)
Fase móvil: acetato de etilo-metanol-agua (100:17:13)
Detección:
Sin tratamiento químico: UV 254nm fluorescencia, UV 365 nm fluorescencia amarilla o rojo-café.
Con tratamiento químico: Solución etanólica de hidróxido de potasio al 5 o 10 por ciento.
Antraquinonas: zonas rojas en visible y fluorescencia roja en UV-365 nm.

Antronas y antranolas: zona amarillas en visible y fluorescencia amarilla en UV-365 nm.
Los senósidos: se detectan como 7-9 bandas de color café-rojizo (vis), o como zonas fluorescentes
amarillo-limón o celestes (UV-365 nm). Las bandas principales se deben al senósido A (Rf 0.4) y
senósido B (Rf 0.2). El senósido D aparece a un Rf de 0.5-0.55; el senósido C se observa como una
banda débilmente coloreada (Rf 0.7), y la reína, de color rojo-naranja (Rf 0.8). Las otras agliconas
migran junto al frente del solvente.
2.3 Identificación de Senósidos en tabletas de origen natural contra el estreñimiento:
Pulverizar la mitad de la tableta. Añadir 5mL de metanol. Reposar por 5 minutos. Filtrar y aplicar en
cromatoplaca de silica gel. El estándar, fase móvil, y la forma de detección de los senósidos serán
igual que en el inciso 2.2 de cromatografía en capa fina.

PRÁCTICA NO. 8
“INVESTIGACIÓN DE PRINCIPIOS AMARGOS EN HOJAS DE
SALVIA Y EXTRACCIÓN DE BIXINA EN SEMILLAS DE
ACHIOTE”
1. INTRODUCCIÓN:
Se denomina comúnmente “principios amargos” a un grupo de sustancias químicas de gran interés

por su uso tan variado, caracterizadas por su sabor extremadamente amargo, y su estructura
terpenoide. La mayor parte de ellos derivan de monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos y
triterpenos. Todos ellos tienen en común unidades de isopreno dentro de su molécula.
Así, por ejemplo, los monoterpenos (C-10) contienen 2 unidades de isopreno, los sesquiterpenos (C-
15) 3 unidades, los diterpenos (C-20) cuatro, y los triterpenos (C-30) seis.
Dentro de los principios amargos de importancia farmacéutica se encuentran las sesquiterpen-

lactonas, limonoides, meliacinas y simaorubalidanos. Las sesquiterpen-lactonas derivan
biogenéticamente de los sesquiterpenos. Se les encuentra principalmente en la familia Compositae
(géneros Artemisia y Ambrosia), y en menor grado en la familia Umbeliferae. Estas sustancias
amargas se encuentran en todas las partes de la planta, pero sobre todo en las hojas. Son bastante
solubles en cloroformo y éter etílico y de gran importancia por variada acción biológica que han
demostrado: acción citotóxica, antitumoral, analgésica, antimalárica, amebicida, inhibidores del
crecimiento de bacterias, entre otras. Ejemplo importante lo constituye la artemisinina, lactona
sesquiterpénica con una unión peróxido interna, la cual es el principio activo antipalúdico de la
planta china Artemissia annua. La artemisinina ha mostrado eficacia en el tratamiento de casos
resistentes a la cloroquina, frente al Plasmodium falciparum, y sobre todo en paludismo cerebral.
Dicho compuesto está siendo ahora estudiado activamente en diversos laboratorios del mundo.
Así mismo, Neurolaena lobata, planta comúnmente empleada contra la malaria y la diabetes
contiene las sesquiterpenlactonas neurolanina A y B, y lobatina A y B.
Artemisinina
Las Rutaceas, Meliaceas y Simaroubaceas son familias muy afines en las que se han encontrado tres
tipos de terpenoides estrechamente relacionados desde el punto de vista biogenético: los
limonoides, meliacinas y simaroubalidanos, respectivamente.

Se han aislado de semillas, raíces, tallos, corteza y aún frutos. Tradicionalmente se han utilizado
infusiones de plantas conteniendo estos compuestos para combatir fiebres, disenterías y amebiasis.
La abundancia de oxígenos es característica de estos compuestos. Así, por ejemplo: dentro de la
familia Simaroubaceae, la especie Quassia amara contiene cuasina, que posee varios grupos
carbonilo; Simarouba glauca contiene glaucarrubina, compuesto polihidroxilado. Sin embargo, se
ha encontrado que los simaroubólidos poseen más hidroxilos.
Cuasina Glaucarrubina
COLORANTES NATURALES
Los colorantes naturales se dividen en "tintes" y "pigmentos". Los tintes se definen como
compuestos que interaccionan químicamente con el sustrato coloreado (p. e. textiles).
Los pigmentos naturales han tomado importancia en la industria alimenticia y farmacéutica, ya que
su toxicidad es nula y no forman enlaces químicos con el sustrato, ya que para que puedan adherirse
a la superficie del sustrato se tiene que mezclar con un adhesivo. De las semillas de Bixa orellana
(achiote, annato), se obtienen los carotenoides Bixina y Norbixina. Se ha reportado hasta un 8% del
colorante en la semilla al ser extraído en medio alcalino. El árbol del achiote fue nombrado en honor
a Francisco de Orellana, explorador del Amazonas. Los aztecas utilizaron el extracto del achiote
como un textil y tiene del cuerpo, las mujeres como lápiz labial y como colorante del alimento.
El colorante natural obtenido de las semillas del achiote, está exento de certificación en la mayoría
de países. Este está compuesto en su mayoría por el carotenoide Bixina la cual se encuentra en
forma cis, pero se transforma en la forma trans con los tratamientos térmicos utilizados
habitualmente en la extracción del pigmento, además es soluble en las grasas e insoluble en agua.
La Norbixina, soluble en agua e insoluble en grasas, tiene una estructura semejante, pero con los
dos grupos ácidos libres, se utiliza como sal sódica, de modo que al mezclar el colorante con los
alimentos que tienen pH ácido, precipita la forma no ionizada. Esto tiene la ventaja de que el
alimento queda coloreado, pero no "destiñe" (Food and Drug Aministration "FDA", 2001).
La Organización Mundial de la Salud "OMS" ha reconocido que su toxicidad es nula para el consumo
humano así como para su aplicación en la piel.
Después de la segunda guerra mundial, el descubrimiento de los colorantes sintéticos (derivados

del petróleo, del aluminio y del carbón) sustituyó el uso de los naturales. La importancia de los
colorantes de origen vegetal había decaído, sin embargo actualmente la búsqueda de colorantes
naturales como sustitutos de los artificiales continúa.

Estructura química de cis-Bixina (C24H30O3)
Estructura química de cis-Norbixna (C24H28O3)
2. PROCEDIMIENTO:
2.1 Cromatografía en Capa fina para Principios Amargos:
Extraer 1 g de material vegetal con 10 mL de metanol en baño de maría a 60°C por 10 minutos y
filtrar a 2 mL. Utilizar hojas de Neurolaena lobata como control, extrayendo de igual manera.
Aplicar en la cromatoplaca.
Estándar: artemisinina al 1 por ciento en metanol.
Fase móvil: cloroformo-metanol (95:5).
Detección:
Mezclar 0.5 mL. de anisaldehído con 10 mL. de ácido acético glacial, seguido por 85 mL. de metanol
y 5 mL. de ácido sulfúrico concentrado, en este orden.
El reactivo tiene limitada estabilidad, y no debe usarse cuando el color se torna rojo-violáceo. Luego
de asperjar la placa, se calienta a 100°C durante 5 – 10 minutos, y se observa en visible o bajo luz
UV 365 nm.
Se observan las siguientes coloraciones: rojo-violeta, café-rojizo, azul-verdoso y azul.

2.2 Extracción de colorantes del Achiote (Bixa orellana)
✔ Pesar 5g de semillas secas de B. orellana

✔ Adicionar solución alcalina de NaOH 2% en una relación semilla disolvente 1:3 p/v
✔ Calentar a 45ºC y agitar por 30 min
✔ Retirar las semillas y repetir la extracción con 25ml de NaOH 2%
✔ Precipitar la solución básica coloreada mediante la adición lenta y bajo agitación
constante, de H2SO4 2N, hasta obtener un pH de 2-3.
✔ Tarar un trozo de papel filtro, y filtrar por gravedad la suspensión del colorante obtenido.
✔ Secar en horno a 50°C el precipitado recuperado en el papel filtro.
✔ Pesar y calcular porcentaje de rendimiento.

PRÁCTICA NO. 9
“INVESTIGACIÓN DE SAPONINAS EN ZARZAPARRILLA Y
CALÉNDULA”
1. INTRODUCCIÓN
Las saponinas son glicósidos derivados de triterpenos o de esteroles, caracterizados por formar
espuma al agitar el material vegetal en que se encuentran con agua, ya que son poderosos agentes
tensioactivos, que además ocasionan hemólisis a bajas concentraciones. Son bastante tóxicas para
los peces, propiedad aprovechada para pescar, utilizando plantas que las contienen. Sin embargo,
el hecho de que una planta contenga sustancias hemolíticas es prueba que contenga saponinas. Por
vía oral, este tipo de compuestos son prácticamente inactivos.
Así por ejemplo, la zarzaparrilla, rica en saponinas, es muy utilizada en la preparación de bebidas no
alcohólicas.
Las saponinas tienen elevado peso molecular y su aislamiento en estado puro ofrece dificultades.
Puesto que son heterósidos, son hidrolizadas por ácidos, dando una genina (sapogenina) y diversos
azúcares y ácidos urónicos relacionados. En base a la estructura de la sapogenina, se conocen dos
grupos de saponinas: las de tipo esteroidal (generalmente triterpenos tetracíclicos), y las de tipo
triterpenoides pentacíclicos. Ambas clases de saponinas presentan un enlace heterosídico en el C-3
y tienen un origen biogenético común, vía ácido mevalónico y unidades isoprenoides.
Esqueleto esteroide Esqueleto triterpenoide pentacíclico
Las saponinas esteroidales están menos ampliamente distribuidas en la naturaleza que las
saponinas triterpenoides pentacíclicas. Se les encuentra en muchas familias de las
monocotiledóneas, especialmente en Dioscoreaceae, Amaryllidaceae y Lilliaceae. Son de gran
importancia por su relación con compuestos como hormonas sexuales, cortisona, esteroides
diuréticos, vitamina D y heterósidos cardíacos. Algunas son utilizadas como materia de partida para
la síntesis de estos compuestos. La diosgenina es la principal sapogenina empleada por la industria.
A diferencia de las saponinas esteroidales, las triterpenoides pentacíclicas son raras en las
monocotiledóneas. Abundan en muchas familias de las dicotiledóneas, especialmente en
Caryophyllaceae, Sapindaceae, Polygalaceae y Sapotaceae. Las plantas contienen por lo general
cantidades considerables de saponinas triterpenoides. Así, la raíz de regaliz (Glycirrhiza glabra)
contiene alrededor de 2 a 12% de ácido glicirrícico (y naturalmente, la correspondiente cantidad
superior de glicirricina, que es la sal potásico –cálcica); la corteza de quilaya (Quillaja saponaria),
contiene hasta un 10% de la mezcla conocida como “saponina comercial”
La formación de espuma persistente al extraer una planta o al concentrar su extracto es evidencia

de que se encuentran presentes saponinas. En caso de que se encuentren en cantidad considerable
resultará difícil concentrar los extractos alcohólicos, aún empleando evaporador rotatorio. Así
entonces, un ensayo simple para saponinas consiste en agitar un extracto alcohólico de la planta en
un tubo de ensayo, y observar si se forma espuma estable en la superficie del líquido. También
puede efectuarse el test de hemólisis. Sin embargo, generalmente se prefiere confirmar estos
ensayos con cromatografía en capa fina y mediciones espectrofotométricas.
2. PROCEDIMIENTO
2.1 Test de Espuma
Tubo 1: 100 mg de material vegetal pulverizado y seco.
Tubo 2: 2 mL de control de saponinas 0.5 %/ H2O
Tubo 3: 2 mL de agua.
A cada tubo se le adiciona 5 mL de agua destilada. Calentar en baño de maría (60°C) durante 30
minutos. Enfriar, tapar los tubos, agitar vigorosamente 30 a 40 segundos. Dejar reposar los tubos
durante 30 minutos, observar la formación de capa de espuma. Si una capa de espuma mayor de 3
cm persiste en la superficie líquida después de 30 minutos se presume la presencia de saponinas. Si
la espuma es poca y fugaz puede atribuirse a una mínima concentración de saponinas o también a
la presencia de proteínas o ácidos orgánicos.
2.2 Test de Hemólisis
Preparar una caja de Petrí con agar sangre y usando un tubo de ensayo de aproximadamente 1 cm.
de diámetro, remover una capita de agar sangre de 3 partes diferentes de la caja, equidistantes
entre sí.
Calentar con un mechero un agitador de vidrio de 1 a 2 mm. de diámetro, e inmediatamente sellar

los bordes del agar de cada agujero, de manera que al introducir dentro de cada copa el líquido de
las muestras, no se difunda por debajo de la capa de agar. Es posible que se requiera repetir varias
veces el calentamiento hasta sellar adecuadamente.
Utilizando un gotero o una pipeta Pasteur, añadir suficiente extracto vegetal acuoso a una de las
copas hasta casi llenarla, de modo que la muestra no se extienda sobre la superficie del agar-sangre.
Llenar la segunda copa con control de saponinas y la tercera con agua destilada.
Dejar en reposo durante 24 horas, y observar la presencia de zonas claras de hemólisis que
circunden cualesquiera de las copas. Si se encuentran presentes, medir la zona desde el punto más
lejano de hemólisis a la orilla de la copa (en mm.). Anotar los resultados.

Pesar 1 g de material vegetal seco, y extraer con 10 mL. de etanol, calentando en baño de maría
durante 5 minutos. Evaporar a 1 mL. mezclar con 0.5 mL. de agua, y luego extraer con 3 mL. de
butanol. La fase butanólica se utiliza para la cromatografía. Aplicar en una cromatoplaca de silicagel
60 F254.
Estándar: saponinas al 0.1 por ciento en metanol.
Fase móvil: cloroformo-metanol-agua (65:50:10)

Con esta fase móvil se separan todas las mezclas de saponinas contenidas en drogas vegetales. Sin
embargo, la mezcla debe ser preparada EXACTAMENTE. Debe emplearse cloroformo grado analítico
(el de grado técnico contiene alcohol), y la cromatografía debe realizarse a 20°C, 30 minutos después
de haber añadido el solvente, para saturar la cámara. A temperaturas más altas, la separación no es
lo suficientemente adecuada.
Detección:
Reactivo de cloruro de antimonio III: preparar una solución de cloruro de antimonio al 20% en
cloroformo. Asperjar la cromatoplaca, luego calentar por 5-6 minutos a 100°C. Evaluar en visible
(colores rojo-violeta) o bajo luz UV de 365 nm (fluorescencia rojo-violeta, azul y verde).
● Reactivo de sangre: zonas hemolíticas blancas en fondo rojo.
● Reactivo de Liebermann-Burchard: 5 mL de anhídrido acético y 5 mL de ácido sulfúrico

concentrado, agregar 50 mL de etanol todo esto en un baño de hielo. Evaluar en UV-365 o VIS
zonas azules y verdes de saponinas esteroidales, rojas y violetas de triterpenoides
● Reactivo de Komarowsky: 1 mL de ácido sulfúrico al 50% más 10 mL de 4 – hidroxibenzaldehído

en metanol 2%. Evaluar zonas azules, amarillas y rojas en visible.
● Vainillina-ácido sulfúrico y anisaldehído-ácido sulfúrico: evaluar zonas azules, violetas y

amarillentas en visible.
● Detección: Mezclar 0.5 mL. de anisaldehído con 10 mL. de ácido acético glacial, seguido por 85
mL. de metanol y 5 mL. de ácido sulfúrico concentrado, en este orden.
El reactivo tiene limitada estabilidad, y no debe usarse cuando el color se torna rojo-violáceo.
Luego de asperjar la placa, se calienta a 100°C durante 5 – 10 minutos, y se observa en visible o
bajo luz UV 365 nm.

7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Albornoz, A. (1980). Productos Naturales: estudio de las sustancias y drogas extraídas de las plantas.
Universidad Central de Venezuela, Caracas. 616 p.
De Vivar, R. (1985). Productos Naturales de la Flora Mexicana. Limusa. México. 220 p.
Domínguez, X. (1973). Métodos de Investigación Fitoquímica. Limusa. México. 281 p.
Durand, E.; M. Miranda y A. Cuéllar. (1986). Manual de Prácticas de Laboratorio de Farmacognosia.

Universidad de La Habana, Facultad de Farmacia y Alimentos. La Habana. 105 p.
Harborne, J. (1991). Phytochemical Methods. 2 ed. Chapman and Hall. Hong Kong. 288 P.
Lock, O. (1988). Investigación Fitoquímica. Pontificia Universidad Católica del Perú. 213 P.
Real Farmacopea Española. (2002). Real Farmacopea Española. 2ª Ed. Madrid: Ministerio de Sanidad
y Consumo. 2801 p.
Santa Cruz, L. Manual de Laboratorio de Fitoquímica. Universidad de San Carlos de Guatemala,

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia. 53 p.
Sharapin, N. (2000). Fundamentos de Tecnología de Productos Fitoterapéuticos. Santafé de Bogotá:

Convenio Andrés Bello y CYTED. 247 p.
Solis, P., Guerrero, N., Gattuso, S. Cáceres, A. (2003). Manual de Caracterización y Análisis de Drogas
Vegetales y Productos Fitoterapéuticos. OEA/AICD/USAC 089/03. 132 p.
Stahl, E. (Ed.). (1973). Drug Analysis Chromatography and Microscopy. Ann Arbor Science. Michigan.
238 P.
Trease y W. Evans. (1991). Farmacognosia. 13 ed. Interamericana. México. 901 P.
Vila, R & Reing, M. (2003). Métodos de Control de Calidad. Madaus, UB Virtual, Imicromat. 39 p.
Wagner, H.; S. Bladt & E. Zgainski. (1984). Plant Drug Analysis. Springer-Verlag. Berlin Heidelberg.
320 p.
WHO. (1998). Quality control methods for medicinal plant materials. Geneva: WHO. 115 p.

8. ANEXOS
Anexo No. 1.“Diagrama gráfico de Cromatografía en Capa Fina”
Rf: distancia recorrida mx / distancia recorrida solvente
Rx: Rf de mx / Rf de estándar

Anexo No.2 “Resumen Guía APA”
Las citas y referencias bibliográficas son mecanismos para indicar que algunas ideas plasmadas en
un texto redactado por nosotros no son nuestras, sino que fueron generadas por otros autores.
Una cita bibliográfica es un fragmento de texto que expone una idea o un conjunto de ideas basadas
en algún autor, y esa cita incluye la indicación de la fuente de esas ideas.
Existen dos tipos de citas bibliográficas:

● Cita literal o textual: consiste en reproducir exactamente las palabras de otro(s) autor(es).
● Cita de paráfrasis (o no literal): consiste en exponer alguna(s) idea(s) ajena(s), pero
expresada(s) con palabras distintas de las originales.
Una referencia bibliográfica:

“Es un conjunto de datos precisos y detallados con los que un autor facilita la remisión a documentos
impresos, o a una de sus partes, y a sus características editoriales”. Las referencias bibliográficas
deberán consignarse al final del documento ordenadas alfabéticamente.
CITAS LITERALES O TEXTUALES DE LIBROS Y REVISTAS
● Cita literal menor a 40 palabras (o menor o igual a 5 líneas)

Ejemplo de cita literal menor a 40 palabras (o menor o igual a 5 líneas):
“El fenómeno que denominamos vida no puede definirse de forma simple, con una
sola frase” (Campbell y Reece, 2007, p. 2).
Como puede comprobar:

-La cita está entrecomillada.
-Después de la cita hay un paréntesis con el primer apellido del (o los) autor(es), seguido(s) del año,
seguido de la página. Estas tres partes están separadas por comas.
-El punto final está después de ese paréntesis.
● Cita literal mayor a 40 palabras (o mayor o igual a 6 líneas)

Ejemplo de cita literal mayor a 40 palabras (o mayor o igual a 6 líneas):
La biología moderna es tan importante como inspiradora. Los avances en la investigación de

genética y biología molecular están transformando la medicina y la agricultura. La biología
molecular está brindando nuevas herramientas para campos tan diversos como la antropología y la
criminología. Las neurociencias y la biología evolutiva están dando una nueva forma a la psicología
y a la sociología. Los nuevos modelos de la ecología contribuyen a que las sociedades evalúen
aspectos ambientales, como, por ejemplo, las causas y las consecuencias biológicas del
calentamiento global. (Campbell y Reece, 2007, p. 2)
✔ -La cita NO está entrecomillada.

✔ -La cita está escrita en un tamaño de letra menor.
✔ -La cita tiene una mayor sangría.
✔ -El punto final está antes del paréntesis con el (o los) autor(es) y el año.
✔ -Ese paréntesis incluye el mismo contenido que en las citas menores: primer apellido del (o
los) autor(es), año y número de página, separados por comas.
● Casos particulares de citas literales

-Si la cita abarca dos o más páginas, se escribe “pp.” en vez de “p.”. Ej.: “Los científicos con frecuencia
construyen modelos como representaciones menos abstractas de ideas, como teorías o fenómenos
naturales como procesos biológicos” (Campbell y Reece, 2007, pp. 24-25). Si omitimos una parte del
texto citado, lo reemplazamos por puntos suspensivos entre paréntesis o corchetes. En el siguiente
ejemplo se omite el final de la última oración (pero también podría tratarse de una oración entera
o de varias oraciones):
Los avances en la investigación de genética y biología molecular están transformando la medicina y
la agricultura. La biología molecular está brindando nuevas herramientas para campos tan diversos
como la antropología y la criminología. Las neurociencias y la biología evolutiva están dando una
nueva forma a la psicología y a la sociología. Los nuevos modelos de la ecología contribuyen a que
las sociedades evalúen aspectos ambientales […]. (Campbell y Reece, 2007, p. 2)
-Si hay un error de ortografía o de cualquier otro tipo, lo copiamos tal y como está y agregamos “sic”
entre corchetes, para dejar claro que no se trata de un error nuestro (en el ejemplo, debería decir
“definidos”, no “definidas”):“Muy pocas investigaciones científicas siguen rígidamente la secuencia
de pasos definidas [sic] en el „manual‟ del método científico” (Campbell y Reece, 2007, p. 21).
Una opción preferible, en caso de que haya algún error, es optar por una cita de
paráfrasis, como las que se explican a continuación.
CITAS DE PARÁFRASIS, DE LIBROS O REVISTAS
Ejemplo de cita de paráfrasis basada sólo en una fuente:

Los temas unificadores de la Biología son por lo menos once (Campbell y Reece, 2007, 27).
Ejemplo de cita de paráfrasis basada en dos fuentes distintas:

La célula es la unidad estructural y fisiológica de cualquier ser vivo; este concepto es uno de los
temas unificadores fundamentales de la Biología (Campbell y Reece, 2007, 26-27; Solomon, Berg, y
Martin, 2001, 4).

-Las citas NO están entrecomilladas, NI escritas en un tamaño de letra menor, NI tienen una mayor
sangría.
-Después de cada cita hay un paréntesis con la(s) referencia(s), que contiene casi lo mismo que las
citas literales o textuales.
Las únicas diferencias son:
-No se escribe la “p.” de “página” ni las “pp.” de “páginas”.

-Si la cita está basada en 2 o más fuentes, se coloca un punto y coma para separar dos fuentes
distintas.
-El punto final está después de ese paréntesis.
CITAS DE INTERNET
Ejemplo de cita de Internet con autor(es) personal(es) y con fecha de publicación:
[…] el cambio en la concepción de los fenómenos naturales no va a ser posible hasta que, en nuestra
sociedad, no se produzca una profunda reflexión sobre la terrible situación a que han llevado a la
mayor parte de la Humanidad los valores y principios “morales” (inmorales) del libre mercado y la
libre competencia. (Sandín, 2004)
Ejemplo de cita de Internet sin autor personal:
El método científico es el marco de referencia empleado y aceptado por científicos de diferentes

disciplinas para evaluar interrogantes y generar nuevos conocimientos. A pesar de que el método
científico se describe como una serie de pasos, es importante aclarar que no es una fórmula rígida
sino un marco flexible de pensamiento. (Departamento de Biología General, 2009) Ejemplo de cita
de Internet sin fecha de publicación:
“El objeto de estudio de la BIOLOGIA es la vida” (Cortés, s.f.).

-en el caso de información encontrada en Internet o en un documento descargado de Internet, la
mayoría de reglas son las mismas que las anteriormente expuestas. Las únicas diferencias son que:
-Muchas veces no puede indicarse números de página.

-Muchas veces, el autor del documento no es personal, sino una entidad. En este caso se coloca la
entidad como autor.
-Si no se indica ninguna fecha de publicación, se coloca la abreviatura “s.f.” (“sin fecha”).
OBSERVACIONES ACERCA DE FUENTES CON 2 O MÁS AUTORES
Ejemplos de paréntesis que se refieren a 2 o más autores:
(Campbell y Reece, 2007, p. 1)

(Solomon, Berg, y Martin, 2001, p. 4)
(Barrôco, Van Poucke, Bergervoet, De Veylder, Groot, Inzé, Engler, 2005, 149)
(Gibon, Blaesing, Hannemann, Carillo, Höhne, Hendriks… Stitt, 2004, 3304)

-Si son 2 autores: los apellidos se unen con la letra “y” (aunque, si el texto está en inglés, se usa el
símbolo “&”).

-Si son de 3 a 5 autores: todos los apellidos se separan por comas, y antes del último se escribe “y”
(o si el texto estaba en inglés, se usa el símbolo “&”).
-Si son 6 o 7 autores: todos los apellidos se separan sólo por comas.
-Si son 8 o más autores: después del sexto apellido, se colocan puntos suspensivos, y luego se coloca
el último apellido.
Además, si se trata de 3 o más autores: la primera vez que se cita el texto en un documento, se
ponen todos los apellidos. Ej.: (Solomon, Berg, y Martin, 2001, p. 4). Todas las otras veces que se
cita la misma fuente en el mismo documento, se pone sólo el primer apellido y luego la expresión
“y otros”. Ej.: (Solomon y otros, 2001, pp. 3-4).
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
● Libros
Ejemplo de referencia de libro:
Solomon, E.P., Berg, L.R., y Martin, D.W. (2008). Biología. México: McGraw-Hill Interamericana.

-El formato es el siguiente:
Autor, A. A., y Autor, B. B. (Año). Título del Libro. Lugar: Editorial.
-El título lleva mayúsculas al inicio y en todas las palabras clave (sustantivos y adjetivos calificativos).
● Artículos de revistas
Ejemplos de referencias de artículos de revistas:
-Ej. en español:
Véliz, M. E. (2000). La vegetación del volcán de Acatenango, Guatemala. Ciencia y Tecnología, 5(1),
3-166.
-Ejs. en inglés:
Dilkes, B. P., & Comai, L. (2004). A differential dosage hypothesis for parental effects in seed
development. The Plant Cell, 16(12), 3174-3180.
Grelet, J., Benamar, A., Teyssier, E., Avelange-Macherel, M., Grunwald, D., Macherel, D. (2005).
Identification in pea seed mitochondria of a lateembryogenesis abundant protein able to protect
enzymes from drying. Plant Physiology, 137(1), 157-167.
Borner, G. H. H., Sherrier, D. J., Wheimar, T., Michaelson, L. V., Hawkins, N. D.,
MacAskill, A. et al. (2005). Analysis of detergent-resistant membranes in
Arabidopsis. Evidence for plasma membrane lipid rafts. Plant Physiology, 137(1),
94-103.
Como puede comprobar, el formato es el siguiente:
Autor, A. A., Autor, B. B., y Autor, C. C. (Año). Título del artículo. Título de la Revista, xx(x), pp-pp.
Observaciones respecto los autores:

-Para cada autor, se escribe primero el apellido, luego coma, y luego sus iniciales (seguidas de un
punto cada una).
-Si son 2 autores: al igual que en las citas en el texto, los apellidos se unen con la letra “y” (y si el
texto está en inglés, se usa el símbolo “&”).
-Si son de 3 a 6 autores: todos los datos de un autor se separan de los datos del autor siguiente por
medio de una coma.
-Más de 6 autores: se utilizan comas para enumerar a los 6 primeros, y luego se coloca “et al.” (Esta
es una abreviatura de la expresión “y otros” en latín, por lo tanto deberá escribirse en cursivas).
Observación respecto a los títulos:

-El título del artículo sólo lleva mayúsculas al inicio de las oraciones, y en los nombres propios,
mientras que el título de la revista también lleva mayúsculas en todas las palabras clave (adjetivos
calificativos y sustantivos).
Observaciones respecto a las cifras:

-Lo que está indicado como “xx” en el formato es el número de volumen, año o tomo (dependiendo
de la revista), y lo que se coloca en el paréntesis siguiente es el número de la revista.
● Internet
Ejemplo de referencia de información consultada en Internet:
Departamento de Química General. (2011). Manual de prácticas de laboratorio de Química General
I. Guatemala. Recuperado de: http://quimicageneral.blogspot.com/

-Al colocar en la lista de referencias bibliográficas un documento consultado mediante Internet, al
final de la referencia se escribe “Recuperado de” y la dirección de Internet. No se coloca punto
después de esta dirección. Esto es válido para la mayoría de casos de información encontrada en la
red.
Anexo No.3 “Servicios de Emergencia”
Bomberos Municipales 123

Bomberos Voluntarios 122
CIAT (Centro de Información y Asesoría Toxicológica) 1-801-0029832
Conred 119
Cruz Roja 125
Policía Nacional Civil 110, 120
CEGIMED 2230-0539
Hospital Roosevelt 5 ave. 11-40 zona 11 2471-8154

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Universidad de San Carlos de Guatemala

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia

Dra. Sully Margot Cruz Velásquez

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