Utilización de citrato.

Uso y propósito

Esta prueba sirve para determinar si un microorganismo es capaz de utilizar

citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única
fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio.
Entre las enterobacterias estas características se dan en los siguientes géneros:
Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella.
Sin embargo, Escherichia, Shigella, Yersinia, Salmonella typhi y Salmonella
paratyphi son incapaces de crecer utilizando citrato como única fuente de carbono.

Fundamento

En el medio de cultivo, el amonio dihidrogeno fosfato es la única fuente de

nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes
son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un
sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El cloruro de sodio mantiene el
balance osmótico, el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color
azul en medio alcalino y el agar es el agente solidificante. El medio de cultivo es
diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como
única fuente de carbono usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno,
con la consiguiente producción de alcalinidad. El metabolismo del citrato se realiza,
en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del ciclo del ácido
tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato genera progresivamente, oxalacetato y
piruvato. Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos
orgánicos que al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y
bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la
producción de citrato permeasa.

El sulfato de magnesio aporta cofactor magnesio para las diversas reacciones

enzimáticas, en tanto que el fosfato di potásico actúa como agente tamponante.
Los cambios en el pH se verifican gracias al contenido de azul de bromotimol

El cloruro de sodio contribuye al equilibrio osmótico del medio de cultivo. El agar

actúa como agente gelificante.

Composición del medio

Procedimiento relacionado a la siembra e incubación de la prueba

Antes de realizar la siembra, permitir que el medio de cultivo alcance la

temperatura ambiente. Sembrar las muestras mediante estría en la superficie
tendida. Realizar la siembra bajo condiciones asépticas (uso de mechero y
campana de bioseguridad). La utilización del citrato requiere de oxígeno, incube
con la tapa suelta.

Incubar por 24 a 48 horas entre 35º y 37ºC . Algunas cepas pueden requerir mayor
tiempo de incubación.

Interpretación de los resultados

Una vez completado el período de incubación, observar el desarrollo de colonias

en la superficie del agar y el viraje de pH por alcalinización, de verde a azul.

 Resultado positivo: Solamente los microorganismos que pueden utilizar el

citrato como fuente de carbono presentaran desarrollo. El medio de cultivo
cambiará de verde a azul.
 Resultado negativo: no se observará desarrollo ni cambios en el pH.

La evaluación de los resultados es válida solo para las condiciones de tiempo y

temperatura de incubación señaladas. Períodos de incubación prolongados o a
mayores temperaturas pueden alterar la respuesta del medio de cultivo para este
aspecto

Control de calidad

Limitaciones

El metabolismo del citrato es dependiente del aporte de oxigeno, la reacción

positiva será más clara si se cumple esta condición.
El Agar Citrato de Simmons es un medio de cultivo diferencial y de escaso valor
nutritivo, por lo que solo presentarán desarrollo todas las bacterias que posean la
capacidad de utilizar el citrato como única fuente de carbono.

Algunas especies bacterianas pueden requerir un mayor tiempo de incubación

para verificar el desarrollo (hasta cuatro días). Para el estudio de cepas de
Providencia spp. puede ser necesario incubar hasta siete días.

Los resultados obtenidos deben complementarse con otras pruebas bioquímicas

para obtener la identificación de especie bacteriana.

Indicar que parte del metabolismo bacteriano se esta evidenciando con la

prueba cuando aplique

El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato

permeasa, a través del ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato
genera progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este último, en presencia de un
medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que al ser utilizados como fuente de
carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al
azul y esto es indicativo de la producción de citrato permeasa.