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REVISIONES MICROBIOLÓGICAS , marzo de 1995, p. Vuelo. 59, No. 1

1–30 0146-0749/95/$04.0010 Copyright q 1995, Sociedad
Estadounidense de Microbiología

Los Factores Sigma de Bacillus subtilis

WILLIAM G. HALDENWANG

Departamento de Microbiología, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas, San Antonio, Texas 78284-7758

INTRODUCCIÓN ................................................. .................................................... .................................................... ......2

COMPARACIÓN ENTRE RNAPs DE E. COLI Y B. SUBTILIS .................................. ..................................3 B. FACTORES SUBTILIS
s ........ .................................................... .................................................... ................................3 FACTORES SIGMA DE CÉLULAS
VEGETATIVAS ............ .................................................... .................................................... ...4 Factor Sigma
sA .................................................. .................................................... .................................................... ..........4 Aislamiento y
caracterización .................................... .................................................... ........................................4 Estructura del operón
sA .... ..................................... .................................................... .......................................5 Regulación del operón
sigA ... .................................................... .................................................... ........................5 E-sA -genes
transcritos.................... .................................................... .................................................... ...................5 Factor Sigma
sB ........................... .................................................... .................................................... ..........................6 Aislamiento y
caracterización ............................... .................................................... .................................................... ......6
Clonación del gen estructural sB .............................................. .................................................... .............................6 Regulación
sB .................. .................................................... .................................................... .....................................7 E-sB -genes
transcritos...... .................................................... .................................................... ................................9 Factor Sigma
sC .............. .................................................... .................................................... .....................................10 Aislamiento y
caracterización ......... .................................................... .................................................... ...............10
Genes transcritos por E-sC ............................................... .................................................... ..........................................10 Factor
Sigma sD.... .................................................... .................................................... .......................................................10 Aislamiento
y caracterización .................................................. .................................................... .........................10
Clonación del gen estructural sD ............................................... .................................................... ..........................10 genes
transcritos por E-sD .................. .................................................... .................................................... ...................10 Factor Sigma
sH........................... .................................................... .................................................... .........................11 Aislamiento y
caracterización ........................... .................................................... .................................................... ...11
Regulación de sH .................................................. .................................................... .................................................... 11 genes
transcritos por E-sH ........................................... .................................................... ..........................................12 Factor Sigma
sL ... .................................................... .................................................... ..........................................12 ESPORULACIÓN -FACTORES
SIGMA ESPECÍFICOS.................................................. .................................................... ......13
Factor Sigma sE ............................................... .................................................... .................................................... .... 13
Aislamiento y caracterización ............................................... .................................................... ..........................13
Clonación del gen estructural sE ............................................... .................................................... ..............................14
Reglamento de la sE ................ .................................................... .................................................... ..............................14 (i)
Síntesis de Pro-sE ........... .................................................... .................................................... ..........................14 (ii)
Procesamiento Pro-sE ............... .................................................... .................................................... ...................14 E-sE
-genes transcritos......................... .................................................... .................................................... ............16 Factor Sigma
sF .................................. .................................................... .................................................... ...........17 Clonación y caracterización
ación.................................................. .................................................... ..........................17 Regulación
sF ............... .................................................... .................................................... ..........................18 (i) Regulación
transcripcional ........... .................................................... .................................................... ..........18 (ii) Regulación
postraduccional ............................... .................................................... ..........................18 genes transcritos por E-
sF .......... .................................................... .................................................... ..........................19 Factor Sigma
sG .................. .................................................... .................................................... ...............................19 Identificación y
clonación.................. .............. .................................................... .................................................... ...19 Regulación
sG .............................................. .................................................... .................................................... .........19 genes transcritos
con E-sG .................................. .................................................... .................................................... ..20 Factor Sigma
sK................................................ .................................................... .................................................... .......21 Aislamiento y
clonación ........................................... .................................................... .................................................... .21 Regulación
SK .................................................... .................................................... .................................................... .......21 (i) Formación de
sigK.................................... ..... .................................................... .............................................21 (ii) SIGK
transcripción .................................................. .................................................... ..................................22 (iii) Procesamiento
Pro-SK ...... .................................................... .................................................... ..........................22 genes transcritos por E-
sK .................. .................................................... .................................................... ...........23 OBSERVACIONES
FINALES ........................... .................................................... .................................................... .........23
AGRADECIMIENTOS ....................................... .................................................... .................................................... ..23
REFERENCIAS .............................................. ............................................................. .................................................... ..........24

1
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2 HALDEN WANG
INTRODUCCIÓN
La regulación de la expresión génica en bacterias ocurre principalmente
a nivel de transcripción. Aunque las proteínas que se unen al ADN
(represores y activadores) pueden afectar significativamente la eficiencia de
la transcripción, la especificidad de la reacción de transcripción se basa en
las interacciones entre la enzima transcriptora (ARN polimerasa [RNAP]) y
los sitios de ADN (promotores) con los que interactúa. hace contacto. Los
RNAP bacterianos se aíslan rutinariamente en dos formas distintas: el
RNAP central, que cataliza la polimerización de ribonucleótidos en el
complemento de ARN de una plantilla de ADN, y la holoenzima RNAP, que
contiene las subunidades de la molécula central (b, b9 y a2) más una
proteína adicional (factor s) que permite que la holoenzima reconozca
elementos promotores e inicie la transcripción en estos sitios. Mucho de lo
que se sabe de las interacciones entre s, core RNAP y promotores provino
originalmente de experimentos con Escherichia coli RNAP (revisado en las
referencias 30 y 39). Estos estudios mostraron que la especificidad de la
holoenzima RNAP por su promotor afín depende de su subunidad sigma y
que la asociación de s con RNAP central es transitoria. La forma de
holoenzima inicia la transcripción; sin embargo, poco después de esta
iniciación, la subunidad s se descarga, dejando una enzima central de
procesamiento para alargar la transcripción iniciada.
Si las células contenían múltiples proteínas sigma con preferencias
promotoras únicas, la sustitución del factor sigma podría ser un potente
vehículo para el control génico. El ciclo de la subunidad s dentro y fuera del
núcleo RNAP durante el ciclo de transcripción brindaría una oportunidad
para el intercambio de factores s y una reprogramación de RNAP. La noción
de que pueden existir múltiples factores s como reguladores de genes
bacterianos se propuso cuando se describieron por primera vez las
propiedades de s (31). Sin embargo, el descubrimiento de factores sigma
alternativos no se produjo de inmediato. Tanto en E. coli como en Bacillus
subtilis, solo se identificó una única forma de factor sigma RNAP para dirigir
la transcripción de las plantillas de ADN disponibles (29, 31, 270). La
evidencia temprana de que RNAP podría ser reprogramado por múltiples
factores s provino de estudios de células infectadas con bacteriófagos. Se
demostró que los bacteriófagos SPO1 y SP82 de B. subtilis y el bacteriófago
T4 de E. coli codifican proteínas reguladoras que son esenciales para la
transcripción de partes de sus genomas (71, 95, 153, 154, 278, 303). El
sistema de fagos de B. subtilis demostró ser más susceptible que el de E.
coli al análisis bioquímico, y fue a partir de células infectadas con SPO1 que
se purificaron los primeros factores sigma "alternativos" (71, 95, 228, 303) .
Estas proteínas cumplían los requisitos de nuevos determinantes de
especificidad. Podrían asociarse con el núcleo RNAP y, en ausencia del
conocido factor s55 de B. subtilis (ahora denominado sA), dirigirlo para que
se una e inicie la transcripción en nuevos promotores de bacteriófagos. Los
detalles del descubrimiento y las propiedades bioquímicas de los factores
del bacteriófago B. subtilis se han resumido previamente en detalle (64,
100). A lo largo de esta revisión, me referiré a las holoenzimas RNAP
individuales como E-sX: E representa el núcleo RNAP y sX representa el
factor s particular que lleva.
Los factores sigma de B. subtilis se designaron inicialmente por un número
que correspondía a sus masas moleculares aparentes (p. ej., s55, 55.000
Da; s37, 37.000 Da). Esta nomenclatura ha sido abandonada y reemplazada
por designaciones de letras (s55 5 sA, s37 5 sB, etc.), lo que permite
incorporar la identidad del factor sigma en su designación genética (p. ej.,
el gen para sA es sigA) (187).
El descubrimiento de múltiples factores sigma en células infectadas con
bacteriófagos estableció un precedente para la reprogramación de RNAP
mediante un cambio en la composición del factor sigma, pero aún faltaba
evidencia directa de factores s alternativos en bacterias no infectadas. Era
posible que el bacteriófago codificado
MICROBIOLÓGICO. RVDO.
Los factores sigma eran simplemente dispositivos especializados para
usurpar la maquinaria biosintética de la célula huésped con fines virales en
lugar de una indicación de que existían múltiples factores s como un modo
general de control genético para ser utilizado por bacterias no infectadas.
La evidencia circunstancial de que múltiples formas de RNAP estaban
presentes en bacterias no infectadas provino de estudios de esporulación de B. subtilis.
La esporulación es una respuesta al hambre por la cual B. subtilis se
convierte de una célula vegetativa en crecimiento activo en una espora
inactiva. Representa una serie de eventos morfológicos y fisiológicos que
ocurren por la activación secuencial y el silenciamiento de bloques de genes
(se puede encontrar una revisión reciente de la esporulación en la referencia
76). Hace más de 20 años se observó que durante la esporulación se
producen cambios en la especificidad de la plantilla del RNAP de la célula
en esporulación. Los bacteriófagos virulentos, que normalmente se
multiplican y lisan B. subtilis en crecimiento vegetativo, no logran replicarse
en bacterias que están esporulando. El genoma del fago entra en la célula
en desarrollo pero queda atrapado y no puede dirigir la síntesis de la
progenie del fago (276, 332).
El hecho de que los genomas virales no se expresen en la esporulación de
B. subtilis es paralelo a una incapacidad progresiva del RNAP extraído de
estas células para transcribir plantillas de bacteriófagos in vitro.
Durante las primeras 2 h después del inicio de la esporulación, hay una
fuerte disminución tanto en la capacidad de las células para soportar una
infección por bacteriófagos productivos como en la actividad del RNAP
extraíble para transcribir bacteriófagos pero no sintéticos [es decir,
poli(dAT) ] ADN in vitro (25, 26, 185). La pérdida en la transcripción
específica del bacteriófago se correlaciona con una pérdida de sA (s55) del
RNAP aislado (25, 185) y llevó a Losick y Sonenshein a sugerir que los
cambios en la especificidad de la plantilla del RNAP durante la esporulación
son responsables de la falla en la replicación del virus. (185). Después de
este hallazgo, los trabajadores del laboratorio de Losick (107, 108, 181) y
otros (98, 129, 219) purificaron el RNAP de B. subtilis en esporulación y
aislaron varias formas de esporulación diferentes de esta enzima. Cada una
de las enzimas tenía estructuras de subunidades y propiedades
cromatográficas distintas. Contenían el mismo componente central RNAP
pero tenían polipéptidos específicos de esporulación adicionales que
variaban en tamaño de 20 000 a 95 000 Da, copurificando con la molécula
central (98, 107, 108, 129, 181, 216, 219).
Aunque se creía ampliamente que estas proteínas asociadas a RNAP
podrían estar contribuyendo a la especificidad alterada del RNAP de la
célula en esporulación, la falta de promotores específicos de esporulación
clonados impidió una prueba directa de su importancia. Se produjo un gran
avance cuando se identificó un gen específico de la esporulación y se clonó
su secuencia codificante en un plásmido de E. coli (265). Este gen de
esporulación clonado (0,4 Kb, ahora conocido como spoVG) fue el primer
gen de B. subtilis que se clonó. Mediante el uso de la transcripción in vitro
de spoVG como ensayo, se aisló una nueva forma de ARN polimerasa que
iniciaba la transcripción en el promotor de spoVG pero no en los promotores
que son reconocidos por la conocida holoenzima E-sA de RNAP de B.
subtilis a partir de la esporulación de B. subtilis (113, 114). El RNAP nuevo
tenía la composición de subunidades del RNAP central más un polipéptido
adicional con una masa molecular aparente de 37.000 Da. Los experimentos
de reconstitución demostraron que la especificidad del promotor de la ARN
polimerasa era una función de esta proteína y que, en ausencia de sA,
confirió al RNAP central la capacidad de unirse e iniciar la transcripción en
un elemento promotor único (114).
A partir de estos criterios, esta proteína se designó como un nuevo factor s
(s37, rebautizado como sB). Casi al mismo tiempo que se descubrió sB , se
detectó y purificó una tercera holoenzima RNAP única (E-s28, ahora E-sD)
a partir de B. subtilis vegetativa sobre la base de la nueva transcripción in
vitro de una bacteria E. coli T7. Plantilla de ADN (143, 324). Desde entonces,
se han identificado siete proteínas s adicionales en B. subtilis. Aunque
ahora se han documentado múltiples factores sigma en varios
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VOLUMEN 59, 1995
especies bacterianas diferentes y es probable que sea una característica
común en la mayoría de las bacterias, si no en todas, B. subtilis sigue
siendo la bacteria con el mayor número de proteínas sigma caracterizadas.
Esta revisión describirá estas proteínas interesantes y su descubrimiento,
funciones probables y regulación inesperadamente compleja.
COMPARACIÓN ENTRE RNAPs DE E. COLI Y B. SUBTILIS
Aunque se supone que gran parte de la bioquímica RNAP aprendida
en E. coli es directamente aplicable a la enzima B. subtilis , los RNAP de
estas bacterias no son idénticos. En E. coli, el polipéptido más grande del
RNAP central es b9, una subunidad que puede unirse al ADN (99, 267),
mientras que la segunda subunidad más grande, b, es el objetivo de los
inhibidores de iniciación rifampicina y estreptolidigina (141, 243). En B.
subtilis, las mutaciones de resistencia a la rifampicina ocurren en b9, la
subunidad más grande (115). Además, las mutaciones que confieren
resistencia a la estreptolidigina no se asignan a esta subunidad, sino que
se encuentran en el gen de la otra subunidad grande, b (116). Se
desconoce la importancia de estas diferencias en la orientación de los
antibióticos.
Más sorprendente que el carácter distintivo potencial de las subunidades
b y b9 de E. coli y B. subtilis es la presencia de una única subunidad
RNAP (d) en B. subtilis. El péptido delta se descubrió como una proteína
de 21 000 Da codificada por el huésped que se asoció con el RNAP
extraído de células infectadas con SPO1 y posteriormente se descubrió
que era un componente normal del RNAP de bacterias no infectadas
(228). In vitro, la adición de proteína d a las reacciones de transcripción
reduce la iniciación inespecífica por RNAP que contiene factores sA o s
codificados por bacteriófagos (2, 3, 62, 277, 302). Aunque hay un informe
de que la unión de s o d al núcleo RNAP es mutuamente excluyente (325),
otros han encontrado que d puede unirse al núcleo RNAP en presencia o
ausencia de s (131). La idea de que d funciona antes del inicio de la
transcripción fue sugerida por un estudio en el que se determinó la
composición de subunidades del RNAP de B. subtilis en condiciones que
permitían la formación de complejos enzima-ADN estables pero que
bloqueaban el inicio de la transcripción o permitió que ocurriera la
transcripción (279).
Se demostró que el péptido delta se liberaba de RNAP tras la formación
de complejos enzima-ADN, mientras que la subunidad sigma no se
liberaba hasta que la transcripción estaba en curso (279).
Los experimentos de protección de metilación y huella de ADN
demostraron que la presencia o ausencia de d tiene poco o ningún efecto
sobre la región de los promotores unidos por Es (1). Este resultado se ha
tomado como evidencia de que d mejora la selectividad del promotor al
limitar el número de posibles interacciones que Es puede hacer con el
ADN en lugar de contribuir al reconocimiento del promotor. En E. coli, se
ha atribuido a s70 tanto las propiedades de reconocimiento de promotores
como la inhibición de la formación de complejos no específicos. Se ha
planteado la hipótesis de que estas funciones pueden asignarse a
proteínas separadas en B. subtilis (1, 120). Ha sido problemático
demostrar un papel para d in vivo. Utilizando un oligonucleótido sintético
como sonda, se clonó y secuenció el gen estructural para d (rpoE) (173).
rpoE no tiene una homología significativa con ninguna otra proteína,
incluidos los factores s y las subunidades RNAP bacterianas conocidas,
y su interrupción no confiere un fenotipo obvio en B. subtilis.
La viabilidad, la esporulación y el crecimiento de bacteriófagos no se ven
afectados en una cepa mutante rpoE (173). Se ha sugerido que si d juega
un papel importante en la expresión génica in vivo, debe haber otros
productos génicos que puedan sustituirlo en el mutante rpoE (173).
Aunque las diferencias en la orientación de los antibióticos para separar
las subunidades centrales de RNAP y la presencia de la proteína d en el
B. FACTORES SUBTILIS SIGMA 3
La enzima B. subtilis implica que los RNAP de B. subtilis y E. coli tienen
cualidades únicas, no parece haber diferencias sustanciales entre las
enzimas centrales en la forma en que interactúan con los factores y los
utilizan. La transcripción por RNAP central de E. coli o B. subtilis puede
estimularse in vitro mediante el factor sigma del otro (322). Además, se
ha demostrado que la proteína sA de B. subtilis dirige el RNAP central de
E. coli a promotores dependientes de sA in vitro (58), y se ha informado
que la síntesis de la proteína sD de B. subtilis en E. coli sustituye a su
proteína E homólogo de .coli (sF ) en la activación de la expresión génica
flagelar (43).
B. FACTORES DE SUBTILIS
Los primeros factores sigma alternativos se descubrieron en B. sub
tilis sobre la base de sus cualidades bioquímicas, y sus genes
estructurales se revelaron en estudios posteriores. Más recientemente,
las búsquedas de homología en las bases de datos de secuencias de
proteínas han invertido el proceso y han establecido varios genes
reguladores clonados como secuencias codificantes de factores putativos.
Los genes estructurales
manera (60, para sE, sF
78, 152, , sG
201, y sL
283, se identificaron de esta
285).
Actualmente hay 10 factores s conocidos en B. subtilis (Cuadro 1).
Nueve de estos han sido clonados, secuenciados y asignados a sitios en
el cromosoma B. subtilis . Estos sitios, junto con las posiciones relativas
en el mapa de las otras subunidades RNAP (b y b9 [rpoBC], a [rpoA] y d
[rpoE]), se ilustran en la Fig. 1. Solo dos de los genes del factor sigma
conocidos ( sigE y sigG) están vinculados.
Los genes restantes del factor sigma están dispersos a lo largo del
cromosoma de B. subtilis sin una justificación obvia para su ubicación.
Las designaciones actuales e históricas de los 10 factores sigma, junto
con sus supuestas funciones y secuencias de promotor objetivo, se
incluyen en la Tabla 1. Los factores sigma que se descubrieron sobre la
base de la actividad bioquímica (p. ej., sA) se designaron inicialmente
sobre la base de su masa aparente cuando se someten a electroforesis
en geles de poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio (SDS) (p. ej., sA 5
s55). Invariablemente, estas masas moleculares aparentes estaban
sobrestimadas. Cuando se clonaron y secuenciaron los genes estructurales
para los factores sigma, se encontró que las masas predichas de sus
productos eran aproximadamente un 20% menores que el tamaño
estimado por sus movilidades en electroforesis en gel de poliacrilamida-
SDS (PAGE). Por lo tanto, s55 se convirtió en s43 (314). La confusión
causada por las estimaciones cambiantes del tamaño del factor s se
redujo con la introducción de designaciones de letras para los factores
sigma (s55 5 s43 5 sA). Las designaciones de letras para los factores
sigma proporcionan una forma sencilla de trasladar su identidad a los
nombres de sus genes estructurales (p. ej., el gen de sA es sigA) (187);
sin embargo, las influencias históricas han complicado la denominación
de los genes del factor sigma.
Por ejemplo, la secuencia del promotor diana y la función de sA son
similares a las del factor sigma principal de E. coli (s70), lo que condujo a
que al gen estructural de sA se le diera la designación genética utilizada
para su homólogo de E. coli (es decir, rpoD)
(239). Además, se descubrió que varios de los factores sigma eran
productos de genes que se identificaron originalmente como loci
esenciales para la esporulación y se designaron sobre la base de esta
característica (p. ej., sH está codificado por spo0H) (70). Estas
designaciones se incluyen en la Tabla 1.
La Tabla 1 también enumera las funciones generalmente aceptadas
de los regulones que dirige cada factor sigma. Cabe señalar, sin embargo,
que esta lista de funciones es casi seguro que está incompleta debido a
la representación limitada de genes candidatos para algunos de los
factores sigma (p. ej., sB y sC). El pequeño número de "genes diana"
disponibles para algunos de los factores sigma también compromete la
lista de secuencias de consenso. Aunque la mayoría de las secuencias
de consenso se basan en homologías compartidas por muchos promotores
y verificadas por estudios mutacionales (p. ej., sA y sE),
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4 HALDEN WANG MICROBIOLÓGICO. RVDO.

CUADRO 1. Factores de B. subtilisa

Secuencia promotorab
factor sigma
(alternativa gen(es) Función Referencia
Espaciador
designacion) 235 210
(pb)

Célula vegetativa
factores
sA (s43, s55) sigA, rpoD Limpieza/esporulación temprana TTGACA 17 TATAAT 210
sB (s37) sC sigB Respuesta general al estrés RGGXTTRA 14 GGGTAT 24
(s32) sD ( s28 ) SIGD Expresión génica postexponencial AAATC 15 TAXTGYTTZTA 145
desconocido , flaB Quimiotaxis/autolisina/gen flagelar TAAA 15 GCCGATAT 119
expresión
sh ( s30 ) suspiro, spoOH Expresión génica postexponencial; RWAGGAXXT 14 HGAAT 237
competencia y esporulación temprana
genes
SL firmado L Expresión del gen de la enzima degradativa TGGCAC 5 TTGCANNN 59

Específico de esporulación
factores
SE (s29) sigE, spoIIGB Expresión génica de células madre tempranas ZHATAXX 14 CATACAHT 252
SF (sspoIIAC) sigF, spoIIAC Expresión génica temprana de la espora GCATR 15 291
sG SK (s27) sigG, spoIIIG Expresión génica de esporas tardías GTR 18 CATXHTA 217
sigK, spoIVCB:spoIIIC Expresión génica de células madre tardías C.A. 17 CATANNNTA 338

a Se enumeran las designaciones de las proteínas sigma y sus genes estructurales, así como las posibles funciones de sus regulones. Las referencias de cada artículo se pueden encontrar en
el texto. Las probables secuencias de consenso para las formas de holoenzimas están alineadas en sus posiciones 210 (subrayadas). La región espaciadora representa el número de bases
entre la base de la región 210 más arriba que se proporciona y la base más abajo de la región 235. La referencia para cada secuencia de consenso se enumera a su
Correcto.
B
H, A o C; N, A, G, C o T; R, A o G; W, A, G o C; X, A o T; Y, C o T; Z, T o G.

otros (p. ej., sC) se infieren de tan solo dos promotores. A
A continuación se presenta una descripción detallada de cada uno de los factores sigma.
FACTORES SIGMA DE CÉLULAS VEGETATIVAS
Factor Sigma sA
Aislamiento y caracterización. sA es el principal sigma
factor presente en el crecimiento vegetativo de B. subtilis. E-sA fue el
primera holoenzima aislada de B. subtilis, siendo fácilmente purificada
por las técnicas cromatográficas estándar que habían sido
utilizado para el aislamiento de la enzima E. coli (8, 185, 190, 234,
270, 271). sA, como su homólogo de E. coli s70, es separable de
core RNAP por cromatografía en fosfocelulosa (190,
271). La proteína sA tiene una masa molecular aparente de 55.000
Da cuando se somete a electroforesis a través de geles de SDS-poliacrilamida (8,
270, 271). La adición de sA purificada a la polimerasa de ARN central
estimula la transcripción in vitro de varios B. subtilis
HIGO. 1. Ubicaciones cromosómicas de las subunidades RNAP de B. subtilis . el mapa es
basado en los mapas de Henner y Hoch (124) y Losick et al. (187). RNAP
las subunidades están representadas en el exterior del mapa, con puntos de referencia "vinculados"
dibujado dentro del círculo. Se indican min 360/0, 90, 180 y 270.
ADN de bacteriófagos, así como fagos T4 de E. coli y sintéticos
[poli(dA-dT)] ADN (41, 190, 271, 302). La especificidad de
E-sA parece ser muy similar a la de E. coli E-s70. Temprano
estudios de transcripción revelaron que E. coli RNAP y E-sA
se unió a los mismos fragmentos generados por endonucleasas de restricción
de ADN de B. subtilis SPO1 e inició la transcripción en similar
sitios en SPO1 (100, 176) y f29 (57, 58) ADN. Más recientemente, los
experimentos genéticos demostraron que homólogos
las sustituciones en sA y s70 tienen consecuencias similares para el
reconocimiento del promotor (160). Aunque las especificidades de
transcripción de las holoenzimas de B. subtilis y E. coli son similares,
no son idénticos. E. coli RNAP puede iniciar la transcripción en
sitios adicionales en la plantilla f29 que no son utilizados por E-sA (58).
Además, E-sA transcribe el ADN de T4 relativamente mal (271)
e interactúa más débilmente con los sitios promotores de T7 (323) que
hace la enzima E. coli . En un estudio, E-sA transcribió un
Promotor SPO1 30 veces más efectivo que el lacUV5
promotor, mientras que el E-s70 fue solo un 50 % más activo en el SPO1
promotor (176). Cuando se clonaron promotores dependientes de sA
y secuenciado, se encontró que sus secuencias comunes, en
las regiones conocidas por ser importantes en el reconocimiento del promotor por
s70 (es decir, bp 210 y 235), eran idénticos a sus contrapartes
en promotores dependientes de s70 (176, 210, 214). Para dar cuenta de la
diferencia de especificidad entre las holoenzimas a la luz de
regiones de reconocimiento 210 y 235 idénticas, elementos de secuencia
adicionales, ya sea entre estas regiones o aguas arriba de
la región 235, se propusieron ser importantes para el uso eficiente
de promotores por E-sA (176, 210, 214). Un estudio intentó
identificar tales elementos aislando promotores lacUV5 mutantes
que mostró una mayor actividad en B. subtilis (123). Mutaciones
que confieren el fenotipo deseado se encontraron agrupados
entre bp 218 y 214 y cerca del inicio de la transcripción
sitio. La mayoría de las mutaciones tuvieron poco efecto sobre la actividad del promotor.
en E. coli, pero aumentaron la actividad lacUV5 hasta 28 veces
en B. subtilis. Se concluyó que aunque las secuencias en
las regiones altamente conservadas 235 y 210 del promotor son
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VOLUMEN 59, 1995
HIGO. 2. Operón sigA de B. subtilis . El operón sigA , basado en una descripción general
de Qi et al. (242), se dibuja con el operón rpoD de E. coli (32) proporcionado para comparación.
Los genes dnaE/ dnaG y sigA/ rpoD codifican proteínas homólogas. Se ilustran los seis
promotores de sigA (P1 a P6) y los sitios de inicio aproximados de sus ARNm (flechas). Se
indica la forma de RNAP que reconoce cada promotor, si se conoce.
secuencias adicionales importantes en la región promotora
contribuyen a la expresión génica en B. subtilis (123).
Estructura del operón sA . El gen estructural para sA se aisló
utilizando un anticuerpo anti-sA policlonal para sondear una biblioteca
genómica de B. subtilis (239). La secuencia de nucleótidos del ADN
clonado reveló dos genes que preceden a sigA (314). Los tres genes
están organizados en un operón que es similar al operón que codifica
s70 de E. coli (Fig. 2). El operón de E. coli especifica tres productos:
la proteína ribosómica S21 (rpsU), la ADN primasa (dnaG) y la s70
(rpoD) (32). Los tres genes que forman el operón sA de B. subtilis
son P23, dnaE y rpoD (sigA) (314). Tanto dnaE como sigA se parecen
a los genes de E. coli . dnaE codifica una proteína de 68.428 Da con
una similitud significativa (31 %) con la ADN primasa de E. coli (318).
El producto sigA/ rpoD (42 828 Da) es más del 50 % homólogo con
s70 (105, 314).
Las similitudes que se encuentran en los dos genes promotores
distales de los operones de E. coli y B. subtilis no se extienden al
primer gen de los operones. P23 tiene más del doble del tamaño de
S21 y no comparte homología con él (314). La secuencia de P23
contiene tres sitios potenciales de iniciación de la traducción que, si
se usan, formarían proteínas de 23 000 (P23), 19 000 (P19) y 9 000
(P9) Da con el mismo extremo carboxi. Los estudios de proteínas de
fusión, utilizando E. coli lacZ como gen informador, han demostrado
que los tres sitios de iniciación de la traducción se utilizan in vivo y
que su expresión está regulada por el desarrollo (316). Durante el
crecimiento vegetativo, se sintetizan P23 y P19 pero no P9; sin
embargo, cuando se alcanza la fase estacionaria, se produce un
cambio de promotor dentro del operón (ver más abajo), lo que hace
que P9 se convierta en el producto de traducción principal (316). La
función P23 es desconocida. Los estudios de mutagénesis en los que
se inactivó P23 mediante la inserción de un gen de cloranfenicol
acetiltransferasa (CAT) en su interior no revelaron ningún efecto
perjudicial evidente sobre el crecimiento o la esporulación (343). Un
mutante en el que se eliminó P23 esporuló antes que la cepa de tipo
salvaje; sin embargo, esta deleción también eliminó uno de los
promotores dependientes de sH del operón, lo que hace que la causa
del fenotipo de esporulación alterado no esté clara (343).
Regulación del operón sigA . Dos de los tres genes codificados
por el operón sigA son esenciales para el crecimiento. Por lo tanto,
no es descabellado esperar que la célula proporcione múltiples
medios por los que estos productos génicos podrían expresarse en
respuesta a una serie de condiciones de crecimiento diferentes.
B. FACTORES SUBTILIS SIGMA 5
La transcripción observada del operón sigA parece confirmar esta
noción. Se han identificado y caracterizado seis promotores del
operón sigA (Fig. 2). Los promotores P1 y P2 son activos a un nivel
significativo solo durante el crecimiento vegetativo, siendo utilizado
P2 en mayor medida que P1 (317). Se encontró que P1 y P2
contenían secuencias típicas de promotores reconocidos por sA, con
la región 235 de P2 superpuesta a la región 210 de P1 (317). No se
ha determinado por qué dos promotores superpuestos similares
dirigen la expresión vegetativa de sigA .
Un tercer promotor, P3, difiere de los dos anteriores tanto en la
secuencia como en el tiempo de expresión. P3 no es activo durante
el crecimiento vegetativo, pero se usa después de que B. subtilis
comienza a esporular (317). La secuencia de P3, así como su tiempo
de expresión, sugirió que podría transcribirse mediante una forma
alternativa de RNAP. Inicialmente se propuso que E-sB fuera la
enzima transcriptora (317); sin embargo, los estudios de expresión
de sigA en mutantes de B. subtilis que carecían de sB demostraron
que no se necesita sB para la expresión de P3 (38). En cambio, E-sH
parece ser la enzima que reconoce P3. E-sH usa P3 de manera
eficiente y precisa in vitro, y la transcripción de P3 no se sintetiza en
células que carecen de sH (38). Se cree que sH dirige la expresión
génica posterior a la fase exponencial (ver más abajo), por lo que la
identificación de un promotor E-sH para el operón sigA puede verse
como una indicación de la necesidad de una expresión continua de
sigA después del final del crecimiento vegetativo ( 38). Posteriormente
se demostró un segundo promotor dependiente de sH (P4) (241).
Ambos promotores dependientes de sH se emplean a niveles bajos
durante el crecimiento vegetativo y se activan durante la fase
estacionaria temprana (241). La expresión del promotor dependiente
de sH corriente arriba (P3) permite la transcripción de una parte del
gen P23 (316) así como de los genes dnaE y sigA (317); sin embargo,
la expresión de P4, que se encuentra en el sitio de unión al ribosoma
(RBS) de dnaE, da como resultado la expresión solo del gen sigA
debido a la abreviatura de dnaE RBS en el transcrito dirigido por P4
(241). Por lo tanto, el cambio de promotor parece alterar el patrón de
expresión del operón.
Aparte de los cambios en P23, que son de significado desconocido,
existe la posibilidad de que continúe la síntesis de sA en células
posteriores a la fase exponencial, pero con una expresión reducida
de dnaE (primasa). Se ha propuesto que esto está de acuerdo con el
cese de la replicación cromosómica que ocurre en este momento
(241). Recientemente, se descubrió un quinto promotor (P5) en
estudios de extensión de cebador y sonda de promotor (242). A
diferencia de los otros cuatro promotores, la transcripción de P5 no
se hace evidente hasta 3 a 5 h después del inicio de la esporulación (242).
Las mutaciones en los genes de los factores s (sE, sG, sH y sK) que
se sabe que son necesarios durante la esporulación no bloquearon
la transcripción de P5, aunque las mutaciones en el sistema activador-
represor del gen de la esporulación (Spo0A) redujeron severamente
la expresión de P5. P5 (242). La existencia de P5 se toma como
evidencia de que sA tiene un papel continuo durante las últimas
etapas de la esporulación (242). No se ha determinado si se necesita
una forma desconocida de RNAP para la transcripción de P5 o si una
holoenzima conocida (p. ej., E-sA), junto con las proteínas de unión
al ADN, desencadena la activación de P5. Hay un sexto promotor
(P6) en el operón sigA que no está completamente definido pero
parece usarse cuando B. subtilis se expone a temperaturas elevadas
(315). P6 está posicionado en el operón para permitir solo la expresión
de sA (Fig. 2). P6 puede representar un mecanismo para la síntesis
de sA durante el estrés térmico, como ocurre con un s70 en E. coli
después de un choque térmico (299).
genes transcritos por E-sA . sA es el factor sigma más abundante
que se encuentra en RNAP purificado de B. subtilis en crecimiento
vegetativo (63, 270) y también el más similar a s70, el factor s primario
de E. coli (120). sA y s70 tienen una secuencia promotora de
consenso similar (120) y son los factores sigma del huésped que
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6 HALDEN WANG
dirigir la transcripción de genes de bacteriófagos después de la infección por
sus respectivos virus (64, 120, 176, 278). Estas
similitudes argumentan que sA es la contraparte de B. subtilis de s70
y, como tal, es probable que dirija la transcripción de la mayoría de los B.
subtilis genes expresados durante el crecimiento en medio rico. Además de
expresar estos "genes domésticos", sA también es
involucrados en la expresión génica especializada. Las regiones promotoras
inducibles por daños en el ADN (din) de B. subtilis contienen
secuencias de reconocimiento (44), al igual que al menos algunos de los genes
que se requieren para la respuesta al choque térmico (40, 180, 321)
y las funciones de fase estacionaria de B. subtilis de degradación
síntesis de enzimas (225) y el desarrollo de la competencia
para la transformación del ADN (68). sA también juega un papel en la
expresión de genes de esporulación temprana. Varias mutaciones de
esporulación resistentes a catabolitos (crsA) , que superan la
efectos represores de la glucosa en la esporulación y suprime parcialmente
algunas mutaciones en los genes reguladores de la esporulación (spo0B,
spo0E, spo0F, spo0K y spoIIN/ spoIIG279), se han encontrado
ser cambios de base dentro de la secuencia de codificación para sigA (155,
156, 177, 238). Por el contrario, los supresores intergénicos de un crsA
mutación fueron aislados y mapeados a spo0A, spo0B y
genes spo0E (156). Spo0A es una proteína de unión al ADN que
funciona como un activador-represor transcripcional de la expresión génica
posterior a la fase exponencial (28, 127). Es crítico para el
iniciación de la esporulación, con varias de las otras etapas 0
productos génicos de esporulación que participan en la activación de Spo0A.
La evidencia genética de una interacción entre sigA y los componentes de la
máquina reguladora spo0A sugirió que sA tiene un
papel en la expresión de genes que están implicados en el inicio de
esporulación (238). La evidencia explícita de este papel vino con el
descubrimiento de que las sustituciones de bases específicas en los elementos
promotores de los genes de esporulación dependientes de spo0A spoIIG y
spoIIE podría suprimirse mediante sustituciones de aminoácidos en sA
(158, 161, 258, 334). Transcripción de spoIIG y spoIIE hace
no comenzar hasta después del inicio de la esporulación; por lo tanto, al menos
parte de la actividad de sA persiste en las primeras etapas de este proceso
(101, 109, 159, 334).
Aunque existe una clara evidencia de que sA tiene una función en
expresión temprana del gen de la espora, su papel en tiempos posteriores en
la esporulación es controvertido. La pérdida de actividad de sA y la desaparición
de E-sA extraíble de la esporulación de B. subtilis fue un
indicación temprana de la heterogeneidad RNAP de este organismo (25,
182); sin embargo, hay informes de que algunos investigadores están
capaz de aislar E-sA de B. subtilis en esporulación (63). Aunque
E-sA no se aísla rutinariamente de B. subtilis en esporulación, las sondas
inmunológicas pueden detectar sA en estas células (73, 301).
El anticuerpo anti-sA inmunoprecipita cantidades similares de sA
a partir de extractos crudos de células que estaban creciendo vegetativamente
o que habían progresado de 3 a 4 horas hasta la esporulación (301). los
la segregación de sA de RNAP durante la purificación de RNAP fue
resultó ser un fenómeno sensible al cloranfenicol. La adición de cloranfenicol a
la esporulación de B. subtilis restaura rápidamente tanto la actividad de sA en
las células tratadas como la capacidad de
aislar E-sA de sus extractos (266). A partir de estos resultados,
Se planteó la hipótesis de que las células esporulantes contenían un inestable
(vida media, 11 min) inhibidor de sA que puede agotarse
después del tratamiento con cloranfenicol para permitir la reforma de
E-sA (266). Este hipotético inhibidor de sA y su propuesta
inestabilidad podría explicar la disparidad entre los investigadores
habilidades para aislar E-sA de cultivos de B. subtilis en esporulación.
La pérdida del inhibidor putativo de algunas preparaciones puede
ser responsable de la reforma de E-sA.
El papel, si lo hay, de sA en la expresión génica tardía de esporas permanece
indefinido. El aislamiento de E-sA de la esporulación de B. subtilis
(63) y el descubrimiento de un promotor (P5) dentro de la sigA
operón que puede dirigir la síntesis de sA tarde en la esporulación
MICROBIOLÓGICO. RVDO.
(242) ofrecen la posibilidad de que E-sA pueda ser necesaria tarde en
desarrollo. Presumiblemente, su papel en este momento implicaría
dirigiendo la transcripción de genes dependientes de sA cuya expresión debe
persistir a lo largo de la esporulación. sin embargo, el
dificultad con la que E-sA se aísla de las células esporulantes (25,
182) y la pérdida de la expresión del gen del bacteriófago (25, 185)
después del inicio de la esporulación sugieren que una vez que el temprano
se expresan los genes de esporulación, sA puede volverse en gran medida
inactivo. Si esto es así, la posible síntesis de sA tarde en la esporulación
(242) podría representar un dispositivo para proporcionar a la espora sA
que se inactiva y almacena para su uso durante la germinación y
crecimiento (33).
Factor Sigma sB
Aislamiento y caracterización. sB, el primer factor s alternativo que se
encuentra en las bacterias, se detectó como una subunidad de un
Holoenzima RNAP que transcribió un gen de esporulación clonado
(0.4Kb/ spoVG) in vitro (113). spoVG no se pudo transcribir
in vitro por E-sA purificado pero fue transcrito por RNAP parcialmente purificado
que había sido preparado a partir de esporulación de B. sub tilis (113). La
enzima responsable de la transcripción, resuelta por cromatografía secuencial
sobre fosfocelulosa y
Se descubrió que la celulosa del ADN era un componente menor de la
población total RNAP (114). Tenía la composición de subunidades
de core RNAP más una proteína adicional (s37/sB) con un
masa molecular aparente de 37.000 Da. sB, a diferencia de sA, no
separar del núcleo RNAP durante la cromatografía en fosfocelulosa (113).
Aunque esta característica ayudó en la
purificación inicial de E-sB, complicó el aislamiento de sB
para estudios de reconstitución. Disociación de E-sB altamente purificado
con urea 6 M seguido de fraccionamiento de las subunidades por
se usó cromatografía de fosfocelulosa para aislar el sB
proteína (114). La subunidad sB fraccionada , cuando se vuelve a agregar
al núcleo RNAP purificado, reconstituido una holoenzima que
se unen selectivamente e inician la transcripción de los promotores (ctc
y spoVG) que no fueron reconocidos por E-sA (114). los
probables secuencias promotoras de estos genes argumentaron que E-sB
estaba reconociendo un elemento de la secuencia de nucleótidos (Tabla 1) que
era distinta de la utilizada por E-sA (208–211, 297). E-sB fue
aislado inicialmente de B. subtilis en esporulación temprana; sin embargo,
estudios posteriores demostraron que es principalmente un factor de células
vegetativas. Los niveles de E-sB y E-sA purificados de
B. subtilis en crecimiento vegetativo o esporulación disminuye en paralelo a
medida que las células avanzan en el desarrollo, de modo que a las 2 h después
el inicio de la esporulación, los niveles de ambas enzimas se reducen
notablemente (112). Aunque el período de abundancia de E-sB es paralelo al
de E-sA, la cantidad de E-sB presente en forma vegetativa
células en crecimiento o esporulación temprana es menos del 5% de la E-sA
nivel (112, 113). Por lo tanto, en comparación con sA, sB es un factor sigma de
abundancia menor.
Clonación del gen estructural sB . El gen que codifica sB
fue clonado y secuenciado de forma independiente por dos laboratorios,
utilizando una secuencia de oligonucleótidos deducida (18) o anticuerpos
policlonales anti-sB (75) como sondas para identificar la región codificante de
sB . La secuencia de nucleótidos de sigB especifica un
proteína de 30.143 Da cuya secuencia de aminoácidos predicha
muestra una homología significativa con la de las proteínas s conocidas (18,
75). La interrupción de la secuencia sigB no tiene un efecto evidente en
la capacidad de B. subtilis para crecer o esporular (18, 75).
Se revela el análisis de secuencia de la región que rodea a sigB
la presencia de tres marcos de lectura abiertos adicionales, que
inicialmente se llamaban orfV, orfW y orfX , pero se les cambió el nombre a rsb
(regulador de sigma B) una vez establecido su papel en el control de sB (Fig.
3) (75, 151). rsbV, rsbW y rsbX se calculan para
codifican proteínas de 12 000, 18 000 y 22 000 Da, respectivamente
Machine Translated by Google
VOLUMEN 59, 1995
HIGO. 3. B. subtilis operones sigB y sigF . Los sigB (A) y sigF (spoIIA) (B)
los operones se dibujan en base a los datos de Kalman et al. (151) y Fort y Piggot
(91), respectivamente. rsbV/ W y spoIIAA/ AB codifican proteínas homólogas, con el
codón de iniciación del miembro aguas abajo del par (es decir, rsbW y spoIIAB)
superposición del codón de terminación del miembro aguas arriba (rsbV o spoIIAA).
Trece codones del gen estructural sigB están contenidos dentro de rsbW, mientras que el
El gen estructural sigF está separado por 11 pb del codón de terminación spoIIAB .
El operón sigB contiene un cuarto gen (rsbX) que no se encuentra en el operón sigF .
El codón de iniciación de rsbX se superpone al codón de terminación de sigB. sigB y sigF ambos
tener al menos dos promotores, siendo los principales promotores de cada operón
dependiente de E-sB y E-sH, respectivamente.
(151). El orden de los genes es rsbV-rsbW-sigB-rsbX, con los codones de
iniciación para rsbW y rsbX superpuestos a los de terminación .
codones para rsbV y sigB, respectivamente, y los primeros 13 codones
de sigB dentro, pero fuera del marco, con los últimos codones de
rsbW (151). La extensión del cebador y el mapeo de la nucleasa S1 demostraron
que el ARN del operón principal sigB inicia 32 nucleótidos aguas arriba de rsbV
y termina 34 nucleótidos aguas abajo de rsbX (151). sigB es por lo tanto el
tercer gen de un
operón de cuatro genes. Una comparación de la secuencia de la sigB
operón con secuencias en un banco de datos de proteínas reveló una
sorprendente similitud de la organización genética del operón sigB a
la del operón sigF de B. subtilis (spoIIA) (151). Ambos sigma
Los genes del factor están precedidos en sus respectivos operones por dos
proteínas altamente homólogas (RsbV, SpoIIAA; RsbW, SpoI IAB) (Fig. 3).
RsbV tiene una identidad de secuencia de aminoácidos del 32% con
SpoIIAA y RsbW tiene un 27% de identidad con SpoIIAB (151).
A partir de estas similitudes, se especuló que estas proteínas
pares pueden regular sus respectivos factores sigma por un similar
mecanismo molecular y que los operones spoIIA y sigB
podría controlar ramas divergentes de post-fase exponencial
expresión génica (151).
regulación SB . El gen estructural sB es el tercer gen en un
operón de cuatro genes cuyo principal promotor es en sí mismo dependiente
en E-sB (151). La secuencia de nucleótidos del promotor tiene
la secuencia consenso en 210 y 235 encontrada en otros promotores
dependientes de sB (151). Además, la actividad de la
promotor, medido por medio de una fusión transcripcional sigB-lacZ (151) o
por análisis Northern (transferencia de ARN) (13), es
eliminado en cepas de B. subtilis con mutaciones nulas en el sB
gen estructural. Al menos un promotor adicional para el sigB
operón, que no depende de sB para su actividad, es probable
existir. Plásmidos que forman fusiones transcripcionales y expresan el gen lacZ
de E. coli al integrarse en operones activos
se encontró que mostraban actividad de b-galactosidasa cuando ingresaban al
operón sigB aguas arriba de la región codificante de sB (151).
Este evento de integración debería haber interrumpido la síntesis de sB , y
sin embargo, persistió la transcripción en el gen informador. No hay
sitio de terminación obvio aguas arriba del operón sigB . Esta
B. FACTORES SUBTILIS SIGMA 7
deja abierta la posibilidad de que la transcripción de un upstream
promotor u operón podría extenderse a sigB. El RNAP responsable de esta
transcripción y las condiciones en las que se
contribuye a la expresión de sigB son desconocidos. bajo rutina
condiciones de cultivo, la expresión del operón sigB depende de sB y
probablemente se origina en el promotor inmediatamente antes de rsbV.
El promotor dependiente de sB del operón sigB está regulado principalmente
por la actividad de la propia sB . Aunque la actividad de sB no cambia
dramáticamente bajo la cultura convencional
condiciones (13, 151), tiene el potencial de ser silenciado o
activado a niveles muy altos por los productos de los otros genes
dentro del operón sigB (13–15, 75, 133, 151, 312). lo mas
El gen promotor-distal del operón sigB fue el primero en ser
implicado como regulador de la actividad de sB . Dos grupos descubrieron de
forma independiente que las mutaciones nulas en rsbX causaron tanto una
elevación en la expresión de promotores dependientes de sB y una
inhibición del crecimiento de cepas de B. subtilis que portaban la
mutaciones (75, 133). La inhibición del crecimiento observada en el
Las cepas RsbX2 fueron aliviadas por mutaciones secundarias dentro del
región de codificación sB (75, 133). Se propuso que RsbX fuera
un regulador negativo de la síntesis o actividad de sB , con la mayor
la actividad de sB en su ausencia es perjudicial para el crecimiento de B. subtilis
(75, 133, 151). Los roles de RsbV y RsbW como reguladores adicionales de la
actividad de sB se propusieron por primera vez sobre la base de su
similitud con los genes reguladores contenidos en spoIIA, el sF
operón (151). Una prueba directa de la importancia de rsbV y rsbW
en la regulación de sB provino de estudios en los que sus secuencias de
codificación fueron inactivadas por mutaciones de cambio de marco dirigido
(13) o de eliminación de marco (23). Las mutaciones en rsbW, como las de
rsbX, dio como resultado una expresión elevada de los promotores dependientes
de sB. Por el contrario, se encontró que la actividad del promotor dependiente
de sB en cepas de B. sub tilis con mutaciones en rsbV era virtualmente
inexistente, parecido al nivel de actividad que se encuentra en mutantes
cepas que carecen de sB en sí. RsbW y RsbX actuaron así como
reguladores negativos de sB, mientras que RsbV se comportó como un
regulador. Se encontró que las mutaciones de rsbV eran epistáticas para rsbX
mutaciones pero subordinadas a mutaciones en rsbW. Estos resultados
se interpretaron como evidencia de que RsbW es el principal regulador negativo
de sB, siendo necesario RsbV para contrarrestar su efecto .
efectos inhibitorios (13, 23). Debido a que RsbV debe estar presente para
RsbX para ejercer su efecto, su sitio de regulación negativa es
se cree que está aguas arriba de RsbV/RsbW en el camino regulatorio (13, 15,
23).
Los resultados antes mencionados no distinguieron entre un
efecto de las proteínas rsbV , rsbW y rsbX en el sB-dependiente
promotor de sigB solo o en promotores adicionales que son
reconocido por E-sB. Aunque las mutaciones en rsbV, rsbW y
rsbX tiene efectos idénticos en la actividad de los promotores sigB y ctc
dependientes de sB , el efecto de las mutaciones
en la transcripción ctc podría ser indirecta, es decir, una consecuencia de
su influencia en la expresión de sigB y los cambios resultantes en
niveles de SB . Estudios en los que el promotor de sigB dependiente de sB
fue eliminado y reemplazado con un promotor inducible dependiente de SA
(PSPAC) argumentó que el sistema regulador rsbV/ rsbW es
no se limita a la expresión de sigB (15, 23). En B. subtilis
cepas en las que la expresión de sigB depende de PSPAC, la
La transcripción de ctc dependiente de sB sigue siendo sensible al rsbV/
Red rsbW : es decir, incluso con un operón sigB controlado por PSPAC , ctc
la transcripción es apenas detectable en una cepa mutante de rsbV y
expresado en niveles muy altos en una cepa mutante rsbW (15, 23).
Sobre la base de este hallazgo, se concluyó que RsbV y RsbW
ser reguladores generales de la actividad de sB . A diferencia del RsbW-RsbV
par, las mutaciones de RsbX no tuvieron un efecto aparente sobre la actividad de sB
cuando el operón sigB se expresó desde PSPAC (15, 23).
Aunque este hallazgo sugirió que RsbX controla sigB
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8 HALDEN WANG
expresión del operón y no el estado de actividad de sB , tal
La noción no se concilió fácilmente con la observación de que los promotores
dependientes de sB se expresan en niveles muy altos en
Cepas RsbX2 RsbW1 RsbV1 . Se esperaría que si un
la pérdida de RsbX simplemente elevó la expresión de la sigB
operón, la síntesis coordinadamente mejorada de RsbW así como
ya que sB continuaría inhibiendo sB.
Esta aparente paradoja se resolvió con el descubrimiento de un
gen regulador sigB adicional , rsbU, cuyo producto es esencial para la vía
regulada por RsbX (312). Este gen, mintiendo
inmediatamente aguas arriba del operón sigB , se interrumpió durante
la construcción de las cepas utilizadas en algunos de los primeros rsbX
estudios (15). Si rsbU está intacto, la inactivación de RsbX da como resultado una
aumento dramático en la transcripción dependiente de sB independientemente de
si el operón sigB se expresa a partir de su promotor normal
o PSPAC (312). El aumento de la actividad de sB después de una pérdida de
RsbX aún requiere un RsbV funcional. Los datos son consistentes
siendo RsbX un regulador indirecto de la actividad de sB , inhibiendo un
proceso dependiente de RsbU que estimula la capacidad de RsbV
para contrarrestar RsbW. Aunque faltan detalles importantes de las interacciones
de RsbU, X, V y W, la información básica
El mecanismo por el cual RsbW inhibe la transcripción dependiente de sB se
está volviendo claro.
Se han encontrado anticuerpos específicos para RsbW o sB
para coprecipitar ambas proteínas a partir de extractos celulares crudos (14). En
Además, los estudios de filtración en gel, junto con los análisis Western
(inmunotransferencia), demostraron que la unión de sB a
RNAP y su asociación con RsbW son mutuamente excluyentes
(14). En experimentos de reconstitución, en los que se purifica parcialmente
sB y RsbW se agregaron al núcleo RNAP in vitro, RsbW
bloqueó eficientemente la transcripción dependiente de sB, pero solo si
se incubó con sB antes de la adición de núcleo RNAP
(14). Tomados en conjunto, estos resultados apoyan un modelo (14) en
que RsbW funciona como un factor anti-s, uniéndose a sB y
previniendo la asociación de sB con el núcleo RNAP.
El papel de RsbV como regulador positivo parece implicar mantener a sB
libre de complejos RsbW-sB . Los estudios de cromatografía de filtración en gel
y electroforesis en gel no desnaturalizante visualizaron complejos de RsbW-
RsbV que eran distintos de los
complejos RsbW-sB (72). Los datos apoyan un modelo en el que
RsbV se une directamente a RsbW y bloquea su capacidad para formar el
complejo RsbW-sB . Por lo tanto, la actividad de sB parecería estar controlada
por la asociación diferencial de RsbW con sB
o RsbV. Los factores que determinan si RsbW se unirá a
RsbV o sB son en gran parte desconocidos; sin embargo, se han propuesto
dos condiciones para influir en la decisión vinculante de RsbW. La primera
circunstancia se sugirió a partir de estudios in vitro
del homólogo de RsbW SpoIIAB, el factor anti-sF (5). Estas
Los estudios mostraron que SpoIIAB se une preferentemente a sF o
SpoIIAA (una contraparte de RsbV) en respuesta al ATP/ADP
proporción presente en la mezcla de reacción. Una alta relación ATP/ADP
favorece la unión de SpoIIAB a sF , mientras que una relación baja da como resultado
asociación preferencial de SpoIIAB con SpoIIAA (5). RsbW
se supone que reacciona de manera similar a las relaciones ATP / ADP, con sB
inducción provocada por una caída en ATP, que cambia RsbW a
RsbV y el lanzamiento de sB. Un segundo factor que podría influir
potencialmente en la decisión de unión de RsbW es el estado de fosforilación
de RsbV. Tanto RsbV como SpoIIAA pueden ser quinasados
in vitro por sus respectivas parejas anti-s (RsbW y SpoI IAB, respectivamente)
(72, 202). En el caso de RsbV, variantes de
RsbV con propiedades de enfoque isoeléctrico (IEF) idénticas a
los de formas fosforiladas y no fosforiladas de RsbV
también se han visualizado cuando los extractos crudos de B. subtilis fueron
sometidos a IEF y analizados por Western blot (72). un IEF
El análisis de las proteínas presentes en fracciones de filtración en gel que
contienen complejos RsbV-RsbW o RsbV solo reveló que
MICROBIOLÓGICO. RVDO.
solo la forma no modificada de RsbV se asoció con RsbW
(72). La supuesta variante fosforilada de RsbV fue
presentes en aquellas fracciones que no contenían RsbW. Aparentemente, la
fosforilación de RsbV por RsbW disminuye
La capacidad de RsbV para asociarse con RsbW. No se sabe si
la fosforilación de RsbV dependiente de RsbW representa un
dispositivo para evitar la unión del RsbV modificado a RsbW o a un
consecuencia de una reacción que RsbW debe catalizar para
cambiar su especificidad para RsbV o sB.
La transcripción dependiente de sB se activa cuando B. subtilis entra en la
fase estacionaria de crecimiento o se somete a cualquiera de
varios insultos ambientales, incluido el choque térmico, la limitación de O2 o la
exposición a etanol o sal alta (13, 16, 21, 23, 313).
Aunque todas estas condiciones implican una liberación de sB de
Inhibición de RsbW, diferentes vías pueden estar involucradas en el efecto de
esta liberación. Activación de sB inducida por choque térmico , en contraste
a la activación de sB que ocurre al entrar en estacionario
fase o después de tratamientos con etanol o alto contenido de sal, puede en
ocurren al menos parcialmente sin un gen RsbV funcional (16, 21).
O el propio complejo RsbW-sB es termolábil, o RsbW es
disociado de sB por un factor de liberación alternativo que tiene
aún no se ha encontrado. Si esta segunda posibilidad es correcta, RsbW
podría ser un objetivo común para distintos factores que responden a
señales ambientales diferentes. Mayor complejidad proviene de
la observación de que incluso la activación de sB dependiente de RsbV
la respuesta puede requerir componentes adicionales. La inducción de
sB por etanol y estrés salino pero no por entrada en el estacionario
fase requiere RsbU así como RsbV (312). Esto sugiere que
entrada en fase estacionaria y etanol o estrés salino son
generando diferentes señales que influyen en la unión de RsbW
decisión o, en última instancia, generar la misma señal, con entrada en
fase estacionaria iniciando esta señal sin necesidad de
RsbU. Se desconoce qué proteína reguladora recibe y
responde a la señal de activación de sB ; sin embargo, la central de RsbW
papel lo convierte en un objetivo probable.
Aunque la inducción de genes dependientes de sB por varios
diferentes tensiones ambientales argumenta que sB es un componente
de la respuesta de estrés general de B. subtilis , no parece
ser esencial para la supervivencia de B. subtilis bajo cualquiera de estas
condiciones. La prescindibilidad de sB se ilustra más claramente durante
Golpe de calor. Los homólogos de B. subtilis de la E. coli esencial
se han identificado genes de choque térmico (6, 166, 180, 262). Como
cabría esperar del hallazgo de que las cepas de B. subtilis con
Las mutaciones nulas en sigB no son más sensibles a la temperatura que
sus contrapartes de tipo salvaje, se ha observado que SigB1
y las cepas SigB2 producen las principales proteínas inducibles por calor en
cantidades similares (16, 313). Sin embargo, hay proteínas adicionales que
están presentes después de un cambio de temperatura en
la cepa de tipo salvaje pero están ausentes en un mutante nulo sigB (16,
313). Por lo tanto, aunque sB no se requiere para la expresión de
genes esenciales de choque térmico, se activa por choque térmico para
elevar su propia síntesis y la síntesis de varios otros
Proteínas termoinducibles. Aunque se desconoce el papel de la mayoría de los
productos génicos dependientes de sB , presumiblemente proporcionan
una función beneficiosa pero no esencial que ayuda a B. subtilis a
adaptarse al choque térmico y otras tensiones.
La observación de que tanto rsbV como rsbW y sus homólogos
spoIIAA y spoIIAB tienen codones de terminación e iniciación superpuestos
con secuencias idénticas en la unión de cada uno
sugirió la posibilidad de que cada par de genes se pueda acoplar
traduccionalmente (151). Presumiblemente, este sería un dispositivo para
asegurar la síntesis equimolar de proteínas que actúan juntas en
Vivo. Soporte experimental para el acoplamiento traslacional en el
El sistema spoIIA vino cuando una mutación en el RBS de spoIIAA
se encontró que confería el fenotipo de una cepa deficiente en ambos
spoIIAA y spoIIAB y reducen significativamente la expresión de
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VOLUMEN 59, 1995
una fusión traslacional spoIIAB::lacZ aguas abajo (227). Sin embargo, no se
observó una pérdida correspondiente en la actividad de rsbW cuando se
se introdujo una mutación de cambio de marco en rsbV (13). el rsbv
La mutación tenía un fenotipo distinto que era opuesto al provocado por las
mutaciones dobles rsbV rsbW (13). En experimentos en
qué sondas de anticuerpos específicas para RsbV, RsbW y sB fueron
utilizado para monitorear los posibles efectos polares de las mutaciones en el
acumulación de productos genéticos aguas abajo, se demostró que la mutación
de cambio de marco rsbV no tiene efecto en los niveles de RsbW, pero
una mutación de cambio de marco rsbW redujo drásticamente la abundancia
de sB (15). El RBS y la región de codificación para los primeros 13
los residuos de aminoácidos de sB están dentro de la lectura abierta de rsbW
marco (151). Esta superposición sugiere que la reducción de sB
los niveles podrían deberse al acoplamiento de traducción entre sB y
el producto génico, RsbW, que es fundamental para su regulación. Eso
debe notarse, sin embargo, que RsbW y sB parecen formar
un complejo in vivo. Por lo tanto, es posible que sB sea más susceptible a la
degradación en ausencia de RsbW, y sus bajos niveles
en la cepa RsbW refleja su mayor rotación.
genes transcritos por E-sB . sB fue inicialmente purificado en base a su
capacidad de transcribir el gen de esporulación temprana spoVG (0.4Kb)
in vitro (113). Esta transcripción probablemente fue fortuita. sB es
prescindible para la esporulación (18), y un papel in vivo para sB en
la transcripción de este gen está en duda (70). spoVG es uno de los tres
genes (spoVG, aprE [ subtilisina] y P43 [función desconocida])
que son transcritas por E-sB in vitro pero no se han demostrado
ser expresado por esta forma de RNAP in vivo (106, 209, 225,
325). Los tres son transcriptos por varias formas de RNAP, y
en los casos de spoVG y aprE , hay evidencia de que sB no
no contribuir significativamente a su expresión bajo el
condiciones de crecimiento que se emplean normalmente (70, 225).
ctc (controlado por catabolitos) representa otro gen de función desconocida
que es transcrito por E-sB. Sin embargo, a diferencia de
los ejemplos dados arriba, hay buena evidencia de que ctc
El promotor dependiente de sB es activo in vivo (18, 133, 134, 247,
298). ctc fue descubierto fortuitamente como una unidad de transcripción
dependiente de sB en un fragmento de ADN que contenía el clonado
gen spoVG (222). Inicialmente se pensó que ctc era spoVC,
un gen de esporulación que está íntimamente ligado a él (212); sin embargo
estudios genéticos y de secuenciación revelaron que son distintos
(132, 308). El término 59 de spoVC comienza 60 pb aguas abajo
del extremo 39 de la secuencia de codificación ctc (132). Aunque ctc
y spoVC son genes separados, pueden tener funciones sinérgicas. Si una
cepa contiene una mutación en spoVC además de una
ctc interrumpido , se observa un retraso en el crecimiento cuando la cultura es
pasó de 37 a 488C (308). La interrupción de ctc por sí sola no
afecta el crecimiento pero inhibe la esporulación a temperaturas elevadas
(488C). Estos datos sugirieron que ctc podría tener un papel que desempeñar,
aunque menor, durante el estrés térmico. El promotor de ctc fue
También se encontró que se activa durante el choque térmico, el estrés salino,
la limitación de glucosa u oxígeno, el estrés oxidativo y el cese de la
crecimiento bajo condiciones que inhiben la actividad del ciclo del ácido
tricarboxílico (TCA) (16, 21, 134, 313). Se ha demostrado que la inducción de
ctc después de la detención del crecimiento requiere solo el mínimo elemento
promotor de ctc (134). Inducción de ctc bajo este
y las otras condiciones de activación probablemente se deban a la activación
de sB por su liberación parcial de la inhibición dependiente de RsbW (15, 23).
Aunque el promotor de ctc dependiente de sB es
el principal contribuyente a la expresión ctc , parece haber un
segundo transcrito de ctc que se inicia cadena arriba del promotor dependiente
de sB (17). Inmediatamente aguas arriba de la región 235
del promotor ctc es el gen estructural para la purina y
enzima biosintética de nucleótidos de pirimidina fosforribosil difosfato sintetasa
(218). Es probable que este operón
la transcripción contribuye a la expresión de ctc .
Otro gen controlado por sB es gsiB (313). Este gen fue
B. FACTORES SUBTILIS SIGMA 9
identificado como uno de varios inducibles por inanición de glucosa (gsi)
unidades de transcripción que fueron aisladas sobre la base de su
activación después de la privación de glucosa (213). Aunque originalmente
propuesto para ser transcrito por E-sA (213), gsiB tiene un
elemento promotor que es altamente homólogo a sB-dependiente
promotores y no se induce in vivo en una cepa de B. subtilis
careciendo de sB (313). gsiB parece ser un operón monocistrónico
que codifica una proteína hidrófila de 13.789 Da, organizada en cinco
unidades en tándem de 20 aminoácidos (213). El producto no muestra
fuerte homología con proteínas conocidas, y su pérdida no confiere un fenotipo
obvio en B. subtilis. gsiB, como ctc, es inducido
en respuesta a una serie de tensiones ambientales (313).
Un gen (csbA [controlado por sigma B]) con propiedades de inducción
similares a las de ctc, es decir, se expresa al máximo
durante la fase estacionaria temprana en un medio que suprime nutricionalmente
el ciclo TCA, se identificó durante la selección de un
biblioteca aleatoria Tn917 lacZ para fusiones lacZ cuyo máximo
la expresión requería un gen sigB intacto (24). La lectura de csbA
marco codifica un producto de 76 residuos de función desconocida que
es a la vez hidrófobo y básico (24). Un promotor dependiente de sB
se identificó 83 pb aguas arriba de la secuencia codificante de csbA ,
con un promotor de tipo sA más débil situado entre el promotor de sB y el
marco de lectura abierto de csbA (24). Proyectando un
biblioteca Tn917 lacZ similar para la expresión de b-galactosidasa en un
Cepa de B. subtilis con una mutación rsbX (es decir, una cepa con
mayor actividad de sB ) condujo al aislamiento de 11
operones que parecían estar total o parcialmente controlados por sB
(22). Las fusiones lacZ se asignaron a seis loci diferentes que mostraron
diversos patrones de expresión durante los procesos logarítmicos y logarítmicos.
fases de crecimiento estacionarias, con el aspecto dependiente de sB de
su transcripción se limita en gran medida a las células en fase estacionaria
(22). La alta frecuencia con la que se encontraron loci independientes
detectado por este medio sugirió a los investigadores que sB
controla un gran regulón de fase estacionaria (22).
Una de las fusiones (gta) aisladas en el tamizaje Tn917 lacZ
se encontró que codifica UDP-glucosa pirofosforilasa, la enzima que cataliza la
síntesis de UDP-glucosa (310). gta es
el primer gen con una función conocida que ha demostrado ser
transcrito por E-sB in vivo. Se ha propuesto que la glucosa UDP podría ser
importante para que B. subtilis responda al estrés de la fase estacionaria y que
la transcripción de gta por E-sB
refleja un papel para sB en este proceso (310).
En la actualidad, se han identificado 17 genes de B. subtilis que tienen
elementos promotores de tipo sB aguas arriba de sus secuencias de
codificación. Además, uno de los dos Bacillus licheniformis clonados
Se ha informado que los genes de la fosfatasa alcalina tienen un
promotor que puede ser utilizado por E-sB in vitro (130). La mayoría, si no
todos, de los genes de B. subtilis que se transcriben por E-sB son
transcrito a un nivel elevado cuando B. subtilis se expone a
estrés ambiental, tienen promotores adicionales que son reconocidos por otras
holoenzimas RNAP y, para aquellos que tienen
han sido probados, no son esenciales para el crecimiento o la esporulación bajo
condiciones normales de laboratorio. Si los genes de B. subtilis que son
conocidos por depender de sB para su expresión in vivo son representativos
del regulón de sB como un todo, sus patrones de expresión
sugieren que sB participa en la respuesta general al estrés (calor
choque, choque osmótico, entrada en fase estacionaria, etc.). Sin embargo, el
papel aparentemente no esencial de sB al permitir que B.
subtilis para hacer frente a estas tensiones deja su función en este
proceso oscuro. Los múltiples promotores de E-sB-transcritos
los genes pueden contribuir a la naturaleza críptica del papel de sB. Si el
la mayor parte del regulón sB se puede transcribir por medios alternativos,
sB puede mejorar algunas respuestas de estrés sin ser crítico para
cualquiera de ellos.
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10 HALDEN WANG MICROBIOLÓGICO. RVDO.

Factor Sigma SC promotor in vitro en el ADN del bacteriófago T7 de E. coli que no es

Aislamiento y caracterización. E-sC se detectó como una actividad utilizado por E-sA (324). El fraccionamiento de la preparación por
cromatografía en heparina-agarosa separó el RNAP en dos picos de
transcripcional in vitro que inicia la síntesis de ARN desde un sitio (P2) en
actividad. La fracción que eluyó con alto contenido de sal estaba
el gen spoVG/ 0.4Kb que es distinto del sitio (P1) donde E-sB inicia la
compuesta por E-sA, mientras que la fracción que eluyó con una fuerza
transcripción (145, 209). RNAP purificado por cromatografía de
iónica baja tenía un nivel relativamente bajo de RNAP pero una nueva
fosfocelulosa y ADN-celulosa da solo la transcripción dependiente de sB
actividad transcripcional en el ADN de T7 (324). El análisis SDS-PAGE
de la plantilla spoVG; sin embargo, en ausencia de cromatografía de
de las fracciones que contenían la actividad novedosa demostró la
fosfocelulosa, una enzima menos purificada produce transcritos duales
ausencia de sA pero reveló la presencia de un polipéptido de 28.000 Da
de spoVG (145). La actividad E-sC se separó de E-sB mediante elución
(sD), con una coincidencia directa entre el contenido de esta proteína y la
en gradiente de ADN-celulosa y se purificó más mediante cromatografía
transcripción de T7 novedosa. Se usó RNAP con esta especificidad única
DEAE-Sephacel, seguido de elución en gradiente de una segunda
para transcribir ADN de plásmidos agrupados de una biblioteca de ADN
columna de ADN-celulosa (145, 209). El análisis SDS PAGE de las
cromosómico de B. subtilis clonado (103). Se seleccionaron plásmidos
proteínas presentes en las fracciones que eluyeron de la segunda columna
que funcionaron como moldes altamente activos para esta enzima y se
de ADN-celulosa reveló una proteína de 32.000 Da cuya abundancia era
demostró que contenían promotores utilizados por la nueva RNAP pero
paralela a la actividad transcripcional en P2. Esta proteína estaba presente
no por E-sA. Mediante el empleo de uno de estos promotores "fuertes"
en cantidades muy pequeñas y solo era detectable mediante tinción con
como ensayo sensible, se realizó un experimento de reconstitución en el
plata de alta sensibilidad (145). La banda de proteína de 32 kDa (s32/sC)
que se cortó la proteína de 28 000 Da de un gel de SDS-poliacrilamida, se
se cortó del gel, se renaturalizó y se demostró que confiere al RNAP
renaturalizó y se demostró que confería la distinta especificidad del
central la capacidad de iniciar la transcripción en el promotor P2 de spoVG
promotor en Núcleo RNAP (122). Por tanto, la proteína de 28.000 Da
(145). Como implica la necesidad de usar tinción de plata para detectarlo,
parecía ser un nuevo factor s (sD). E-sD representa solo el 1,2% de la
sC es una proteína de muy baja abundancia. A partir de la proporción
ARN polimerasa aislada durante una purificación enzimática (122). Se
aparente de subunidades centrales de sC a RNAP y suponiendo que hay
utilizó un análisis de inmunotransferencia cuantitativo para estimar la
aproximadamente 5000 moléculas de RNAP por célula, se ha estimado abundancia celular de sD en 220 6 50 moléculas por célula para B. subtilis
que solo hay 30 moléculas de sC por célula de B. subtilis , 10 veces
en fase logarítmica tardía (122). Este nivel es aproximadamente
menos que la estimación para sB (145). la proteína sC no puede
comparable al de sB.
detectarse directamente sin una purificación exhaustiva; sin embargo, su
Clonación del gen estructural sD . Se secuenciaron fragmentos de
actividad puede medirse en extractos parcialmente purificados. Se
péptido tríptico de sD purificada y se sintetizó un oligonucleótido
examinó la actividad sC de B. subtilis en diferentes estados de crecimiento
degenerado, específico para una porción de s28, y se usó para identificar
utilizando la actividad del promotor P2 como ensayo. A partir de esta
la secuencia de s28 en una biblioteca subgenómica de B. subtilis (121).
medición, se encontró que sC, como sB, estaba presente en células en
El análisis de la secuencia del ADN clonado reveló un marco de lectura
crecimiento, células en esporulación temprana y células en fase
abierto para una proteína de 29 500 Da que contenía la secuencia
estacionaria que fueron bloqueadas por mutación (spo0A) para que no
identificada en los fragmentos trípticos. El marco de lectura abierto de sD
entraran en esporulación (145).
estaba precedido por una secuencia encontrada en promotores
dependientes de sA; sin embargo, la transcripción normal de sD parece
La baja abundancia de sC ha desalentado su estudio. No se ha publicado
depender de los promotores aguas arriba de esta región (121). sigD se
ningún informe sobre este factor desde su descubrimiento. Su función,
encuentra inmediatamente aguas abajo de un locus de quimiotaxis. Las
gen estructural y regulación siguen sin definirse.
inserciones de transposones o la introducción de terminadores de
Genes transcritos por E-sC. Hay dos genes en los que se sabe que
transcripción en sitios hasta 24 kb aguas arriba de sigD reducen su
E-sC inicia la transcripción in vitro, spoVG/ 0.4Kb y ctc (145). En ningún
expresión (195). Se cree que sigD depende de secuencias promotoras
caso se ha demostrado que E-sC funcione en estos promotores in vivo.
0,24 kb aguas arriba de su gen estructural y que forma parte de un operón
El sitio de inicio de la transcripción de spoVG que utiliza E-sC in vitro
grande (0,26 kb) que codifica proteínas estructurales que forman el
puede detectarse como un sitio de iniciación in vivo mediante análisis de
complejo de cuerpo basal-gancho flagelar y proteínas reguladoras de la
ARN celular con nucleasa S1 (145); sin embargo, no se sabe si E-sC es
quimiotaxis (195) .
realmente responsable de esta transcripción in vivo. No se conocen
Genes transcritos por E-sD. La interrupción de la copia residente de
mutaciones nulas en el gen estructurado sC y, por lo tanto, la contribución
sigD con un plásmido de integración da como resultado una cepa mutante
de E-sC a esta transcripción es, en la actualidad, no comprobable. E-sC
viable que es competente en esporulación pero crece como cadenas
también inicia la transcripción en el promotor ctc ; sin embargo, a diferencia
filamentosas de células que no son móviles (121). Los análisis de
de la situación en spoVG, donde E-sB y E-sC tienen distintos sitios de
transferencia Western demostraron una falta de proteína flagelina en
inicio, ambas enzimas inician la transcripción de ctc en el mismo punto en
estas células, lo que llevó a la propuesta de que sD controla la producción de flagelina (121)
la plantilla de ctc (145) y mutaciones en la región promotora que
El apoyo directo para sD como un regulador positivo de la síntesis
disminuyen su uso por E- sB también reducen su uso por E-sC (296). La
flagelar vino con la clonación del gen de la flagelina (hag) de B. subtilis y
contribución de E-sC a la expresión de ctc in vitro no parece ser
los hallazgos de que es transcrito por E-sD in vitro y que su transcripción
significativa en las condiciones de cultivo que se emplean normalmente.
in vivo es eliminada por mutaciones que bloquear la síntesis de sD (203).
Las mutaciones nulas en sigB prácticamente eliminan la transcripción de
Varios genes dependientes de sD conocidos están agrupados cerca de
ctc (13, 23, 134). Si E-sC transcribe ctc in vivo, su contribución es menor
hag en operones con organizaciones similares a las de los operones de
o aún no se ha determinado el estímulo ambiental adecuado para su
E. coli que codifican genes flagelares y quimiotácticos (42, 96, 121). Se
activación. Una comparación del promotor ctc con el promotor P2 de
encontró que el propio gen sigD era alelo del gen flaB de B. subtilis (194).
spoVG reveló secuencias conservadas que eran diferentes de las
sigD reside dentro de la región fla-che del cromosoma B. subtilis como
compartidas por ctc y otros promotores reconocidos por sB (Tabla 1) (145).
parte de un gran operón que contiene al menos 30 genes cuyos productos
están involucrados en funciones flagelares o de quimiotaxis (223).

Un papel para sD en la expresión de las proteínas de quimiotaxis que

Factor Sigma SD aceptan metilo fue sugerido por los hallazgos de que algunas células
Aislamiento y caracterización. Se encontró que las preparaciones de mutantes sigD carecen de proteínas de quimiotaxis que aceptan metilo y
RNAP de B. subtilis en crecimiento exponencial reconocen un que otras células sigD mutantes , que sintetizan
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VOLUMEN 59, 1995
niveles de sD, son deficientes en quimiotaxis, aunque acumulan cantidades
casi normales de flagelina (194).
Los estudios de microscopía electrónica de las células filamentosas
formadas por mutantes sigD muestran septos de división normales, lo que
indica que la ausencia de sD da como resultado una deficiencia en la
actividad de la autolisina en lugar de un defecto en la división celular (121).
Un defecto de autolisina fue respaldado por la observación de que las
principales actividades de autolisina de B. subtilis en extractos de un
mutante sigD se reducen en relación con las encontradas en extractos de
una cepa de tipo salvaje (194) y que los genes de autolisina se transcriben,
en parte. , de promotores dependientes de sD (170, 175, 193).
Se analizaron promotores dependientes de sD adicionales , aislados
mediante cribado de una colección de fragmentos genómicos de B. subtilis
en busca de actividad promotora in vitro, en busca de clones únicos frente
a clones duplicados (103). La distribución implicaba que había un número
relativamente pequeño (25 a 30) de promotores dependientes de sD en B.
subtilis (103). Una comparación de la secuencia aguas arriba de varios
promotores dependientes de sD reveló una secuencia de consenso (Tabla
1) que es distinta de la que se encontró conservada en los promotores
utilizados por las otras formas de B. subtilis RNAP (103, 104, 119). La
especificidad de E-sD se superpone a la de la especie RNAP de E. coli (E-
s32) que reconoce los promotores del choque térmico. E-sD y E-s32 pueden
iniciar la transcripción en las plantillas de cada uno in vitro (27). Sin embargo,
no hay evidencia de que los promotores reconocidos por E-sD en B. subtilis
sean inducibles por temperatura o que sD participe en la respuesta de
choque térmico de B. subtilis (194). A diferencia del caso de las
especificidades superpuestas de las proteínas sA de B. subtilis y s70 de E.
coli , para las cuales las similitudes parecen reflejar funciones similares, se
cree que las similitudes entre los promotores reconocidos por sD y s32 son
fortuitas (194).
La secuencia única de promotores reconocidos por sD permitió una
búsqueda en la base de datos de ácidos nucleicos de genes con promotores
sD corriente arriba. Esto condujo a la identificación preliminar de promotores
similares a sD cadena arriba del gen (degR) para un regulador de la
secreción de proteasas y exoenzimas y el gen (epr) para una proteasa
extracelular (119). La mayoría de los genes de proteasa y exoenzima de
Bacillus no tienen secuencias de promotor sD identificables, por lo que la
importancia de la secuencia reconocida por sD en degR y epr no está clara
(119).
Un análisis del patrón de transcripción de varios promotores dependientes
de sD, incluido hag, demostró una expresión máxima transitoria al final del
crecimiento exponencial (T0) (102, 103, 119). Esto es paralelo a la
abundancia de proteína sD , que parece ser máxima en T0 y luego
disminuye (J.
Helmann, inédito; citado en la referencia 119). Aunque los niveles de sD y
la expresión de promotores dependientes de sD son máximos al final del
crecimiento exponencial, este aumento de fase estacionaria es independiente
de una serie de genes (spo0, abrB y sin) cuyos productos normalmente
controlan la expresión génica de fase estacionaria. (196). Se desconocen
los factores que son responsables de la elevación de la fase estacionaria
en los niveles de sD . La transcripción dependiente de sD disminuye
después del inicio de la esporulación, y la inactivación de sigD en sí misma
no provoca un defecto manifiesto en la esporulación (121). Estos resultados
argumentan que la contribución de sD a la esporulación, si la hay, es
modesta.
La evidencia actual demuestra que sD está involucrada principalmente
en la expresión de genes flagelares, de motilidad y de autolisina y sus
reguladores.
Factor sigma sH
Aislamiento y caracterización. El gen de esporulación spoVG fue la
plantilla utilizada para detectar las actividades de sB y sC (113, 145). Los
ARN sintetizados in vivo a partir de spoVG se inician en los mismos sitios
que las transcripciones generadas in vitro por E-sB
B. FACTORES SUBTILIS SIGMA 11
y E-sC; sin embargo, las transcripciones in vitro no imitan por completo la
condición in vivo (37). In vitro, el promotor spoVG es relativamente ineficaz
cuando se transcribe mediante E-sB o E-sC, pero su nivel de actividad
durante la esporulación temprana es muy alto. Esta disparidad implicaba
que otra forma de RNAP o un regulador positivo estaba contribuyendo a la
transcripción de spoVG in vivo. El promotor de ctc dependiente de sB es un
objetivo más eficaz para E-sB que el promotor de spoVG . La preferencia
de E-sB por ctc es tan grande que en condiciones de exceso de plantilla,
ctc secuestrará la E-sB disponible y evitará la transcripción de spoVG (222).
Al emplear este sistema de plantilla como ensayo, se inició una búsqueda
de una forma de RNAP que pudiera usar el promotor spoVG en presencia
del promotor ctc (37).
El RNAP preparado a partir de células en fase estacionaria temprana y
fraccionado mediante elución con gradiente de sal de una columna de ADN-
celulosa se resolvió en dos actividades en la reacción de competencia de
plantilla mixta en los promotores ctc y spoVG . La actividad de elución con
bajo contenido de sal reconoció principalmente al promotor ctc , mientras
que las fracciones que eluyeron a concentraciones de sal más altas
predominantemente transcribieron spoVG (37). El análisis SDS-PAGE de
las proteínas presentes en cada una de las fracciones demostró la presencia
de sB en las primeras fracciones y la coincidencia de una proteína de 30.000
Da con la actividad de transcripción de spoVG que estaba presente en las
fracciones con alto contenido de sal (37). Esta banda de proteína de 30 000
Da se cortó del gel, se renaturalizó y se demostró que dirige el RNAP central
al promotor spoVG . A partir de este resultado, la proteína de 30 000 Da se
designó como un nuevo factor s (s30) (37). Como prueba de la noción de
que E-s30 podría ser la especie principal de RNAP responsable de la
expresión de spoVG in vivo, se examinó la presencia de E-s30 en B. subtilis
mutante que no pudo expresar spoVG . En general, se encontró que los
efectos de las mutaciones en los niveles de E-s30 eran paralelos al efecto
de las mutaciones en spoVG.
Una excepción fue spo0H. Una cepa de B. subtilis con un alelo sin sentido
de spo0H (spo0H81) contenía E-s30 pero no pudo transcribir spoVG, y una
cepa con una deleción de spo0H carecía de s30 detectable . Estos hallazgos
argumentaron que s30 podría ser Spo0H (37).
El gen estructural para Spo0H se clonó a partir de B. subtilis en función
de su capacidad para complementar el fenotipo Spo2 de un mutante spo0H
(320). La secuencia spo0H codificaba un marco de lectura abierto para un
polipéptido de 26.097 Da con una homología significativa con los factores
sigma procarióticos conocidos (69). Los anticuerpos policlonales de conejo
preparados contra el gen spo0H de B. licheniformis reaccionaron con Spo0H
de B. subtilis y con la subunidad s30 de E-s30 purificada (70). La evidencia
inmunológica de s30 como producto del gen spo0H provocó un cambio en
la designación de s30 a sH (70). E-sH como la enzima de transcripción de
spoVG se confirmó mediante la observación de que un bloqueo en la
expresión de spoVG causado por un alelo spo0H mutante podría suprimirse
de manera específica de alelo mediante una sustitución de una sola base
en el promotor de spoVG (340).
Reglamento de sH. E-sH no se detectó en las cepas de B. subtilis con
mutaciones en los genes spo0A y spo0F de la etapa 0, pero se encontró
fácilmente si la cepa spo0A contiene una segunda mutación (abrB) que
restaura parte del fenotipo de esporulación temprana de la célula spo0A
(37). Este resultado implica que la síntesis de sH está controlada por
reguladores génicos posteriores a la fase exponencial. Spo0A es un
regulador positivo y negativo de los genes de fase post-exponencial que se
activa a través de una cascada de transfosforilación que incluye Spo0F,
Spo0B y SpoIIJ (kinA) (28, 127). abrB codifica un regulador negativo de
ciertos genes de esporulación y, a su vez, está regulado a la baja por Spo0A
activado (288, 289). Se utilizó una fusión traduccional del gen lacZ de E.
coli con spo0H para estudiar la regulación de la síntesis de sH con más
detalle (320). Con este sistema informador, se encontró que spo0H se
expresaba durante el crecimiento vegetativo con una síntesis creciente como
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12 HALDEN WANG
B. subtilis entra en la etapa de crecimiento logarítmico medio. los
una mayor expresión de spo0H requiere spo0A, 0B, 0E y
productos del gen 0F a menos que la cepa también contenga una mutación en
abrB. La mutación abrB da como resultado una alta expresión constitutiva
de spo0H durante el crecimiento vegetativo y pasa por alto el requisito de los
productos genéticos spo0A y spo0B (69, 320). En
Además, una mutación en spo0A (sof-1) que elude los requisitos para los
productos genéticos spo0B , spo0E y spo0F (128)
permite la expresión spo0H en un fondo spo0F . Tomados en conjunto, estos
resultados argumentan que spo0H está regulado negativamente
por AbrB y liberado de esta inhibición por los efectos de
Spo0A en la expresión abrB (273).
El análisis de secuencia identificó un promotor de consenso sA que es
utilizado in vitro por E-sA inmediatamente aguas arriba del gen estructural sH
(70). La relevancia de este potencial promotor fue
verificado por experimentos de extensión de cebadores, que detectaron un
ARN que se inicia en este sitio in vivo (319). Por lo tanto, spo0H/ sigH es
probablemente esté contenido en un operón dependiente de sA que está
controlado negativamente por AbrB (320). Los análisis de transferencia Northern
indican que el transcrito spo0H/ sigH tiene 1300 bases (319). Esto es
aproximadamente 600 bases más grandes que la región codificante de sH . los
Se desconoce la función de las bases que no codifican directamente sH .
La regulación de la abundancia de sH no se limita a la transcripción de sigH .
Los niveles de ARNm de spo0H observados durante el crecimiento no se
corresponden directamente con los niveles de sH , lo que sugiere que spo0H tiene un
componente regulador postraduccional (118, 320). Esta idea
fue probado en experimentos en los que la transcripción spo0H fue
controlado artificialmente mediante el uso de un promotor inducible (PSPAC)
(118). Los niveles de sH aumentaron significativamente y los niveles dependientes de sH
los genes se activaron solo cuando se indujo el operón sigH
en condiciones que también inducían la esporulación (118). Los estudios de
marcado de pulsos y recambio revelaron que las condiciones de esporulación
estimularon la tasa de síntesis de sH en relación con la síntesis total de proteínas
aproximadamente cinco veces y aumentaron su vida media.
a 90 a 130 min de la vida media de 20 a 30 min encontrada en
células en crecimiento (118). Se concluyó que el aumento de sH
que ocurre al final del crecimiento exponencial es principalmente
debido a una elevación regulada postranscripcionalmente en la síntesis de sH
junto con una disminución del recambio de sH (118). Se desconocen los
mecanismos por los cuales se logra esta regulación.
Genes transcritos por E-sH. El papel de sH en la transcripción de B. subtilis
no se ha definido completamente. Aunque sH es esencial
para la esporulación, también está presente durante el crecimiento, cuando puede
dirigir la transcripción de un subconjunto de genes vegetativos. A
número sustancial de genes con promotores dependientes de sH
han sido detectados y muchos han sido caracterizados. los
mayor número de genes controlados por sH fueron identificados en un
estudio en el que se insertó aleatoriamente un gen informador en el
cromosoma B. subtilis y se usa para monitorear la expresión génica en
el sitio de integración en presencia y ausencia de sH (142).
Dieciocho genes csh (controlados por sigma H) cuya expresión
fue influenciado por los niveles de sH (142). La mayoría de las cepas
que llevan las fusiones del gen informador dependiente de sH, que son
probable que haya inactivado el gen en el sitio de inserción, no mostró un
fenotipo evidente; sin embargo, dos de las mutaciones de inserción causaron un
defecto de esporulación. Una tercera mutación de inserción
causó un defecto de crecimiento, pero este fenotipo solo se observó cuando
la mutación de inserción se combinó con una mutación en spo0H
(142). Uno de los mutantes de esporulación también tenía un deterioro
capacidad de volverse competente para la transformación genética. En
la base de la actividad del gen reportero, los patrones de expresión
de los 18 genes csh son similares en el sentido de que todos se inducen dentro de los 30
min después del inicio de la esporulación (142). El nivel de expresión, cantidad
de inducción y grado de dependencia de sH
para la expresión difieren entre los genes csh . Se sugirió que
MICROBIOLÓGICO. RVDO.
estas diferencias podrían deberse a factores regulatorios adicionales
actuando en estos promotores así como la presencia de múltiples
promotores en algunos de los genes (142).
La idea de que múltiples factores regulan los promotores dependientes de sH
está respaldada por los variados patrones de expresión de los
genes de lectura E-sH conocidos : spoIIA (327, 328), spoVG (37), citG
(87, 240, 294), sigA (38), spo0F (237), kinA (237) y spo0A
(237, 272). Estos genes codifican productos que participan en
diversos procesos. spoIIA y sigA codifican datos específicos de esporulación
(78, 283) y factores sigma de células vegetativas (239), respectivamente.
spo0A, spo0F y kinA (spoIIJ) especifican las funciones necesarias para,
o son componentes de la ruta de transducción de señales de esporulación (28,
127). citG es el gen estructural del ciclo TCA
enzima fumarasa (240), y spoVG es una esporulación temprana
gen que parece desempeñar un papel durante el proceso de separación de las
esporas (192). Los patrones de expresión de estos genes,
que dependen parcial o exclusivamente de E-sH para su
transcripción, reflejan la diversidad de sus funciones. Los promotores spoIIA,
spoVG, sigA, spo0A y spo0F dependientes de sH
volverse activo después del final del crecimiento exponencial (38, 222,
237, 328), mientras que los promotores citG y kinA dependientes de sH
están activos en las etapas media y tardía del crecimiento exponencial
(237, 294). Activación de la síntesis de sH a partir de un promotor inducible
(PSPAC) no logra inducir la expresión de spoVG expresado en esporulación
(118) o citG expresado vegetativamente (240)
genes, argumentando que hay factores adicionales involucrados. En el caso
de spoVG y spoIIA, los factores regulatorios adicionales han
identificado (AbrB y Spo0A, respectivamente) (28, 251, 327,
342). El control de la mayoría de los promotores dependientes de sH cuyo
la expresión aumenta al final del crecimiento exponencial puede
en última instancia, ser contabilizado por una combinación de liberación de
los efectos de los represores (por ejemplo, AbrB y Sin) y el positivo
efectos de la vía de inducción de Spo0A (273). los reguladores
de los promotores dependientes de sH expresados vegetativamente son
más oscuro Se encontró el promotor dependiente de sH de citG
varía durante el crecimiento y la esporulación, pero a diferencia de los promotores
de sH regulados por el desarrollo , su fase posterior a la exponencial
la inducción no depende de la vía spo0A (240). citG es
también regulado por la fuente de carbono durante el crecimiento vegetativo, con
un aumento de 50 veces en la expresión en medio de lactato en relación con
el nivel observado en el medio de glucosa-glutamina (240). La base de
esta regulación es desconocida. Aparte de los genes clonados cuyos
Se ha demostrado que la transcripción requiere sH, hay un problema genético
evidencia de que algún proceso dependiente de sH está involucrado en la
inducción de competencia (4, 68, 142, 272) y la respuesta inducible por daños
en el ADN (SOB) (331).
La presente colección de promotores dependientes de sH argumenta
que sH tiene un papel importante en el gen post-fase exponencial
expresión pero que su actividad no se limita a esta etapa de
crecimiento de la cultura. sH es necesario para las funciones vegetativas de
Síntesis de enzimas del ciclo TCA y reparación de ADN, así como la
procesos mutuamente excluyentes posteriores a la fase exponencial de desarrollo
de competencia y esporulación. Cuando la expresión de
Los promotores dependientes de sH se han estudiado en detalle, sH ha
se ha encontrado que juega un papel esencial pero insuficiente en su
activación.
Factor Sigma SL
sL es el factor sigma de B. subtilis descubierto más recientemente . Eso
aún no se ha aislado para estudios bioquímicos, pero se sabe
por su actividad in vivo y las similitudes de sus estructuras clonadas
gen a factores sigma conocidos (60). sigL fue identificado durante un
estudio del operón levanasa de B. subtilis. La levanasa es un
exofructosidasa que hidroliza tanto el leván como la inulina para la
producción de fructosa libre. El gen estructural de la levanasa
Machine Translated by Google
VOLUMEN 59, 1995
(sacC) es el quinto gen en un operón cuyo promotor-proximal
productos génicos forman un sistema de fructosa fosfotransferasa (197,
198). Un gen regulador positivo (levR) homólogo al
Mentiras de las proteínas reguladoras NifA/NtrC de Klebsiella pneumoniae
aguas arriba del promotor del operón levanasa (59). NifA y
NtrC son activadores positivos de promotores que son reconocidos
por una especie menor de RNAP, E-s54 (171). Los promotores dependientes
de s54 requieren estas proteínas activadoras positivas para la expresión.
y tienen secuencias conservadas en bp 212 y 224 en lugar de
en las posiciones más típicas 210 y 235 (171). Se determinó que el promotor
de levanasa es solo débilmente similar a
promotores dependientes de sA, pero es muy similar a los promotores de
bacterias entéricas reconocidos por s54 (59). Se encontró que el promotor de
levanasa era idéntico al promotor reconocido por s54 en 11 bases de la
secuencia consenso de 12 bases (Tabla 1)
y tener un sitio activador potencial, en el que LevR podría unirse
(59).
La dependencia de la transcripción de levanasa en LevR y un
RNAP similar a s54 se probó reconstituyendo su transcripción en
E. coli. Se encontró que la expresión de una fusión levD::lacZ era
dependiente tanto de levR como del producto del gen ntrA de E. coli (s54)
(59). El descubrimiento de que E. coli E-s54 podía transcribir el
El gen de la levanasa impulsó la búsqueda de una enzima similar en B.
sutil Una cepa merodiploide que contenía dos copias de un
alelo levR (sacL8) que confiere expresión constitutiva al
operón de levanasa, así como dos copias del operón de levanasa:
uno que contiene una fusión levD-lacZ , y el segundo que expresa
se utilizó levanasa (sacC) para la búsqueda (60). En este contexto, la expresión
de levanasa podría monitorearse tanto por la actividad de b-ga lactosidasa
como de levanasa, y el aislamiento de levR
los mutantes se minimizarían. Mutantes que no lograron expresar
se aisló el operón de levanasa (60). El gen afectado en
estos mutantes fue clonado por complementación, secuenciado y
encontrado para codificar una proteína 49,644-Da que era homóloga a
s54 de E. coli. Su secuencia de codificación se denominó sigL (60).
Se construyó una mutación nula en sigL y se introdujo en
B. subtilis, donde abolió la expresión de sacC (60). Otro
Las especies bacterianas que carecen de s54 son viables pero tienen muy diversas
fenotipos pleiotrópicos, incluidos defectos en el metabolismo del nitrógeno
(171). Se analizó el crecimiento del mutante sigL en condiciones mínimas
medio que contiene diferentes fuentes de nitrógeno y resultó ser
indistinguible de la cepa original excepto cuando el amino
Se proporcionaron los ácidos arginina, ornitina, valina e isoleucina.
como fuentes de nitrógeno. Estos aminoácidos apoyaron el crecimiento
de cepas sigL1 pero no sigL (66). Los límites de la evidencia actual
el papel de sL en la expresión de genes para un subconjunto de
enzimas degradantes (p. ej., levanasa y degradación de aminoácidos). La
pérdida de sigL no afecta la esporulación, la competencia,
o movilidad (60). si SL , como su contraparte en otros
bacterias, tiene actividades de mayor alcance queda por demostrar.
FACTORES SIGMA ESPECÍFICOS DE LA ESPORULACIÓN
La privación de nutrientes provoca que B. subtilis se diferencie en
un tipo de célula alternativo, la espora latente. Durante el proceso
de la esporulación, los grupos de genes se activan secuencialmente y
silenciado para guiar a la célula a través de una serie de etapas intermedias de
desarrollo (revisado en las referencias 76, 187 y 232).
El proceso de esporulación comienza al final de exponencial
crecimiento y requiere aproximadamente 8 a 10 h para completar bajo
condiciones estándar de laboratorio. Células que han dejado de crecer
exponencialmente en un medio de esporulación (inicio de esporulación, T0)
pero no han sufrido ningún cambio morfológico evidente son
clasificado como en la etapa más temprana de esporulación, etapa 0.
Por 1,5 a 2 h en la esporulación (T1.5 a T2), la celda tiene parti
B. FACTORES SUBTILIS SIGMA 13
cionado en dos compartimentos por invaginación de la
membrana plasmática para formar un tabique cerca de un polo de la célula.
La finalización del tabique define la etapa II de la esporulación. los
La membrana septal periférica luego migra hacia el polo anterior de la espora
de la célula, engullendo el compartimento más pequeño como un
entidad de doble membrana (el protoplasto de la espora) dentro
la célula madre. Este evento señala la etapa III, que normalmente es
completado por T3.5. Durante la etapa IV, una gruesa capa de peptidoglicano
(corteza) se coloca entre las dos membranas que rodean el
protoplasto de la espora. A esto le sigue la deposición de
capas de proteínas de cubierta en la membrana externa que envuelve
la corteza (etapa V). Desarrollo de resistencias a las esporas (calor,
solventes orgánicos, radiación, etc.) ocurre completamente durante la etapa VI
(T6 a T7). En el estadio VII, la espora madura se libera por lisis.
de la célula madre.
Genes cuyos productos son específicos y esenciales para la esporulación.
al proceso de formación de esporas son designados por la etapa en
que la ausencia de sus productos bloquea la esporulación. Para
Por ejemplo, una cepa con una mutación específica de esporulación que impide
que una célula forme el tabique asimétrico y pase a la etapa II se denominaría
mutante de etapa 0, con el gen
que contiene la mutación denominada spo0X. Asimismo, una célula que
puede formar el tabique, pero no un protoplasto de esporas.
contienen una mutación en etapa II (spoIIX).
Los fenotipos de mutaciones nulas en los cuatro factores sigma
, sG
conocidos específicos de la esporulación de B. subtilis (sE, sF y SK)
confirmar la predicción de que las cascadas de factores sigma podrían ser
responsable del patrón secuencial de expresión génica que
ocurre en la esporulación (184, 287). La pérdida de cualquiera de estos
proteínas bloquea el desarrollo de esporas en una etapa particular en el
proceso. La incapacidad para formar sE o sF activos confiere una etapa II
fenotipo terminal en B. subtilis, mientras que sG- y sK-deficientes
las cepas detienen la esporulación en las etapas III y IV, respectivamente. Como
se describirá a continuación, los factores sigma de esporulación no solo
son importantes reguladores de la expresión génica temporal, pero también
parecen desempeñar un papel fundamental en la activación de comportamientos específicos del compartimento
expresión génica en la célula madre y la espora.
Factor Sigma sE
Aislamiento y caracterización. A medida que B. subtilis avanza hacia
esporulación, se producen cambios drásticos en la composición de subunidades
de su RNAP extraíble. Aparte de la desaparición de
las subunidades sigma de células vegetativas, nuevos polipéptidos se vuelven
asociado con RNAP. Uno de los nuevos polipéptidos más evidentes es una
proteína con una masa molecular aparente de 27.000 a
29.000 Da (P29) (112, 181, 216). RNAP purificado que lleva el
La proteína de 27 000 a 29 000 Da se puede separar fácilmente de
otras formas de RNAP por su afinidad inusualmente alta por el ADN
celulosa (112, 181, 216). Cuando se comparan las propiedades de transcripción
in vitro de E z P29 con las de E-sA o core
RNAP, se encuentra que muestra una respuesta distinta a Mg21 y
KCl y una actividad característica sobre moldes de ADN de poli(dA-dT) o
bacteriófagos (181, 216). Las nuevas propiedades transcripcionales de E z P29
y la apariencia específica de la esporulación provocaron
especulación de que P29 podría ser un factor de transcripción específico de la
esporulación que podría participar en el control del gen de la espora
expresión (181, 216). La evidencia de que P29 era una proteína similar a sigma
provino de experimentos en los que RNAP que transportaba P29 fue
demostrado tener un perfil único de especificidad transcripcional in vitro en el
ADN clonado de B. subtilis en comparación con el mostrado
por otras holoenzimas de B. subtilis (E-sA y sB). Un experimento de
reconstitución en el que P29 se separó del otro
Subunidades E z P29 por SDS-PAGE, renaturalizadas y añadidas al núcleo
RNAP demostró que la especificidad transcripcional única
Machine Translated by Google
14 HALDEN WANG
HIGO. 4. B. subtilis operones sigE y sigG . Los operones bicistrónicos sigE y
monocistrónicos sigG se dibujan con las formas de RNAP responsables de la
transcripción de cada operón ilustradas (152, 159, 160, 201, 290). El ARNm del
operón sigE puede extenderse a través de sigG; sin embargo, la porción sigG de
la transcripción no parece estar traducida (201, 290) (ver texto).
de E z P29 se debió a P29 (112). Por lo tanto, P29 se convirtió en s29 y
luego pasó a llamarse sE.
Clonación del gen estructural sE . El gen estructural para sE fue
clonado por investigadores que buscaban aislar genes de esporulación
temprana (20, 163). Se determinó que la secuencia de una porción
clonada del cromosoma de B. subtilis que complementaba una mutación
de esporulación en etapa II (spoIIG) codificaba un polipéptido de 27 652
Da con una región de 65 aminoácidos que es altamente homóloga a una
parte interna de la E proteína s70 de .coli (285). A partir de este análisis,
se propuso que spoIIG podría codificar sE o un factor sigma de
esporulación aún no caracterizado (285). El apoyo a la idea de que sE
es el producto spoIIG provino de un estudio inmunológico en el que un
anticuerpo anti-sE detectó una proteína similar a sE en una cepa de E.
coli que expresaba la secuencia clonada de spoIIG y variantes de sE en
una cepa de B. subtilis con un alelo spoIIG mutante (spoIIG41) (304). La
secuenciación directa del extremo amino de sE y su alineación con el
marco de lectura abierto spoIIG verificó spoIIG (sigE) como la secuencia
codificante de sE (172).
La regulación de sE . E-sE se aísla solo de las células de B. subtilis
que han progresado aproximadamente 2 h en la esporulación (112) y
parece estar presente al máximo entre T2 y T4 (307).
Según lo determinado por Western blot y estudios de expresión de
genes informadores, la síntesis de sE se controla en dos niveles. El
primer nivel es el control transcripcional, con el promotor del operón
spoIIG volviéndose activo solo después del inicio de la esporulación.
El segundo nivel de regulación es postraduccional, siendo el producto
principal de spoIIG una forma precursora inactiva (pro-sE) de sE. La
conversión de pro-sE al factor sigma activo ocurre aproximadamente en
el T2 de la esporulación. Por lo tanto, la formación de sE depende no
solo de la expresión de su gen estructural sino también de la activación
posterior de su producto.
(i) Síntesis de Pro-sE . La síntesis de pro-sE es paralela a la
transcripción del operón spoIIG , que solo ocurre durante la esporulación
en células que contienen los alelos de tipo salvaje de al menos varias
etapas 0 (spo0A, 0B, 0E, 0F y 0H) y etapa II ( spoIIJ, IIL e IIN) genes de
esporulación (146, 159). Los experimentos en los que se integraron
plásmidos de genes informadores en el cromosoma de B. sub tilis en el
locus spoIIG demostraron que la transcripción de spoIIG se induce al
inicio de la esporulación y que el operón spoIIG incluye un gen proximal
al promotor (spoIIGA) que, como sigE ( spoIIGB), es esencial para la
esporulación (Fig. 4) (149, 159). El sitio de inicio de la transcripción de
spoIIG se cartografió con precisión mediante técnicas de protección de
ARNasa y extensión de cebadores (158). Una vez localizado el sitio de
iniciación, se buscaron los factores transcripcionales que actuaban en
este sitio.
Dado que se requiere spo0H, que codifica sH, para la expresión de sigE
in vivo (159), parecía posible que E-sH pudiera ser la enzima transcriptora
de sigE. Sin embargo, esta noción no fue respaldada por un experimento
in vitro en el que E-sA pero no E-sH inició la transcripción de spoIIG
(158). Evidencia convincente para E-sA como la enzima transcriptora de
sigE vino con
MICROBIOLÓGICO. RVDO.
el descubrimiento de que los efectos nocivos de una sustitución de base
en la región 210 del promotor spoIIG en la transcripción de spoIIG
podrían suprimirse de una manera específica de alelo mediante un
cambio de un residuo de aminoácido en el segmento de reconocimiento
210 de sA (161) . Es probable que el papel de E-sH en la expresión de
sigE sea indirecto.
La secuencia del promotor de spoIIG se asemeja a un "promotor de
consenso" sA excepto por el espacio entre las supuestas regiones 235
y 210 de spoIIG, que es de 22 pb en lugar de los habituales 17 o 18 pb
(158). Este espaciado inusual se investigó mediante un experimento de
mutagénesis en el que se encontró que las sustituciones en los sitios en
y alrededor de las posiciones 235 y 287 reducían la actividad del
promotor (259). Estas regiones se asemejan al sitio objetivo de la
proteína activadora Spo0A. Los experimentos de cambio de movilidad
en gel y protección de DNasa mostraron que Spo0A podría unirse a
estos sitios in vitro (9, 259) y que Spo0A estimula la transcripción in vitro
del promotor spoIIG (19, 258). Ahora se piensa que la secuencia que
originalmente se planteó como una secuencia consenso 235 "desplazada"
es de hecho un sitio de unión a Spo0A. Muchos, si no todos, los demás
loci necesarios para la transcripción de sigE participan en la inducción o
activación de Spo0A al inicio de la esporulación (28, 127, 273). Un
modelo simple para la regulación de la transcripción de spoIIG contempla
la activación de Spo0A y su unión al promotor sigE como el evento
regulador específico de la esporulación que induce a la holoenzima de
células vegetativas E-sA a iniciar la síntesis de pro-sE al inicio de la
esporulación (258). (ii) Tramitación Pro-SE . Un aspecto inusual de la
síntesis de sE es su formación a partir de una proteína precursora (pro-
sE). Pro-sE se detectó en análisis de transferencia Western de B.
subtilis en esporulación, en los que un anticuerpo monoclonal anti-sE
reaccionó no solo con sE (masa aparente, 29 kDa) sino también con una
proteína más grande (P31; masa aparente, 31 kDa) que tenía una
subestructura peptídica similar (307). También se observaron dos
proteínas comparables en extractos preparados a partir de otras
especies de Bacillus en esporulación (305). Se encontró que la síntesis
de P31 ocurre antes en la esporulación que la de sE, sin que ninguna
cepa de B. subtilis sintetice sE sin acumular primero P31, aunque varias
cepas de Spo2 pudieron sintetizar P31 pero no sE (307). Un experimento
de persecución de pulsos reveló que la [35S]metionina es "perseguida"
en sE simultáneamente con la desaparición de P31 previamente marcado
(172) y que la expresión inducida del gen sigE en E. coli da lugar a la
síntesis de una sola proteína con la movilidad de P31 en geles de SDS-
poliacrilamida (304). Estos hallazgos indicaron que existía una relación
precursor-producto entre P31 y sE (172). Cuando se usó el anticuerpo
anti-sE para monitorear el destino de P31 durante la purificación de
RNAP de B. subtilis , se encontró que la mayor parte de P31, a diferencia
de sE, se separaba de RNAP durante el proceso de purificación. Una
pequeña porción (5%) del P31 permaneció asociado con el RNAP y
confirió al E-P31 resultante las propiedades cromatográficas normalmente
asociadas con E-sE (306). Aunque E-P31 tenía propiedades físicas
similares a las de E-sE, su actividad transcripcional era distinta: E-P31
podía sintetizar ARN in vitro a partir de la plantilla poli(dA-dT) no
específica, pero era inactivo en los promotores dependientes de sE.
(306). En este sentido, E-P31 se parecía más al RNAP central que a una
holoenzima.
sE ha sido secuenciado de forma independiente por varios grupos,
que identificaron el residuo 28 (204, 207a) o el residuo 30 (172) del
marco de lectura abierto de sigE como el extremo amino de sE . Por lo
tanto, es probable que sE se derive de pro-sE mediante la eliminación
de 27 a 29 aminoácidos del extremo amino de pro-sE. No se sabe si la
ambigüedad en el término amino de sE se debe a diferencias entre las
cepas de B. subtilis , falta de precisión en la reacción de procesamiento
o una pérdida secundaria de dos aminoácidos de una de las muestras
de sE posterior al procesamiento. En orden
Machine Translated by Google
VOLUMEN 59, 1995
Para probar si un evento proteolítico por sí solo podría cambiar la pro-sE en una
proteína con propiedades similares a la sE, se utilizó una proteína de fusión
(P31*) que contenía la mayor parte de la pro-sE unida en su terminal amino a
12 aminoácidos de la lipoproteína de E. coli. sobreproducida en E. coli,
parcialmente purificada y convertida in vitro en una proteína con movilidad
electroforética similar a la de sE por tratamiento con proteasa Staphylococcus
aureus V8 (172). Un sitio de escisión preferido para la proteasa V8 de S. aureus
existe de dos a cuatro residuos cadena arriba de los sitios de procesamiento
pro-sE putativos (172, 304). El P31* tratado con proteasa , pero no el P31* no
tratado, fue capaz de dirigir el RNAP central de B. subtilis para iniciar
específicamente la síntesis de ARN en un promotor reconocido por sE in vitro
(172).
Por tanto, aunque es posible que se produzcan más modificaciones en la sE in
vivo, la modificación proteolítica es suficiente para la activación de la sE in vitro.
Los alelos sigE mutantes que no codifican los primeros 15 o 16 aminoácidos
de pro-sE sintetizan una proteína similar a sE que es activa sin procesamiento
(148, 283a). Un análisis de eliminación del término amino de pro-sE reveló que
los primeros 15 residuos de la secuencia "pro" contienen elementos que son
esenciales para silenciar no solo su actividad sE sino también su reconocimiento
por el aparato de procesamiento. Las deleciones en esta región aumentan la
expresión de un gen informador dependiente de sE en ausencia de procesamiento
y reducen la capacidad de procesamiento del producto mutante (229). Las
deleciones que se extienden a los siguientes 15 aminoácidos disminuyen la
acumulación de un producto sigE en B. subtilis y, como consecuencia, reducen
la actividad del gen informador dependiente de sE (148, 229). Los genes sigE
mutantes cuya secuencia traducida comienza en cualquiera de los dos sitios de
procesamiento pro-sE putativos (es decir, el residuo 27 o 29) especifican
productos que son virtualmente indetectables en B. subtilis (148, 229). Es poco
probable que la ausencia de la secuencia pro dificulte la acumulación de sE al
alterar la traducción del ARNm de sE . Las mutaciones sin sentido o de inserción
de 20 a 50 nucleótidos corriente abajo del sitio de inicio de la traducción también
reducen sustancialmente la acumulación del producto sigE (148, 254). Los datos
son más consistentes con que la secuencia pro sea necesaria para un paso
postraduccional en la síntesis de sE (p. ej., facilitar el plegamiento adecuado de
proteínas) o estabilizar una sE lábil en forma de proproteína hasta que se
procese y se una a RNAP . Si la segunda posibilidad es correcta, la hipotética
labilidad de la sE libre puede representar un dispositivo para asegurar su
desaparición después de T4 de esporulación, cuando nuevos factores s
reemplazan a la sE para establecer el patrón de expresión génica tardía.
El hecho de que sE no se acumule cuando se sintetiza sin la secuencia pro
se debe en parte a su secuencia amino-terminal.
Una deleción de la secuencia de codificación de sigE que se extiende 10
aminoácidos más allá del extremo amino terminal sE maduro aumenta la
acumulación del producto aproximadamente 10 veces por encima del nivel
observado para el producto de un gen cuyo extremo amino es similar al del
"procesado". ' sE (H. Carlson, inédito; citado en la referencia 229). La capacidad
de la secuencia sE pro para facilitar la acumulación de sE parece ser específica.
sK, como sE, se produce como una proproteína (ver más abajo). Si la secuencia
sK pro se intercambia por la secuencia sE pro, el alelo quimérico sigK/ sigE
resultante no especifica un producto que pueda acumularse en B. subtilis (36).
Aparentemente hay una cualidad particular en la prosecuencia de sE que es
importante para la acumulación de sE .
La secuencia pro de sE contiene la mayoría, si no todos, los elementos
objetivo necesarios para su eliminación. La colocación de la secuencia sE pro
en el factor sigma de esporulación sK da como resultado una proproteína
quimérica que se procesa en B. subtilis en el momento del desarrollo en el que
normalmente se produce el procesamiento pro-sE (36).
Se llevaron a cabo estudios mutacionales para identificar regiones de la
prosecuencia que eran esenciales para el reconocimiento por parte del aparato
de procesamiento (229). Estos experimentos sugirieron que la presencia de
aminoácidos particulares en el sitio de corte en sí no es
B. FACTORES SUBTILIS SIGMA 15
esencial para el procesamiento y que el procesamiento pro-sE requiere, como
mínimo, un elemento dentro de los primeros 15 aminoácidos del extremo amino
de la secuencia pro y al menos un residuo específico (Glu) cerca del sitio de
procesamiento (posición 25) ( 229).
La actividad que procesa pro-sE, como la síntesis de pro-sE en sí, está
regulada por el desarrollo y aparece en la esporulación de B. subtilis
aproximadamente 1 h después del inicio de la síntesis de pro-sE (307). La
importancia de la reacción de procesamiento como el dispositivo que determina
cuándo se activa sE se puede ver cuando se permite una cepa de B. subtilis
con un alelo sigE que codifica directamente un producto activo (es decir, faltan
los primeros 15 codones de la secuencia pro). esporular. Tal cepa es Spo2 y se
bloquea en las primeras etapas de la esporulación (etapa 0)
(231). Aparentemente, el control transcripcional solo da como resultado la
síntesis de sE en un momento en que su actividad interrumpe el patrón normal
de expresión génica temprana de esporas. El momento de la esporulación en el
que la pro-sE se convierte en sE coincide con el momento en el que la célula en
desarrollo se divide en los compartimentos de célula madre y espora principal.
Existe una especulación considerable de que estos dos eventos están
relacionados y que algún aspecto del proceso de tabicación funciona directa o
indirectamente como una señal para la activación de sE (79, 125, 186, 284,
304). Uno de los argumentos más sólidos a favor de la dependencia del
procesamiento pro-sE de la tabicación es la observación de que las células
mutantes de B. subtilis que carecen de los productos de los genes esenciales
de tabicación (p. ej., ftsZ y divIC) no logran formar tabiques de esporas ni
convertir pro-sE en sE (11, 179). Se supone que la falta de productos génicos
esenciales de tabicación inhibe indirectamente el procesamiento de pro-sE, a
través del bloqueo de la formación de tabiques (11, 179). Aunque la tabicación
y el procesamiento pro-sE parecen estar normalmente acoplados, los tabiques
intactos per se pueden no ser esenciales para que ocurra el procesamiento de
pro-sE. Se ha informado que la penicilina, en concentraciones que bloquean la
tabicación normal en etapa II, no logra bloquear el procesamiento pro-sE (147).
No se sabe cómo la penicilina desacopla estos dos procesos.
Además de ftsZ y divIC, se necesitan los productos de al menos cuatro genes
adicionales (spoIIGA, spoIIAA, spoIIAC y spoIIE) para el procesamiento pro-sE
(146, 149, 284, 307). De estos cuatro genes, es más probable que spoIIGA, el
gen corriente arriba del operón que codifica pro-sE, codifique una proteína que
participe directamente en la reacción de procesamiento (284). La expresión
forzada tanto de spoIIGA como de spoIIGB/ sigE, pero no de spoIIGB/ sigE solo,
en células vegetativas de B. subtilis conduce a un nivel bajo pero medible de
actividad promotora dependiente de sE (284). Esto se ha interpretado como
evidencia de que SpoIIGA es la enzima procesadora pro-sE (284). La idea de
que SpoIIGA juega un papel directo en el procesamiento pro-sE está respaldada
por el aislamiento de una mutación de sentido erróneo en spoIIGA que suprime
el procesamiento alterado de un producto del alelo mutante sigE (sigE25EK)
(231).
La secuencia de aminoácidos predicha de SpoIIGA sugiere que podría ser tanto
una proteína asociada a la membrana como una proteasa (200, 284). El hallazgo
de que una quimera de SpoIIGA y el producto del gen lacZ de E. coli se
sedimenta durante la ultracentrifugación con los componentes de la membrana
de un extracto crudo de B. subtilis es coherente con la posible asociación de
membrana de SpoIIGA (230). Las propiedades pronosticadas y observadas de
SpoIIGA, cuando se toman con el aparente acoplamiento del procesamiento de
pro-sE al evento de tabicación de esporas, han llevado a sugerir que SpoIIGA
podría ser la enzima de procesamiento de pro-sE y activarse para escindir pro-
sE al convertirse. incrustado en la membrana de la espora recién formada. Tal
proceso vincularía la activación de sE con el desarrollo morfológico de la espora
(284).
Aunque la simplicidad de este modelo es atractiva, probablemente sea una
simplificación excesiva. Tanto los mutantes spoIIE como spoIIA forman tabiques
pero no procesan sE (137).
Es probable que el papel de los productos spoIIA en el procesamiento pro-sE
Machine Translated by Google
16 HALDEN WANG
ser indirecto. spoIIA codifica el factor sigma sF específico de la
esporulación y sus reguladores (91, 283). sF, como
de la septación
sE, se activa
(191,
después
227).
No es esencial para la transcripción de ninguno de los operones que se
sabe que son necesarios para la conversión de pro-sE en sE (11, 109,
158, 329). Por lo tanto, si la contribución de sF a la síntesis de sE depende
de su función como factor de transcripción, la reacción de procesamiento
requerirá el producto de al menos un operón dependiente de sF no
identificado . Aunque la función conocida de sF como factor de transcripción
es la explicación más simple de su papel en el procesamiento pro-sE,
existen otras posibilidades. Una subclase de mutantes spoIIAC [spoIIAC(P)]
parece codificar un sF inactivo que aún permite el procesamiento pro-sE
(137). A partir del fenotipo de esta clase de mutantes, se ha propuesto que
sF podría tener un papel indirecto en el procesamiento de pro-sE que no
depende de su función como activador transcripcional (137, 227).
Cuál podría ser este rol alternativo permanece sin definir.
También se sabe que spoIIE es esencial para la síntesis de sE . La
secuencia de SpoIIE no predice su función, pero revela dominios hidrófobos
que se encuentran en proteínas asociadas a la membrana (334a). Las
células de B. subtilis que carecen de SpoIIE forman tabiques que contienen
cantidades anormalmente grandes de material de la pared celular (137, 232).
Si un tabique "normal" resulta ser un requisito previo para el procesamiento
pro-sE, SpoIIE puede ser necesario para esta reacción solo en la medida
en que sea importante para la formación del tabique de la espora normal
(284). Vale la pena señalar que SpoIIE no solo se requiere para el
procesamiento de pro-sE, sino que también juega un papel esencial en la
activación de sF (191, 227). Recordando que se necesita sF activo
(SpoIIAC) para el procesamiento pro-sE, no está claro si el papel de
SpoIIE en el procesamiento pro-sE se limita a la activación de sF o si
también juega un papel directo en la reacción de procesamiento pro-sE.
Los patrones de expresión de los genes que se sabe que dependen de
E-sE o E-sF para su transcripción (34, 66, 191) (ver más abajo) argumentan
que es probable que estas holoenzimas estén activas en diferentes
compartimentos de la célula que esporula, con E- sE que participa en la
transcripción específica de la célula madre (66) y E-sF dedicado a la
expresión génica específica de las esporas (191). Para dar cuenta de esta
actividad compartimentada, se han desarrollado modelos sofisticados de
activación del factor s en los que se propone que la formación del tabique
desencadena no solo la activación temporal de sE y sF , sino también su
activación específica del compartimento (79, 125, 186, 191). Un modelo
representa la tabicación como un evento que conduce a la activación de
sF solo en el compartimento de las esporas. Esto da como resultado la
expresión específica de la espora de genes dependientes de sF , que
luego se comunican con SpoIIGA en el lado de la célula madre de la
membrana de la espora, indicándole que procese pro-sE solo en el
compartimento de la célula madre.
La mecánica propuesta para los pasos individuales involucrados en este
proceso ha sido cubierta en varias revisiones recientes (76, 79, 125, 186).
Un modelo alternativo, basado en un estudio de microscopía de
fluorescencia de la expresión génica específica del compartimento,
propone que sF y sE están activos inicialmente en ambos lados de la
membrana de la espora, pero luego se inactivan selectivamente en uno u
otro compartimento celular para restringir en última instancia el dependiente
de sE. transcripción a la célula madre y transcripción de sF a la espora
(34). Los análisis de transferencia Western diseñados para detectar sE
procesada en extractos enriquecidos con células madre o material de
esporas y probar los modelos de la competencia han arrojado resultados
contradictorios (35, 162). Independientemente de qué modelo para la
localización del factor s sea correcto, existe un acuerdo general de que sE
y sF en última instancia dirigen la expresión génica específica de la célula
madre y la espora, respectivamente.
genes transcritos con E-sE . Las cualidades bioquímicas de sE como
un nuevo factor sigma se definieron in vitro mediante el uso de una
secuencia similar a un promotor fortuito en el plásmido pMB-9 de E. coli y
MICROBIOLÓGICO. RVDO.
varias regiones de ADN de B. subtilis clonado (112). Estas plantillas se
transcriben débilmente por E-sE in vitro y es poco probable que dependan
de E-sE in vivo (112). Un promotor de B. subtilis (G4) que es utilizado
eficientemente por E-sE in vitro y dependiente de esta forma de RNAP in
vivo se identificó en un banco de clones de B. subtilis utilizando ARN
transcrito por E-sE in vitro a partir de B. subtilis DNA como sonda de
hibridación (249). G4 se usó en un análisis mutacional que definió las
secuencias que son importantes para el reconocimiento del promotor
dependiente de sE (Tabla 1) (245, 248).
Se descubrió un segundo promotor dependiente de sE (bvx) en un
fragmento de ADN que llevaba el operón rrnB de B. subtilis clonado (117).
Se desconocen las funciones de los operones controlados por los
promotores G4 y bvx .
Se han clonado , secuenciado y demostrado que dependen de _ _ _ _
_ _ _ _ _ _ en E-sE para al menos una parte de su expresión. La mayoría
de estos genes se conocían previamente por mutación y se clonaron sobre
la base de la capacidad del alelo de tipo salvaje para complementar un
fenotipo mutante o por selección de un marcador de resistencia a
antibióticos presente en el transposón que generó la mutación. Dos de los
genes (spoVID y spoVR) se identificaron específicamente en una búsqueda
de promotores dependientes de sE (10, 12), mientras que cotE se identificó
utilizando una sonda de oligonucleótidos que se desarrolló a partir de la
secuencia de la proteína cotE (337). Estos genes se asignaron al regulón
sE en función de su cumplimiento de varios, si no todos, de los siguientes
criterios: (i) falta de expresión en cepas de B. subtilis que carecen de sE,
(ii) transcripción por E-sE in vitro , (iii) la presencia de una secuencia
consenso de sE en sus promotores, y (iv) su expresión en B. sub tilis
vegetativa tras la síntesis inducida artificialmente de una forma activa de
sE. spoIID fue el primer gen conocido que se identificó como parte del
regulón sE (253). La función explícita del producto spoIID no es segura;
sin embargo, las cepas de B. subtilis que carecen de SpoIID no logran
eliminar por completo el material de la pared celular que se encuentra en
la periferia del tabique de la espora y, como consecuencia, no logran
avanzar hasta la absorción de la espora (137). La posibilidad de que el
producto spoIID pueda participar directamente en la eliminación del
material de la pared septal se sugiere por la similitud de secuencia entre
él y un modificador de la actividad de amidasa (D. Karamata, no publicado;
citado en la referencia 125). Aunque el supuesto papel de SpoIID en la
modificación del tabique que separa la célula madre de la espora deja
abierta la posibilidad de que pueda ser necesario en ambos compartimentos,
existe evidencia genética de que su expresión en el compartimento de la
célula madre es suficiente para la esporulación (139) y evidencia
microscópica inmunoelectrónica de que su expresión está restringida a
ese compartimiento (66). El estudio con microscopio electrónico proporcionó
una documentación visual convincente de la expresión de spoIID solo en
el compartimento de la célula madre y centró la atención en la idea de que
sE podría ser un factor s específico de la célula madre (66).
spoIIM codifica una proteína de 29 kDa, con elementos básicos e
hidrofílicos, que se requiere para la expresión de genes de esporas
transcritas por E-sG (274). Los estudios de fraccionamiento celular
documentaron la presencia de b-galactosidasa de una fusión spoIIM-lacZ
tanto en la célula madre como en el compartimento de la espora, y el
extracto de la célula madre contenía aproximadamente el doble de b-
galactosidasa por miligramo de proteína que el extracto de la espora
(275). . Los estudios genéticos argumentaron que la expresión de spoIIM
en la espora es esencial para la esporulación, pero que su transcripción
es independiente de los factores sF y sG específicos de la espora (275).
La dependencia de la transcripción de spoIIM en sE, cuando se toma con
la necesidad de expresión de spoIIM en el compartimento de esporas
anterior, implica que spoIIM se transcribe por E-sE
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VOLUMEN 59, 1995
en la preespora. Esto entra en conflicto con la noción de que sE es un
factor s específico de células madre. Sin embargo, si, como sugiere un estudio
(34), sE se activa inicialmente en ambos compartimentos y sólo
restringido a la célula madre más adelante en la esporulación, spoIIM puede
ser transcrito por sE en la preespora inmediatamente después de sE
activacin, siendo esta expresin temprana adecuada para satisfacer
el requerimiento de la forespora para su producto. Aunque este es un
simple explicación de los datos, todavía es posible que E-sE sea
únicamente una enzima específica de células madre. Si esto es así, un suplente,
manera no descubierta de expresar spoIIM en la forespora que
no depende de sE sería necesario.
spoIIID es otro gen esencial para la esporulación transcrito por
E-sE. El gen spoIIID fue clonado de forma independiente por dos laboratorios
(167, 281) y se descubrió que codifica un factor de transcripción de esporulación
previamente identificado que modula la expresión de los genes dependientes de
E-sE y E-sK (165). Aparte
de la dependencia de E-sE, máxima expresión de spoIIID
también requiere una copia intacta de spoIIID, lo que sugiere autorregulación de
la transcripción de spoIIID (167, 281). El promotor spoIIID
se ha utilizado en estudios de interacciones factor-promotor en
qué sustituciones de aminoácidos en sE se encontró que suprimen
los efectos negativos de los cambios de pares de bases específicos en el spoIIID
promotor (295). Existe evidencia genética de que spoIIID necesita
expresarse sólo en el compartimento de la célula madre para que
realizar su función esencial de esporulación (61), y los datos de fraccionamiento
celular han localizado el producto b-galactosidasa de un
gen de fusión spoIIID-lacZ al compartimento de la célula madre
(167).
spoIIIA define un operón de al menos tres genes (138) que
se requiere para que una célula en esporulación avance más allá de la etapa de
engullimiento (232). Las funciones explícitas del spoIIIA
Los productos son desconocidos, aunque la expresión esencial de esporulación
de spoIIIA se requiere solo en la célula madre (139). Las mutaciones en spoIIIA
conducen no solo a una reducción significativa, sino también a la
transcripción de varios de los genes de la proteína de la cubierta expresados en
células madre (255, 339), pero también a reducciones variables en la expresión
génica específica de las esporas anteriores (49, 136, 152, 199). Ha sido
propuso que spoIIIA proporciona una función específica de la célula madre
que indirectamente afecta el desarrollo de las esporas (136, 138).
Varios genes dependientes de sE (spoIVCA, spoIVCB, spoIVFA,
spoIVFB y bofA/ ski-4) participan en la síntesis de sK,
el factor de células madre de acción tardía (ver más abajo). sK está codificado
por un gen compuesto (sigK) formado cuando dos genes truncados
se unen mediante la escisión de una secuencia intermedia (286).
spoIVCB, la porción amino-terminal de este gen compuesto,
y spoIVCA, que codifica la recombinasa que cataliza
la escisión, se transcriben ambas inicialmente por E-sE, aunque
la expresión posterior de sigK ocurre por E-sK (164, 169, 256).
spoIVF codifica dos genes (A y B) que participan en la
procesamiento de sK a partir de su forma precursora inactiva (pro-sK) (53,
188). Mutaciones (bofB [bypass de forespore]) que desacoplan
el procesamiento de pro-sK a partir de eventos que ocurren en la espora
delantera (51) se ha mapeado en spoIVFA (53). De los fenotipos de mutaciones
sin sentido y nulas en los dos cistrones de spoIVF
y las propiedades previstas de sus productos, SpoIVFA y
Se supone que SpoIVFB se encuentra en la membrana exterior de la espora
anterior, donde podría funcionar en el acoplamiento intercompartimental entre la
espora anterior y la célula madre, es decir, SpoIVFB es
se cree que es una proteína que promueve el procesamiento pro-sK pero es
SpoIVFA impidió actuar a menos que una señal del
forespore desencadena su liberación (53). Un segundo gen (bofA/ ski-4),
en el que se encuentran mutaciones que desacoplan el procesamiento pro-sK
de los eventos de esporas, también parece ser transcrito por
E-sE (140, 250). Este gen fue identificado por dos laboratorios
estudiando diferentes fenómenos regulatorios: el acoplamiento de
procesamiento pro-sK a eventos de esporas (bofA) (250) y el
B. FACTORES SUBTILIS SIGMA 17
supresión de la esporulación por la sobreexpresión de una histidina proteína
quinasa, KinA (ski-4) (140). BofA es una hipótesis
para cooperar con SpoIVFA para inhibir SpoIVFB-dependiente
procesamiento pro-sK (250).
Los genes spoVB, spoVD, spoVE, spoVM y spoVR son todos
transcritos de uno o más promotores dependientes de sE, con
algunos de estos genes también requieren la célula madre específica
proteína reguladora transcripcional SpoIIID para su expresión
(12, 55, 178, 204, 235, 300). Las mutaciones en estos genes conducen a
la producción de esporas que contienen una corteza defectuosa, la
estrato de peptidoglicano modificado depositado entre las membranas que
separan la espora de la célula madre. En
manteniendo su papel en la síntesis de esta pared celular especializada
material, dos de estos genes (spoVD y spoVE) han sido
encontrado para ser homólogo a las proteínas de unión a la penicilina (es decir,
síntesis de peptidoglicanos) o proteínas morfogénicas de otros
bacterias (55, 135, 150).
spoVK (spoVJ) también es parte del regulón dependiente de sE, con
un requerimiento adicional de la proteína SpoIIID para su expresión (84). El
análisis de ARN reveló dos spoVK superpuestos
transcripciones (93). El promotor putativo de uno de los transcritos se asemeja a
un promotor de consenso para E-sE, mientras que el
segundo se parece al de un promotor dependiente de sK (93). Célula
los experimentos de fraccionamiento han localizado la expresión de SpoVK
principalmente al compartimento de la célula madre (93). La función
de spoVK es desconocido, pero las mutaciones en este locus dan como resultado
esporas inmaduras que son resistentes a la lisozima (una espora temprana
marcador de resistencia) pero sensible a los disolventes orgánicos (un
marcador) (126). Ácido dipicolínico (DPA), un compuesto asociado
con la resistencia de la espora al calor (76), parece estar sintetizado en mutantes
de spoVK pero no se incorpora a la espora pre, lo que sugiere que SpoVK está
involucrado en
Transporte de DPA a la espora en desarrollo (126).
spoIVA (232, 252, 280), spoVID (10) y cotE (337, 339)
codifican proteínas morfogénicas que son necesarias para el correcto
ensamblaje de la cubierta de esporas, una estructura proteica que
rodea la espora y contribuye a sus propiedades de resistencia. Los tres se
transcriben a partir de promotores dependientes de sE,
con cotE que tiene promotores sE duales , uno de los cuales requiere
SpoIIID para su activación (10, 252, 280, 337, 339). Electrón
estudios microscópicos revelaron que SpoIVA y CotE rodean
la preespora, probablemente asentada cerca de la membrana exterior de la
espora, desde donde dirigen el ensamblaje de la capa de esporas
(73).
Con la posible excepción de spoIIM, se cree que todos los genes spo
dependientes de sE que se han analizado en detalle
expresarse exclusivamente en el compartimento de la célula madre.
Genes adicionales que codifican enzimas extracelulares (p. ej., alcalina
fosfatasa y ADNasa) que es probable que se expresen en
la célula madre para la excreción también contiene secuencias promotoras
potenciales de sE (revisadas en la referencia 76). el restringido
la expresión de genes dependientes de sE en el compartimento de la célula
madre es el argumento principal para que sE sea un factor s específico de la
célula madre.
Factor Sigma SF
Clonación y caracterización. La existencia de la novela.
factor sigma que se convertiría en sF se dedujo de la
secuencia del gen de esporulación spoIIAC (78, 283). los
El locus spoIIA se clonó sobre la base de la capacidad de la secuencia de tipo
salvaje para complementar las mutaciones de Spo2 que mapearon
a este sitio (183, 260). Se encontró que el ADN clonado original
contiene solo una porción de spoIIA (183) y se usó como
sonda de hibridación para clonar la unidad de transcripción completa (233).
Estudios de integración de plásmidos (233) y secuenciación de ADN (91)
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18 HALDEN WANG
reveló que spoIIA era un operón policistrónico que incluía tres marcos
de lectura abiertos. Aunque hubo un error de secuenciación en el tercer
marco de lectura abierto (spoIIAC), lo que resultó en una subestimación
del tamaño de su producto (78, 283), aún se apreciaba la similitud entre
este marco de lectura abierto y la secuencia de factores sigma conocidos
( 78). Las similitudes se hicieron aún más evidentes una vez que se
descubrió el error de secuenciación (283). A partir de las homologías
entre spoIIAC y otros factores sigma bacterianos, así como el fenotipo
de los mutantes de B. subtilis que carecían de él, se supuso que
SpoIIAC era un factor sigma esencial para la esporulación que aún no
se había detectado bioquímicamente (283). La idea de que spoIIAC
codificaba una proteína similar a sigma fue apoyada por estudios
genéticos que encontraron que las mutaciones de sentido erróneo que
comprometían la actividad esencial de esporulación de SpoIIAC estaban
localizadas en regiones de su dominio predicho de unión a ADN o de
unión a RNAP central (335, 336). El descubrimiento del producto
spoIIAC ocurrió inesperadamente durante la búsqueda de una forma de
RNAP que pudiera transcribir el gen sspE específico de la espora (292).
La evidencia genética y bioquímica sugirió que ni SpoIIAC ni sE (el
único otro factor sigma específico de esporulación conocido en ese
momento) estaban directamente involucrados en la transcripción de
sspE , por lo que un nuevo factor sigma específico de esporulación
podría dirigir la transcripción de sspE in vitro . fue buscado (292). RNAP
de células que expresan sspE se purificó mediante cromatografía de
heparina-agarosa, centrifugación en gradiente de glicerol y cromatografía
de ADN-celulosa, con la porción de transcripción de sspE de la
preparación posteriormente fraccionada mediante SDS-PAGE preparativa
(292). Un experimento de reconstitución reveló que los productos
renaturalizados de dos bandas de proteínas diferentes podían estimular
de forma independiente la transcripción de sspE in vitro (292). El análisis
de la secuencia demostró que las proteínas estimulantes eran
probablemente los productos de los genes spoIIAC y spoIIIG y se
denominaron sF y sG, respectivamente (292). Aunque E-sF es capaz
de transcribir sspE in vitro, no es probable que sea responsable de su
expresión in vivo. Una cepa de B. subtilis que carece de sG pero
contiene sF no muestra actividad de sspE-lacZ in vivo (292). sF y sG
tienen propiedades de reconocimiento de promotores similares, lo que
se supone que explica sus actividades in vitro superpuestas (Tabla 1)
(291, 292). regulación SF . (i) Regulación transcripcional. El gen
estructural sF es el cistrón distal del promotor de un operón cuyo
principal sitio de inicio transcripcional está ubicado 27 nucleótidos antes
del primer marco de lectura abierto (Fig. 3) (327). Los estudios de
expresión de spoIIA lacZ revelaron que la expresión de b-ga lactosidasa
dependiente de spoIIA está ausente en B. subtilis en crecimiento
vegetativo, pero comienza a aparecer de 30 a 60 minutos después de
la inducción de la esporulación (82, 327). Esta expresión depende de
los productos de todos los loci spo0 conocidos, pero ninguno de los loci
spo0 posteriores que se probaron (82, 327). Se obtuvieron resultados
similares cuando se analizó el ARNm específico de spoIIA; sin embargo,
estos experimentos también revelaron dos transcritos de ARN que se
originaban a partir de la secuencia spoIIA (261). El transcrito más
pequeño (1,6 kb) aparece temprano (T1) y persiste, mientras que un
segundo transcrito más grande (2,6 kb) no aparece hasta T3 (261). Se
cree que el ARN más grande se origina a partir de un promotor ubicado
aproximadamente 1 kpb corriente arriba del promotor proximal (261,
264, 329) e incluye un marco de lectura abierto (dacF) cuyo producto
predicho tiene una homología de secuencia amplia con las DD-
carboxipeptidasas (329) .
Las secuencias aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción para
el transcrito más grande son similares a las de los promotores
dependientes de sF (264) y se asemejan a las secuencias encontradas
aguas arriba de un gen (0,3 kb) que se expresa tarde en la esporulación
en la preespora (224, 329) . La expresión de dacF se elimina en SigF2
y se reduce en las cepas SigG2 de B. subtilis y se induce en B. subtilis
en crecimiento vegetativo mediante la síntesis artificial de sF o sG (264).
Esto argumenta que el promotor dacF se transcribe principalmente por
MICROBIOLÓGICO. RVDO.
E-sF y que la síntesis de sF a partir de este promotor está así
autorregulada (264). La integración de plásmidos, utilizados para
delimitar el tamaño de la región de control esencial de spoIIA , mostró
que al menos 52 pb corriente arriba del sitio de inicio son esenciales
para la expresión de spoIIA pero que la región corriente arriba de bp
2168 es innecesaria para la máxima formación de esporas (329). Por lo
tanto, parece que el promotor dependiente de sF cadena arriba es
prescindible para una expresión adecuada de spoIIA en condiciones de
laboratorio. La región aproximadamente 235 y 210 pb cadena arriba del
sitio de inicio transcripcional principal de spoIIA muestra homología con
los promotores reconocidos por E-sH de B. subtilis (329). spoIIA puede
transcribirse eficientemente por E-sH in vitro (328). In vivo, la
transcripción de spoIIA depende de la presencia de sH (329) y la forma
activada de Spo0A (28). Estos resultados son consistentes con el hecho
de que spoIIA es parte del regulón sH , con Spo0A como un regulador adicional.
El requisito de Spo0A en la transcripción de spoIIA se asemeja a un
requisito similar en la transcripción de spoIIG . Por lo tanto, aunque
spoIIA (sigF) y spoIIG (sigE) difieren en la forma de RNAP (E-sH y E-
sA, respectivamente) que reconoce a sus promotores, es probable que
ambos reciban su señal de activación específica de esporulación a
través del sistema de fosforescencia spo0A . Dado que spoIIA y spoIIG
se transcriben al mismo tiempo en la esporulación (101, 334), bajo el
control del mismo sistema de activación (Spo0A), su dependencia de
holoenzimas separadas es desconcertante. (ii) Regulación
postraduccional. Si bien la regulación transcripcional determina cuándo
aparece sF en la célula en desarrollo, su activación requiere factores
adicionales. Un estudio genético reveló que los dos genes aguas arriba
del operón spoIIA, spoIIAA y spoIIAB , codifican potentes reguladores
de la actividad de sF (263). Se descubrió que la sobreexpresión de
spoIIAB inhibía la expresión génica dirigida por sF, mientras que las
mutaciones en spoIIAB estimulan los genes dependientes de sF .
Además, se observó que una mutación en spoIIAA que bloquea la
transcripción dirigida por sF podría ser suprimida por una mutación en
spoIIAB. Estos resultados se interpretaron como evidencia de que
SpoIIAB es un antagonista de sF y SpoIIAA contrarresta sus efectos
negativos (263). También se observó que las sF mutantes , que se
vuelven capaces de reconocer
, transcritos promotores
por otras que normalmente
holoenzimas sonE-sB y
RNAP (es decir,
E-sG), siguen siendo sensibles al control por SpoIIAA y SpoIIAB al
iniciar la transcripción desde estos promotores previamente no
reconocidos (191, 263). Esto implicaba que SpoIIAA y SpoIIAB
funcionaban al nivel de actividad de E-sF en lugar de al nivel de una
secuencia promotora particular (263). La evidencia de que SpoIIAB
afecta a la transcripción dependiente de sF mediante una interacción
proteína-proteína directa provino de un estudio de entrecruzamiento in
vitro en el que se demostró que SpoIIAB purificado se asociaba
físicamente con sF (74). La incubación de sF con SpoIIAB también
inhibe la transcripción dependiente de sF in vitro (74, 202). A partir de
estos hallazgos, se consideró que SpoIIAB era un factor anti-sigma y se
sugirió que SpoIIAA funcionaba como un factor anti-anti-s (74).
La importancia esperada de SpoIIAB en la regulación adecuada de
la actividad de sF durante la esporulación se confirmó en un estudio en
el que se encontró que una mutación de deleción de spoIIAB causaba
hiperexpresión de genes que normalmente se expresan en la espora
anterior y detenía la esporulación en su etapa más temprana (etapa 0) (48).
Por lo tanto, la aparición de sF activo en el momento en que el operón
que lo codifica se vuelve transcripcionalmente activo da como resultado
una interrupción del programa de esporulación. Este es el mismo
fenómeno que ocurre si una forma activa de sE se sintetiza directamente
a partir de spoIIG (231). Aparentemente, la síntesis de sF y sE en
formas inactivas es esencial para establecer el programa correcto de
expresión génica temprana de esporas. La regulación postranscripcional
de sF y sE representa así un dispositivo que permite que los operones
que los codifican sean controlados por la espora temprana principal
Machine Translated by Google
VOLUMEN 59, 1995
regulador de genes (Spo0A) al tiempo que les impide reprogramar
prematuramente RNAP a medida que se acumulan.
Se ha propuesto que el sistema regulador SpoIIAA/SpoIIAB, al igual
que el sistema de procesamiento pro-sE, juega un papel fundamental
en el control no solo del tiempo de activación del factor s, sino también
del compartimento celular en el que tiene lugar esta activación.
Así como se cree que la reacción de procesamiento pro-sE restringe
la transcripción de sE a la célula madre, se ha propuesto que el
sistema SpoIIAA/SpoIIAB restringe la expresión génica dirigida por sF
a la espora (5, 191, 227, 263). Se desconoce el mecanismo por el cual
SpoIIAA provoca la liberación de sF a partir de la inhibición mediada
por SpoIIAB; sin embargo, in vitro, se ha demostrado que SpoIIAB se
une preferentemente a SpoIIAA o sF , dependiendo de la proporción
de ADP a
ATP que esté presente en la mezcla de reacción. Una relación ADP/
ATP alta favorece la formación del complejo SpoIIAB-SpoIIAA, mientras
que una relación baja facilita la unión de SpoIIAB a sF (5). Se ha
propuesto un modelo en el que los niveles de ATP podrían descender
selectivamente en el compartimento de la preespora mientras
permanecen relativamente altos en la célula madre, activando así sF
solo en el lado de la preespora de la membrana septal (5). Se
desconoce si los cambios hipotéticos en los niveles de ATP ocurren in
vivo o qué procesos podrían causar tal cambio de ATP en la forespora.
Otros experimentos demostraron que SpoIIAB tiene una actividad
quinasa que puede fosforilar SpoIIAA in vitro (202). Esta modificación
parece inhibir la capacidad de SpoIIAA para unirse a SpoIIAB (5). El
papel de la fosforilación de SpoIIAA en el control in vivo de sF y las
señales que lo provocan no están claros.
Aunque aún es necesario resolver los detalles de la regulación de
sF , existe un acuerdo general de que la transcripción de los genes
dependientes de sF eventualmente se restringe al compartimiento de
la espora. Como es el caso de la restricción de la actividad de sE a la
célula madre, existen modelos competitivos en los que sF se activa
selectivamente solo en el compartimento de las esporas debido a un
entorno único en ese compartimento (5, 191) o inicialmente activo en
ambos. compartimentos y restringida a la preespora como consecuencia
de su eventual inactivación en la célula madre (34). Independientemente
del modelo correcto, la activación de sF parece requerir el evento de
tabicación y el producto de al menos un gen esencial para la
esporulación (spoIIE)
(191, 227). El producto de un segundo gen de esporulación (spoIIIE)
también se necesita normalmente para la expresión de genes
dependientes de sF (92); sin embargo, el requisito de SpoIIIE puede
pasarse por alto si el gen transcrito por E-sF (p. ej., spoIIIG o gpr) se
mueve a un sitio diferente en el cromosoma de B. subtilis (291). El
hecho de que la transcripción dependiente de sF pueda ocurrir en
ausencia de SpoIIIE argumenta que no se requiere SpoIIIE para la
liberación de sF de SpoIIAB (191). Un reciente estudio de microscopía
electrónica demostró de manera convincente que SpoIIIE desempeña
un papel en la partición adecuada del cromosoma de B. subtilis en la
espora principal (330). Este resultado implica que es probable que el
requisito de SpoIIIE en la transcripción dependiente de sF sea indirecto
y resultado de la necesidad de SpoIIIE para transferir un cromosoma
intacto al compartimento donde sF es máximamente activo.
genes transcritos por E-sF . Además del promotor dacF , que
parece ser parte de un operón sigF extendido (264), spoIIIG y gpr son
los únicos ejemplos adicionales de genes que se sabe que dependen
de sF para al menos una parte de su expresión (227, 293). Al igual
que con dacF, ambos genes también pueden transcribirse mediante
la forma E-sG de RNAP (227, 293). spoIIIG, el gen estructural de sG ,
se identificó como un marco de lectura abierto similar a sigma
inmediatamente aguas abajo del operón (spoIIG) que codifica sE (152,
201). Como implica su designación, la interrupción del marco de lectura
spoIIIG bloquea la esporulación en la etapa III (152, 201). Un sistema
informador spoIIIG-lacZ , utilizado para estimar el tiempo de desarrollo
cuando la transcripción spoIIIG se vuelve ac
B. FACTORES SUBTILIS SIGMA 19
tivo, sintetizó b-galactosidasa 2,5 h después del inicio de la
esporulación y continuó generando b-galactosidasa durante las
siguientes 2 h (152). El fraccionamiento de estas células esporulantes
en extractos enriquecidos con células madre y esporas separó la b-
galactosidasa principalmente en el extracto de esporas (152). Los
experimentos genéticos implicaron que la expresión de spoIIIG en el
compartimento de esporas anterior era necesaria para que una célula
esporulara con éxito (139). Los datos fueron consistentes con la
codificación de spoIIIG de un factor sigma específico de la espora
(152). La idea de que la expresión de spoIIIG depende de sF se basa
tanto en experimentos in vitro en los que se encontró que E-sF
transcribía spoIIIG (292) como en experimentos in vivo en los que la
inducción de la síntesis de sF en B. subtilis en crecimiento vegetativo
activó la transcripción de spoIIIG (227 ), y estudios genéticos en los
que se demostró que las mutaciones que inactivan sF bloquean la
expresión de spoIIIG (92, 152, 227).
El último gen que se sabe que es transcrito por E-sF in vivo es gpr.
gpr es la secuencia codificante de una endopeptidasa que degrada la
reserva proteica de la espora (proteínas de esporas pequeñas solubles
en ácido [SASP]) tras la germinación (293). B. subtilis gpr, a juzgar por
el reparto específico del compartimento del producto de una fusión gpr-
lacZ , se expresa principalmente, si no exclusivamente, en la preespora
(292). La síntesis de gpr se suprime en un mutante spoIIAC (sigF) y
se reduce un 50 % en un mutante spoIIIG (sigG) (293). Por lo tanto,
es probable que gpr sea transcrito tanto por E-sF como por E-sG.
Además de spoIIIG y gpr, varios genes específicos de esporas (p. ej.,
gerA y sspE) que parecen ser transcritos principalmente por E-sG in
, por
vivo también pueden ser transcritos por E-sF por razones desconocidas,
si se altera su ubicación cromosómica (291). Al menos uno de ellos,
sspE, también puede ser transcrito por E-sF in vitro (292). Las
secuencias de consenso para los promotores dependientes de sF y
sG (Tabla 1) son muy similares (291, 293), y es posible que una de las
funciones de sF sea activar inicialmente algunos de los operones que
finalmente serán transcritos por E-sG.
Hay pruebas de que queda por descubrir al menos un gen
dependiente de sF . El procesamiento de pro-sE en su forma activa
requiere el producto del gen spoIIAC/ sigF (146, 284); sin embargo, no
se ha encontrado que ningún operón que se sepa que es necesario
para la reacción de procesamiento requiera sF para su expresión. Por
lo tanto, la propia proteína sF participa directamente de alguna manera
en la reacción de procesamiento (137, 227) o existe un operón
dependiente de sF no descubierto cuyos productos se requieren para
el procesamiento pro-sE . A partir de un pequeño número de genes
diana identificados, la transcripción dependiente de sF parece estar
limitada a la expresión temprana de genes específicos de esporas.
Factor Sigma sG
Identificación y clonación. El gen estructural sG se descubrió
inmediatamente aguas abajo del operón que codifica para sE (spoIIG)
como un marco de lectura abierto (spoIIIG) que contenía elementos
de secuencia en común con factores sigma conocidos (152, 201). Se
descubrió la propia proteína sG , junto con sF , durante una búsqueda,
de factores que pudieran activar la transcripción del gen sspE
específico de la espora (292). Se observó que RNAP preparado a
partir de células en esporulación y purificado por cromatografía en
columna transcribía sspE in vitro. Cuando las proteínas contenidas en
esta fracción RNAP se separaron mediante SDS PAGE, se
renaturalizaron y se volvieron a agregar al núcleo RNAP, se encontraron
dos proteínas diferentes que eran capaces de dirigir RNAP al promotor
sspE (292). Una comparación de sus secuencias amino terminales
con las secuencias de genes de esporulación conocidos identificó uno
como SpoIIAC (sF ) y el segundo como SpoIIIG (sG) (292).
regulación sG . De la acumulación de b-galactosidasa
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20 HALDEN WANG
de una fusión traduccional spoIIIG-lacZ , expresión de
spoIIIG comienza entre 2 y 2,5 h después del inicio de la esporulación y
requiere los productos de todos los genes de esporulación de la etapa 0, así
como spoIIA, spoIIE y spoIIIE de tipo salvaje
operones (92, 290). A diferencia del retraso en la b-galactosidasa
la acumulación obtenida con la fusión traduccional de lacZ , las fusiones
transcripcionales de lacZ con la región spoIIIG dan como resultado la síntesis
de b-ga lactosidasa dentro de la primera hora de la esporulación (290).
El resultado de la fusión transcripcional fue consistente con los ensayos de
protección de nucleasa S1 de ARN específico de spoIIIG, que detectaron
Transcripciones de spoIIIG 1 h después del inicio de la esporulación (201).
Mediciones de la cantidad de b-galactosidasa expresada a partir de
diferentes fusiones transcripcionales spoIIIG-lacZ , construidas por
unir varias longitudes de regiones aguas arriba de spoIIIG a lacZ,
reveló que la síntesis temprana de ARNm de spoIIIG se debe a
lectura del operón spoIIG aguas arriba (290). los
Se podría sacar la misma conclusión del tamaño del spoIIIG
ARNm que se sintetiza temprano (201). Se piensa que el
La porción spoIIIG de este ARN temprano no se traduce debido a
una región, aproximadamente 50 bases aguas arriba del spoIIIG
sitio de iniciación de la traducción, que puede aparearse con el sitio de
iniciación y bloquear su disponibilidad para los ribosomas (201, 290). A
segundo ARNm de spoIIIG , comenzando 27 nucleótidos aguas arriba de
el codón de iniciación spoIIIG , se hace evidente entre T2 y
T4 (201, 290). Esta transcripción carece de las secuencias aguas arriba.
necesario para formar el bloque de traducción en la expresión de sG y
aparece en el momento en que el producto de las fusiones traduccionales
spoIIIG-lacZ se vuelve ensayable (290). Los de ''aparición tardía''
La transcripción de spoIIIG es la única esencial para proporcionar la
célula con sG. Introducción de un gen spoIIIG de tipo salvaje , expresable a
partir de su promotor activado tardíamente pero que carece de la capacidad de
sintetizar la transcripción temprana, suprime el fenotipo Spo
de una mutación nula de spoIIIG (290). Este principal promotor de spoIIIG
puede ser activado in vivo durante el crecimiento vegetativo por la
expresión inducida de sG o sF (227, 263, 291). invitro,
tanto E-sG como E-sF transcriben spoIIIG; sin embargo, la preferencia de E-
sF por spoIIIG es 20 veces mayor que la de E-sG (290).
Además, las mutaciones que inactivan sF pero no aquellas
que afectan sólo a la expresión de spoIIIG del bloque sG (227, 290). Por lo tanto,
la actividad del principal promotor de spoIIIG parece depender de sF
. Como tal, se esperaría que la expresión de spoIIIG
ser controlado por los reguladores de sF spoIIAA y spoIIAB y
limitado al compartimiento de la preespora (191, 263).
La pregunta de por qué spoIIIG se cotranscribe con spoIIG
al principio de la esporulación si este ARNm es prescindible para la síntesis
de sG y no se traduce ha sido discutido por Sun
et al. (290). Sugieren la posibilidad de dos independientes
mecanismos para la síntesis de sG : uno dependiente de E-sF , y un
segundo que involucra un hipotético, regulado por el desarrollo
traducción del ARNm policistrónico spoIIG-spoIIIG para producir
sG, que luego dirige una mayor expresión de spoIIIG (290). los
noción de que spoIIIG podría expresarse por E-sG, con su inicial
síntesis impulsada por la transcripción de lectura completa de spoIIG, fue
de hecho, se propuso cuando spoIIIG se identificó por primera vez como un potencial
factor s (152). Se ha planteado la hipótesis (290) de que, aunque
E-sF es la principal enzima transcriptora de spoIIIG en condiciones normales
de laboratorio, podría haber otras condiciones de crecimiento en las que se
favorezca la vía E-sG. Hay evidencia
que spoIIAB no sólo puede ser un regulador negativo de sF pero
también puede afectar directamente la actividad de sG (94, 162, 244). Por lo tanto,
si existe una vía de expresión de spoIIIG dependiente de E-sG , el
factores ambientales que modulan la actividad de sF a través de SpoI
IAA y SpoIIAB aún podrían estar en control, dirigiendo la actividad de sG
(290).
Además del control de SpoIIAA/SpoIIAB, la expresión de spoIIIG
dependiente de sF también depende del spoIIIE y posiblemente
MICROBIOLÓGICO. RVDO.
los productos spoIIIA (92, 152, 291). Aunque requerido para
esporulación, spoIIIE se expresa constitutivamente a una tasa baja
durante el crecimiento. Tiene secuencias de consenso para mononucleótido.
unión, así como varios dominios potenciales que atraviesan la membrana
(92). Las mutaciones de spoIIIE bloquean la transcripción de spoIIIG y
la expresión génica posterior de la espora, pero no parece afectar
directamente la regulación génica de la célula madre (92). Ha sido
demostrado que la expresión de spoIIIG dependiente de sF se libera de un
necesidad de SpoIIIE pero no de una necesidad de liberación de SpoI
IAB si spoIIIG se mueve a un sitio alternativo en B. subtilis
cromosoma (291). Recientes análisis microscópicos han revelado
que se necesita SpoIIIE para la segregación adecuada de B.
subtilis en el compartimento de la espora (330). Un
Se ha propuesto un modelo intrigante en el que el defectuoso
La segregación de ADN que ocurre en los mutantes spoIIIE tiene como
hipótesis dar como resultado solo un segmento específico de B. subtilis
el cromosoma está entrando en la forespora. Esta partición de un
porción limitada del cromosoma en la forespora
explicar por qué la ubicación cromosómica de un gen específico de la espora
determina si se expresa o no en un mutante spoIIIE .
Si residía en la región del cromosoma que entró en el
por lo tanto, se expresaría. De lo contrario, permanecería en
la célula madre y no se activa (330). Un adicional de
factor que podría influir en la expresión del gen de la espora viene
de la observación de que el cromosoma de la preespora se condensa
temprano en el desarrollo (268). Esto ha fomentado la
sugerencia de que la condensación cromosómica, con su potencial
para limitar el acceso RNAP, podrá establecer dominios de accesibilidad
que están alterados en el mutante spoIIIE y que sólo los genes
que están ubicados físicamente en una región accesible del cromosoma se
puede expresar (291).
El sE-dependiente, y presumiblemente específico de la célula madre,
El gen spoIIIA también ha sido implicado como regulador de spoIIIG.
expresión (152), así como la de otros genes de esporas (81,
199, 224, 246); sin embargo, se ha publicado evidencia contradictoria (136)
que deja en duda el papel de SpoIIIA en la expresión génica de las esporas.
Un gen spo de la tercera etapa III , spoIIIJ, puede codificar un regulador de
la actividad de sG . No se requiere para el
expresión del gen estructural sG pero es necesario para la
transcripción de genes que dependen de E-sG (77). spoIIIJ
consiste en un operón bicistrónico que se expresa principalmente en
células vegetativas, con el cistrón proximal al promotor necesario para
esporulación (77). Cómo SpoIIIJ controla el gen dependiente de E-sG
se desconoce la expresión.
Genes transcritos por E-sG. Se sabe que varios genes dependen
en sG para su expresión. La transcripción de estos genes,
como la síntesis de sG en sí, parece estar restringida a la
compartimiento de la preespora. Entre los genes transcritos por E-sG se encuentra
Secuencia de codificación propia de sG (spoIIIG) (290). no se requiere sg
para la expresión de spoIIIG. E-sG transcribe spoIIIG in vitro
pero con una eficiencia menor que la E-sF , el formulario RNAP
se cree que es la principal enzima transcriptora de spoIIIG (290).
Se ha especulado que sG mejora la expresión de spoIIIG
o ser la principal enzima de transcripción de spoIIIG en condiciones de
esporulación no definidas en las que la actividad de sF puede no ser
alto (152, 290).
El primer gen que demostró ser transcrito por E-sG fue
sspE (292). sspE es uno de los cinco genes (sspA a sspE) que
codifican un grupo de SASP que constituyen del 10 al 20% del
proteína que se encuentra en las esporas latentes (89). Estas proteínas se
degradan rápidamente como fuente de aminoácidos tras la germinación de
las esporas. Además, los SASP juegan un papel en la resistencia de
esporas latentes a la luz ultravioleta (269). Los cinco de estos genes tienen
sido clonado, secuenciado y mapeado en el cromosoma de B. subtilis (45–
47, 110). Fusiones traslacionales de cuatro de los ssp .
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VOLUMEN 59, 1995
los genes a lacZ revelaron que todos están regulados de manera
similar y producen b-galactosidasa, que se acumula casi exclusivamente
en el compartimento de las esporas (199). Estos genes no se expresan
en B. subtilis mutante que carece de sG , pero se expresan en B.
subtilis en crecimiento vegetativo si se proporciona una fuente de sG
(292). Tienen secuencias conservadas comunes en los pb 235 y 210
que se cree que son las secuencias diana de E-sG (Tabla 1) (217).
Un gen de esporulación tardía (0,3 kb) que se activa más tarde que
los otros genes ssp ha sido recientemente redesignado como sexto
gen ssp (sspF) (224). El promotor sspF está peor conservado que los
otros promotores ssp ; sin embargo, la expresión de sspF puede
inducirse mediante la síntesis de sG en células vegetativas, por lo que
se cree que su transcripción depende de sG (224).
Además de los genes ssp , el gen (gpr) que codifica la principal
endoproteasa responsable de la degradación de las SASP también
es reconocido por E-sG. Tanto E-sF como E-sG inician efectivamente
la transcripción de gpr en el mismo sitio in vitro (293). In vivo, la
transcripción de gpr-lacZ se elimina en ausencia de sF y se reduce a
la mitad, sin verse afectada la expresión temprana de gpr , en células
mutantes de B. subtilis que carecen de sG (293). Por lo tanto, gpr
, deE-sF
parece ser transcrito primero por E-sGy su expresión tardía depende
(293).
Es probable que el gen estructural de la glucosa deshidrogenasa
(gdh) forme parte del regulón sG . La glucosa deshidrogenasa es una
enzima específica de las esporas que se hace evidente a las 2 o 3
horas de la esporulación (97, 199), y su aparición es paralela a la
acumulación del ARNm de gdh (174). El promotor del gen gdh clonado
se parece a los promotores conocidos reconocidos por sG (215, 246,
311). E-sG transcribe gdh in vitro (215), y la acumulación de glucosa
deshidrogenasa en células esporulantes se bloquea en un mutante
nulo spoIIIG/ sigG (292). spoIVB es un gen cuyo producto se requiere
para la activación del factor sK sK específico de la célula madre
(49). Aunque es esencial para un evento específico de la célula madre,
su expresión parece estar limitada al compartimiento de las esporas,
donde se induce en la etapa de desarrollo de absorción (49). spoIVB
contiene un promotor de consenso sG , no se expresa en cepas
mutantes spoIIIG/ sigG y se induce en B. subtilis en crecimiento
vegetativo si está presente sG (49, 309). spoVA es un operón con un
patrón de expresión similar al de los genes dependientes de sG (81).
Las mutaciones de spoVA dan como resultado la producción de
esporas inmaduras que son parcialmente resistentes al tolueno y la
lisozima pero sensibles al calor y al cloroformo y no acumulan DPA
en la preespora (80). El locus spoVA ha sido clonado (260, 261) y, a
partir de su secuencia, se cree que codifica un ARNm policistrónico
que incluye al menos cinco genes (90). Los análisis genéticos han
demostrado que spoVA debe expresarse en la preespora para que se
produzca la esporulación (61, 139).
Los estudios de fraccionamiento celular demostraron que el producto
de una fusión spoVAA-lacZ se acumula predominantemente, si no
exclusivamente, en el compartimento de las esporas (81). La región
promotora de spoVA contiene una secuencia promotora de sG de
consenso (207, 217), que es reconocida por E-sG in vitro (217).
La germinación de esporas de B. subtilis para recuperar el estado
vegetativo puede ser inducida por una variedad de aminoácidos y
azúcares (revisado en la referencia 206). Se han aislado mutaciones
en más de una docena de loci (ger) que alteran las propiedades de
germinación de las células que las portan. Al menos dos de estos loci
ger (gerA y gerD) parecen ser parte del regulón sG (85, 157). Los
genes gerA y gerD han sido clonados, secuenciados y predichos para
codificar proteínas con características que se encuentran en las
proteínas asociadas a la membrana (86, 333). Las regiones promotoras
putativas de ambos operones se asemejan a los promotores de
consenso sG (85, 157). gerA y gerD no se expresan en células
mutantes spoIIIG , se activan en crecimiento vegetativo B. subtilis por el
B. FACTORES SUBTILIS SIGMA 21
inducción de la síntesis de sG , y son transcritas por E-sG in vitro (85,
157).
De sus miembros conocidos, el regulón sG parece codificar
productos que se sintetizan dentro del compartimento de las esporas
durante las últimas etapas de la esporulación para mejorar la
supervivencia de las esporas y facilitar la germinación.
Factor sigma sK
Aislamiento y clonación. sK se detectó y purificó en un estudio in
vitro de la transcripción específica del compartimento utilizando copias
clonadas de genes expresados en células madre (spoIVC y cotD)
como plantillas (165). Se demostró que RNAP parcialmente purificado
a partir de células en esporulación iniciaba la transcripción en los
sitios de inicio in vivo tanto de spoIVC como de cotD (165). La
cromatografía de ADN-celulosa separó las actividades RNAP en
fracciones que tenían preferencia por uno u otro de los dos promotores.
Las proteínas encontradas en estas muestras se separaron mediante
SDS PAGE, se eluyeron del gel y se analizaron en cuanto a su
capacidad para dirigir el RNAP central a cada uno de los dos
promotores. Una sola proteína de 27 kDa presente en ambas
fracciones de pico fue responsable del reconocimiento de los
promotores de spoIVC y cotD ; sin embargo, fue significativamente
más eficaz para dirigir RNAP a cotD que a spoIVC (165). Esta
diferencia en la actividad se produjo incluso si la proteína de 27 kDa
se purificaba a partir de una fracción RNAP que originalmente había
demostrado una preferencia por spoIVC. La base de esta discrepancia
se reveló cuando se demostró que una proteína de 14 kDa encontrada
en la fracción que originalmente prefería la plantilla de spoIVC
estimulaba la transcripción de spoIVC por RNAP más la proteína de
27 kDa (sK) (165). La proteína de 14 kDa resultó ser una proteína de
unión al ADN y el producto del gen spoIIID (167, 281). La secuenciación
amino-terminal de sK reveló que su secuencia de codificación predicha
coincidía con la de uno de los genes (spoIVCB) que se había utilizado
como plantilla para su aislamiento bioquímico (165). spoIVCB es uno
de los dos operones separados, A y B, que forman el locus spoIVC
(169). La secuencia de sK coincidía con la secuencia del producto
spoIVCB pronosticado que comenzaba en el residuo 21. Esto sugería
que sK, como sE, se procesa a partir de un precursor (165). Una
curiosidad adicional asociada con spoIVCB como gen estructural de
sK fue el hecho de que su marco de lectura abierto era inadecuado
para codificar una proteína del tamaño de sK (165). Esta discrepancia
se resolvió cuando se observó (286) que otro locus de esporulación
(spoIIIC), cuyo producto predicho es similar al dominio carboxi terminal
de los factores sigma pero carece de un terminal amino del factor
sigma reconocible (83), estaba cerca de spoIVC. Se propuso que el
gen estructural sK (sigK) podría ser un gen compuesto formado por
spoIVCB y spoIIIC (286). Esta noción fue corroborada por análisis de
transferencia Southern en los que se observó que la región spoIVCB-
spoIIIC del cromosoma B. subtilis se reorganizaba durante la
esporulación, formando un gen sigK compuesto que podía clonarse a
partir del cromosoma de las células en esporulación (286). regulación
sk . La síntesis de sK se controla de manera más compleja que la de
los otros factores sigma de B. subtilis conocidos. Depende de un
reordenamiento específico de la esporulación del cromosoma B.
subtilis para formar el gen estructural sK , una activación transcripcional
altamente regulada para sintetizar su ARNm y una reacción de
procesamiento postraduccional para convertir un pro-sK inactivo en el
factor sigma activo ( 164). Este control multinivel representa un
dispositivo para evitar la expresión inapropiada de sK en condiciones
sin esporulación, una situación que ocurre si la síntesis de sK está
controlada únicamente por la transcripción (221). (i) Formación de
sigK. sigK está formado por un evento de recombinación específico
del sitio que une los genes spoIVCB y spoIIIC previamente
separados en un solo cistrón (286). Como
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22 HALDEN WANG
determinado por análisis de transferencia Southern de células madre
fraccionadas y cromosomas de esporas, el reordenamiento ocurre solo
en el compartimento de la célula madre (286). Es un evento de
recombinación recíproca en el que el ADN intermedio (aproximadamente
42 kb) se elimina del cromosoma como un círculo que puede detectarse
como un elemento extracromosómico en geles (168). La recombinación
se produce en una secuencia de 5 pb que se encuentra tanto en
spoIVCB como en spoIIIC (286). Esta secuencia en spoIVCB está
seguida de cerca por una secuencia de 21 pb que está presente en
forma invertida cadena arriba de la misma secuencia de 5 pb en spoIIIC
(286). La recombinasa responsable de la reacción de recombinación
está codificada por un gen, spoIVCA, que se encuentra dentro del ADN
extirpado y cuya transcripción precede al reordenamiento de sigK (168,
257). El producto predicho de spoIVCA tiene un extremo amino que es
homólogo a las recombinasas de ADN específicas de sitio (257) y se
une in vitro a los sitios de recombinación que interrumpen sigK (236).
El reordenamiento de spoIVCB-spoIIIC no se produce en los mutantes
de spoIVCA , y el requisito de SpoIVCA en la esporulación se puede
omitir si se proporciona a la célula una copia reorganizada de sigK
(168). De acuerdo con la observación de que el evento de recombinación
depende de los productos de los genes spoIIG/ sigE y spoIIID (286), la
transcripción in vitro de spoIVCA ocurre por E-sE y es estimulada por
la proteína SpoIIID purificada (164, 256). Aunque es probable que
SpoIIID afecte la formación de sigK al facilitar la transcripción de la
recombinasa, no se ha descartado un papel directo de SpoIIID en el
reordenamiento de sigK . La dependencia del reordenamiento sigK de
E-sE y SpoIIID asegura que esta reacción estará altamente controlada.
Juntos, estos dos factores de transcripción limitan el reordenamiento
de sigK a la célula madre y posponen su aparición hasta que la
expresión del gen dependiente de sE esté en marcha. (ii) transcripción
sigK . La expresión de sigK , estudiada mediante el uso de una fusión
spoIVCB-lacZ , se activa entre la tercera y la cuarta hora de la
esporulación y requiere los productos de los genes spoIIG (sigE) y
spoIIID (169). Como cabría esperar de un gen dependiente de sE y
SpoIIID, la b-galactosidasa producida por la fusión spoIVCB-lacZ se
enriqueció en fracciones de extracto que contenían componentes de
células madre (169). Además de sigE y spoIIID, la expresión de sigK
también depende, al menos parcialmente, de otros genes spo , incluido
el propio sigK (169). Se anticipó un requisito para que sK lograra la
transcripción máxima de sigK , dado que el promotor spoIVC (sigK) fue
una de las plantillas de ensayo utilizadas para el aislamiento de sK
(165). sigK puede transcribirse, in vitro, mediante E-sE o E-sK (165). In
vivo, la transcripción de sigK depende absolutamente de sigE y
parcialmente de sigK (169). Aunque un requisito para E-sE en la
síntesis de SpoIIID complica la interpretación de esta observación in
vivo, los datos sugieren que en presencia de SpoIIID, sigK se transcribe
inicialmente por E-sE y luego por E-sK (164, 287). (iii) Procesamiento
Pro-sK. El extremo amino de sK se alinea con el gen spoIVCB en el
codón 21 del marco de lectura abierto de spoIVCB (165). Esta
observación implica que sK, como sE, se sintetiza como una proproteína
(pro-sK). Mediante el uso de anticuerpos específicos para pro-sK/sK, la
supuesta pro-sK se detectó en extractos crudos de B. subtilis , donde
su aparición precedió a la de sK en aproximadamente 1 h (es decir, pro-
sK se vio por primera vez a las 3 h en el proceso de esporulación,
mientras que sK no se detectó antes de la cuarta hora) (188). La forma
precursora de sK parece estar inactiva. La expresión de cotD, que
depende de sK para su transcripción, solo comienza aproximadamente
en el momento en que aparece la forma procesada de sK (188).
Además, la síntesis inducida artificialmente de pro-sK en B. subtilis en
crecimiento vegetativo no conduce a la expresión de un gen informador
cotD-lacZ hasta que las células proceden a la esporulación y la pro-sK
acumulada se elimina.
MICROBIOLÓGICO. RVDO.
convertido en sK (188). In vitro, se encontró que sK , pero no pro-sK ,
estimula el RNAP central para transcribir genes dependientes de sK
(188). La observación de que pro-sK se acumula durante la esporulación
y se convierte en sK solo más tarde en el desarrollo sugiere que el
procesamiento de pro-sK es un evento regulado por el desarrollo
distinto de la síntesis de pro-sK (188).
Mediante el uso de un anticuerpo anti-pro-sK/sK como sonda, se
examinaron extractos de cepas mutantes de B. subtilis para determinar
la importancia de varios genes spo en la reacción de procesamiento.
Las mutaciones en ocho loci (spoIIB, spoIID, spoIIIA, spoIIIE , spoIIIG,
spoIVA, spoIVB y spoIVF) permiten la acumulación de pro-sK pero
bloquean o reducen su conversión en sK (188). Los dos loci de la etapa
II que se necesitan para el procesamiento (spoIIB y spoIID) codifican
productos que funcionan relativamente temprano en la esporulación.
Se supone que desempeñan un papel en la modificación del tabique
de la espora como requisito previo para la absorción de la espora (137,
192). Se ha propuesto que el desarrollo morfológico en curso es una
señal reguladora importante para la activación del gen de la espora (51,
79, 125, 186). Si esto es así, entonces la necesidad de estos productos
génicos en el procesamiento pro-sK probablemente refleja el fracaso
de las células que carecen de ellos para alcanzar la etapa de desarrollo
morfológico que activa la maquinaria de procesamiento y no una
indicación de que sus productos están directamente involucrados en la
reacción de procesamiento. Se necesitan tres genes de etapa III
(spoIIIA, IIIE y IIIG) para el procesamiento pro-sK . Se desconoce la
función explícita de spoIIIA . Debido a su dependencia de sE para la
expresión, es probable que spoIIIA sea un operón específico de la
célula madre (138) y, por lo tanto, podría, al menos teóricamente,
participar directamente en el procesamiento de pro-sK. spoIIIE ha sido
mejor caracterizado. Se expresa predominantemente en células en
crecimiento vegetativo (92). spoIIIE puede desempeñar un papel
directo, aunque indefinido, en el procesamiento pro-sK; sin embargo,
como se describió anteriormente, se requiere para la partición
cromosómica en la espora anterior y la expresión de spoIIIG (330). Por
lo tanto, el papel de SpoIIIE en el procesamiento de pro-sK puede ser
indirecto y estar limitado a la expresión de spoIIIG (92). spoIIIG codifica el factor sG espe
La dependencia del procesamiento pro-sK en sG argumenta que se
necesitan uno o más genes dependientes de sG (es decir, expresados
en esporas) para el procesamiento pro-sK, una circunstancia que
podría coordinar la expresión génica tardía entre los dos compartimentos
(51). La identidad de uno de estos genes dependientes de sG se reveló
cuando se clonó y analizó el gen spoIVB esencial para el procesamiento
(49, 309). Desde el momento de la aparición y eliminación de un
producto spoIVB-lacZ , se induce spoIVB en la etapa de desarrollo de
inmersión en el compartimento de esporas delanteras (49). El promotor
principal de spoIVB tiene una secuencia de consenso sG (49, 309). No
se expresa en cepas mutantes spoIIIG/ sigG , y se induce en B. subtilis
en crecimiento vegetativo si se proporciona sG (49). Dado que spoIVB
se transcribe en la preespora por E-sG, se ha propuesto que el producto
de spoIVB , o un evento bajo su control, representa el factor que acopla
el procesamiento de pro-sK a la expresión génica dirigida por sG en la
preespora. (49). Los productos genéticos a través de los cuales podría
ocurrir este acoplamiento hipotético fueron identificados por mutaciones
que liberaron la expresión del gen cotA dependiente de sK de la
expresión del gen dependiente de sG (51). Una de estas mutaciones,
bofB (bypass of forespore), permitió el procesamiento de pro-sK en
cepas mutantes spoIIIE , spoIIIA , spoIIIG y spoIVB y se asignó al locus
spoIVF (51). spoIVF consta de un operón de dos cistrones (spoIVFA y
spoIVFB) bajo el control de sE (52). Las mutaciones bof se encontraron
en el extremo 39 del cistrón spoIVFA. Se demostró que ambos cistrones
spoIVF son necesarios para la formación de esporas a 378C (53). El
producto spoIVFA proximal al promotor es prescindible para la
esporulación a 308C pero su pérdida confiere un fenotipo Bof a esta
temperatura (53). Estos hallazgos sugirieron que
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VOLUMEN 59, 1995
SpoIVFB es una proteína termolábil que instiga el procesamiento pro-sK pero
sus actividades están inhibidas y estabilizadas para
calor por SpoIVFA (53). Un segundo gen dependiente de sE, bofA/
ski-4 (140, 250), también descubierto en el ''bypass de forespore''
búsqueda mutante (51), parece cooperar con SpoIVFA en
inhibiendo la acción de SpoIVFB (250). Los productos génicos
se sabe que influyen en el procesamiento pro-sK se han ensamblado
en un modelo en el que se cree que SpoIVFB promueve pro-sK
procesamiento en respuesta a una señal dependiente de SpoIVB de
la forespora que libera su inhibición por SpoIVFA/BofA
(49, 51). La sobreproducción de pro-sK desacopla a los dependientes de sK.
expresión génica de la dependencia de intercompartimental
comunicación (189). El procesamiento pro-sK desacoplado parece deberse a
un procesamiento independiente de spoIVF de bajo nivel.
reacción que depende de uno o más genes transcritos por sE. Eso
Se desconoce si esta actividad de procesamiento representa una proteasa
adicional o una actividad residual de la pro-sK "normal".
enzima de procesamiento.
Genes transcritos por E-sK. Los genes que dependen de E-sK para
parte o la totalidad de su expresión se expresa en la célula madre
compartimento en tiempos tardíos en la esporulación. Incluyen el
gen regulador gerE (52, 338), genes implicados en la síntesis y acumulación de
DPA (56, 76, 93) y genes para la síntesis
y montaje de la cubierta de esporas (52, 54, 252, 337, 339).
Las mutaciones de gerE dan como resultado esporas que son defectuosas en la
germinación y tienen una composición y estructura de cubierta de proteína aberrantes.
(88, 205). El gen gerE fue clonado (144) y se encontró que codifica
una proteína pequeña (74 aminoácidos) cuya síntesis está activada
después de T3 de esporulación (50). gerE se transcribe in vitro por E-sK
(338). El producto de una fusión gerE-lacZ se acumula en el
compartimento de células madre de células esporulantes que son capaces de
forman una SK activa (52). gerE es una proteína de unión al ADN que
estimula la transcripción de los genes de la cubierta de esporas cotB, cotD,
y cotC e inhiben la transcripción de cotA y sigK in vitro
(338). In vivo, se necesita gerE para la expresión de cotB y
cotC y expresión completa de cotD, mientras que su ausencia da como resultado
sobreexpresión de cotA y el operón (dpa) que codifica DPA
sintetasa (52, 56, 255, 339). GerE se propone como una proteína reguladora
que establece el patrón de transcripción tardía específica de la célula madre
(338, 339).
Seis genes que codifican proteínas de la cubierta de esporas (cotA, -B, -C, -D [65],
-F [54] y -T [7]) han sido identificados y clonados. Estas
Los productos génicos forman la cubierta proteica que se deposita alrededor
la espora en desarrollo por la célula madre para proporcionar la
espora madura con una barrera protectora (232). su expresión
ha sido descrito como una cascada, con una secuencia ordenada
aparición de proteínas tanto estructurales como reguladoras (339).
Al menos varios de estos genes cot dependen de E-sK para su
transcripción, en algunos casos con un nivel adicional de
regulación proporcionada por GerE (7, 255, 338, 339).
Dos loci (spoVK y spoVE) involucrados en la acumulación de DPA
también son transcritas por E-sK (56, 93). spoVK (spoVJ) tiene un
promotor dependiente de sE que es responsable de su expresión inicial pero
que también contiene un promotor dependiente de sK que
asegura su expresión después de T4 (93). El locus spoVE , codificación
dos genes (dpaA y dpaB) que juntos especifican la DPA sintetasa, tiene un
elemento promotor de consenso sK , se activa en
T4, cuando aparece actividad sK , y es silente en mutantes de B. subtilis
que son incapaces de sintetizar sK (56).
Además de activar varios genes de esporulación tardía,
la aparición de E-sK también coincide con una reducción en la
expresión de al menos algunos genes spo anteriores. E-sK ha sido
hipotetizado para desencadenar un ciclo de retroalimentación que disminuye el nivel
de SpoIIID, una proteína reguladora de células madre de la anterior
etapa de esporulación y, por lo tanto, reducir la transcripción dependiente de
ella (111).
B. FACTORES SUBTILIS SIGMA 23
OBSERVACIONES FINALES
Los factores sigma de B. subtilis ilustran la complejidad a ser
se encuentra en la regulación de genes procarióticos. Los genes estructurales
de estas proteínas no sólo se expresan bajo sofisticados
sistemas de control transcripcional; también están presentes capas adicionales
de regulación postraduccional. Particularmente digno de mención es el uso de
secuencias de proproteínas y proteínas anti-factor s para modular la actividad
del factor s. Estos dispositivos presumiblemente
vincular la activación del factor sigma a señales que se unen menos fácilmente a
sistemas convencionales de regulación transcripcional o traslacional. Los
controles postraduccionales sobre la actividad del factor sigma son
más evidente durante la esporulación de B. subtilis , el proceso en
qué factores múltiples se descubrieron por primera vez. En varias etapas
del proceso de formación de esporas, la activación de s preexistentes
Los factores parecen acoplar la inducción del gen spo con el desarrollo
morfológico en curso de la célula, no solo regulando la expresión génica
temporal y específica del compartimento, sino también coordinando la expresión
génica entre la célula madre y la espora.
compartimentos
El uso específico de una secuencia de proproteína o una anti-s
factor como regulador negativo del factor s tiene distintas consecuencias una
vez que se activa el factor sigma. La activación del factor sigma por la
eliminación de la secuencia de proproteína es irreversible, mientras que la
activación por la liberación de una proteína de unión podría,
al menos teóricamente, ser revertida por la reasociación de la s
factor con su regulador. Probablemente no sea una coincidencia que
los dos factores s que están "permanentemente activados" por el
la eliminación de una secuencia pro son sigma específicos de esporulación
factores que son de corta duración (sE) o el factor s terminal (sK)
de un compartimento celular que está destinado a lisar. silenciamiento de
los genes dependientes de estos factores sigma requieren ya sea
degradación del factor s o destrucción de la célula en la que
esta activo Esta falta de flexibilidad puede ser útil para cometer
una célula de diferenciación terminal para proporcionar esporas esenciales
productos frente a señales ambientales cambiantes, pero es
probablemente inadecuado para procesos que deben seguir respondiendo a
cambiar. Por el contrario, se esperaría que los factores anti-s, con su capacidad
para modular reversiblemente la actividad del factor s, tengan
la flexibilidad necesaria para regular los procesos dinámicos. el b
subtilis s factores (sB, sF , y sG) que son inhibidas por anti-s
Los factores se encuentran en las células en crecimiento vegetativo o en la espora.
compartimento, que se regenera para formar una nueva célula vegetativa.
Los factores anti-s pueden resultar ser reguladores comunes de s
actividad de los factores Además de sB, sF, y sG, es posible que
el inhibidor inducido por la esporulación del principal B. subtilis s
el factor (sA) (266) también es una proteína de esta clase. Si sA tiene
un factor anti-s correspondiente, sería un argumento fuerte
para un amplio control de esta especie de regulador en Bacillus
la expresion genica. Dado que también se ha identificado un factor anti-s
observado en Salmonella typhimurium, donde controla un factor sigma de
motilidad (220), no sería sorprendente encontrar que
Los factores anti-s, como los propios factores s múltiples, son omnipresentes
entre los procariotas. Los factores anti-s y sus correspondientes factores anti-
anti-s bien pueden convertirse en el próximo sistema de dos componentes (282)
de regulación génica bacteriana.
EXPRESIONES DE GRATITUD
Agradezco a los muchos colegas que proporcionaron preprints y comentarios.
en el manuscrito y Deborah Yrle por su ayuda en la preparación de
el manuscrito.
El trabajo en mi laboratorio ha sido apoyado principalmente por subvenciones
de la Fundación Nacional de Ciencias y los Institutos Nacionales de
Salud.
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24 HALDEN WANG
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