Bioprospección en el río hirviente en busca de bacterias con actividad

degradadora de lípidos para la futura producción de biodiesel

1. Integrantes del proyecto

- Calvimontes Eguiluz, Daniella

- Escudero Sánchez, Carlos
- Huaytalla Ramírez, Milagros
- Mallqui Argüelles, Nathalie

2. Resumen del proyecto

Bioprospección de bacterias (muestreo, siembra, tamizado y aislamiento) en el río

Shanay-timpishka o Río Hirviente, ubicado en el Amazonas, que contengan actividad
degradadora de lípidos para una futura producción de biodiesel o biocombustible a
nivel industrial.

3. Palabras clave

Bioprospección, Perú, Río Hirviente, Shanay-timpishka, Bacterias, Degradación,

Lípidos, Producción de biodiesel, Industria.

4. Antecedentes y Estado del Arte

La producción tradicional de biodiésel consiste en una reacción de transesterificación

de aceites vegetales u otras materias primas como grasa animal o aceite utilizado.
Éste requiere de solventes como metanol o etanol. Esta reacción forma biodiésel
constituido por una mezcla de ácidos grasos metil éster o ácidos grasos etil éster.

Sin embargo, como producto secundario se genera glicerina. Un subproducto que

debe ser lavado y purificado previamente a la venta del biocombustible, generando
procesos y gastos adicionales en la industria del biodiésel. Además, ese tipo de
reacción se lleva a cabo en medios ácidos o básicos fuertes (Verdugo, 2011).
Generando un proceso adicional para la eliminación de las impurezas de los
reactivos.

Debido a las complicaciones en la industria de producción de biodiésel explicadas

anteriormente, actualmente se investigan lipasas de diferentes microorganismos
para integrarlas a los procesos mencionados. Entre las ventajas de utilizar lipasas se
encuentra: (a) no se utilizan solventes adicionales, (b) las condiciones pueden variar
de acuerdo a la enzima y (c) simplificación de la separación de fases (Verdugo,
2011).

Un grupo de lipasas integran la glicerina -resultante de la esterificación- en un

derivado soluble en los ácidos grasos metil éster o ácidos grasos etil éster -
compuestos que forman el biodiésel- (Verdugo, 2011). Esta mezcla puede sustituir el
biodiésel como biocombustible debido a que tiene las mismas características físico-
químicos muy similares al biodiésel puro.

Una limitación de utilizar enzimas en procesos industriales es que estas pueden ser
degradadas cuando hay cambios en el pH o se pueden inhibir por solventes
orgánicos (Sahoo et al, 2016). Para sobrepasar esta limitación, se pueden buscar
enzimas más resistentes a condiciones extremas o utilizar diferentes métodos para
incrementar el rendimiento de la reacción.

Artículos científicos indican que las fuentes termales son una interesante fuente de
microorganismos con enzimas con tolerancia a condiciones duras como diferentes
solventes, pH, temperatura o iones metálicos (Sahoo et al, 2016) que pueden ser
utilizadas para la producción de biodiésel.

En el Perú, se encuentra el río , por el único río hirviente del Amazonas con
características únicas, debido a sus condiciones cambiantes, su perfil geoquímico y
su composición mineral. Los microorganismos que sobreviven en estas condiciones
son los extremófilos con enzimas resistentes a diferentes condiciones. El río
hirviente comparte características con las fuentes termales respecto a las aguas de
alta temperatura, es por esto que se puede extrapolar encontrar microorganismos
similares en estos dos tipos de ecosistemas.

Estudios en las aguas termales de Yellowstone, USA, encontraron microorganismos

con actividad lipasa a diferentes estratos de temperatura: Thermosyntropha lipolytica
(96ºC) y Bacillus termoleovorans (70-75 ºC) que son utilizadas en diversas
aplicaciones biotecnológicas como la síntesis de polímeros, producción de biodiésel
y producción de agroquímicos como herbicidas (Debnath et al, 2019).
 En Taptapani Hot Spring, India, Shaoo et al (2016), se realizó un estudio de
bioprospección en las fuentes termales en búsqueda de una lipasa para la
producción de bio dice. El grupo de investigación encontró la lipasa RK-lip479 amplio
con un amplio rango de especificidad de sustrato y gran estabilidad a diferentes
rangos de temperatura y pH. Se registró una alta conversión de biodiésel por
transesterificación con restos de aceites vegetales. Sin embargo, esta enzima si
produce glicerol, por lo que el rendimiento de la reacción disminuyó cuando la
cantidad de glicerol alcanzaba el 15%.

5. Justificación

El presente proyecto se sustenta en el evidente potencial que tienen las enzimas

sintetizadas por los organismos que habitan el río hirviente. A nivel industrial, dichas
macromoléculas son de alto interés debido a que pueden trabajar bajo condiciones
que otras simplemente no podrían. Existen múltiples ejemplos de investigaciones
previas que solidifican esta idea, haciendo su aplicación dentro de nuestro territorio
una actividad de primera importancia para la investigación en bioprospección para la
fecha actual y venidera. En vista a estos puntos, consideramos lógicos los
fundamentos de nuestros proyectos, haciéndolo una propuesta acertada dentro del
marco de la investigación en el país.

6. Problema Identificado

La producción de biodiésel actual tiene diversos campos de mejora, tanto en los

solventes utilizados, la gran cantidad de agua requerida, la producción de glicerina y
la separación de los subproductos. Este proceso se vuelve más eficiente al utilizar
una enzima lipasa que integre la glicerina en un derivado. En este aspecto, las
enzimas provenientes de fuentes hidrotermales muestran propiedades que
resuelven muchos de estos aspectos. Se debe incentivar la investigación en este
campo, tanto para obtener enzimas de alto valor para la producción de biodiesel,
como para el futuro de la bioprospección en el Perú.

7. Hipótesis / Supuestos

Se identificarán bacterias que habitan en el río Shanay-timpishka, que sintetizan

enzimas que realicen la reacción de esterificación que integre la glicerina en un
derivado, para que esta pueda ser utilizada en la producción de biodiesel. Las
enzimas presentan características que incrementan su valor en el mercado, las
cuales se originan por las adaptaciones a ambientes extremos de este entorno.
8. Objetivo General

Identificar mediante bioprospección cepas bacterianas en el río Shanay-timpishka

que sinteticen lipasas que puedan ser utilizadas en la industria del biodiesel.
Recuperar dichas enzimas y sustentar su utilidad en la producción de biodiesel.

9. Objetivos Específicos

a) Identificar las bacterias con actividad lipasa en el río hirviente del Amazonas.
b) Cuantificar la actividad de la enzima y seleccionar la cepa que muestre mayor
eficiencia.
c) Reconocer el potencial de la enzima en el proceso de producción biodiesel.

10. Metodología de Investigación

❖ Búsqueda de organismos lipolíticos:

- Muestreo:

Es la primera etapa de la investigación y consiste en sacar muestras de

sedimento cercanas al Río Hirviente. Cada muestra se tomará por triplicado y
se medirá la temperatura y el pH en cada uno de los casos. Los valores de
pH estudiados para la producción de lipasas por fermentación en estado
sólido, se encuentran reportados en amplios rangos que varían del neutro a
ácido. Sin embargo, los mejores resultados reportados de esta actividad se
registran en un valor de pH neutro.

Niveles de pH por encima del neutro 7.0, pueden disminuir la actividad lipolítica
debido a que en un medio alcalino en conjunto con las proteasas producen
inestabilidad de la enzima. De manera contraria, la disminución de este
parámetro provoca una inhibición del crecimiento fúngico, lo que sería de
gran ayuda para limitar el crecimiento netamente bacteriano.

- Siembra:

Luego de tener nuestras muestras de suelo, estas se pueden resuspender con

agua destilada para proceder a realizar diluciones sucesivas y así obtener el
 número de colonias de los microorganismos que puedan crecer en el medio,
si es que lo hubieran. Cabe destacar que siempre se tiene que tener el
cuenta el valor del pH de cada una de las muestras para evitar resultados
alterados.

- Tamizado:

El objetivo de esta etapa de la investigación es aislar bacterias con actividad

lipolítica, para ello el primer cultivo está compuesto de medio nutritivo, agar
bacteriológico. Así mismo, mantener condiciones de alcalinidad y
temperatura entre rangos de 30° a 40°C.

Un segundo medio de cultivo con los resultados del primero, tomar una muestra
y sembrar en medio selectivo suplementado con Tributirina (10 %
p/v)/Rodamina B e incubados por 24 h. La rodamina se usa como tinción
fluorescente, identificando bacterias ácido resistentes. Además, este
compuesto promueve la identificación de la formación del halo, pues
fluorescen bajo luz UV. Durante la hidrólisis de los triglicéridos, los ácidos grasos
forman un complejo con la Rodamina B, que al ser expuesto a luz UV se aprecia
la pérdida de fluorescencia, identificando una colonia lipolítica.

Tabla 1.- Diseño y formulación del medio de cultivo del tamizado

Fuente de carbono Tributirina

Fuente de aminoácidos Caseína

Sales NH4NO3, K2HPO4, MgSO4

Agar ?

Agua destilada ?

Fungicida clorpromacina, ketoconazol o

cicloheximida

- Aislamiento:

Una vez identificada la colonia de interés, se toma una parte de ella para
sembrar en cuñas con Agar dextrosa . Para el reconocimiento morfológico,
 con la técnica del squash, llevado al microscopio se logró reconocer y
comparar la colonia.

❖ Preparación de fermentador en sustrato sólido

- Formulación del sustrato:

La fuente proteica es suministrada por salvado de trigo , la fuente de nitrógeno

es a partir de torta oleaginosa de soya y caña de azúcar como bagazo. Estos
compuestos sólidos servirán de base para el crecimiento de
microorganismos. Después de la esterilización de los compuestos, se enrasa
con agua de caño hervida.

- Extracción de la enzima:

Se realiza con 10 mL/g de tampón Tris- HCl (100 mM y pH 8) agregado al

sistema, centrifugar a 100 rpm por 15 minuto, adicionando surfactantes para
alterar la permeabilidad celular aumentando la secreción de la proteína.

- Determinación de actividad enzimática:

Para determinar la actividad de la lipasa se utilizó p-nitrofenol, el sustrato lipídico

serán ácidos grasos de distinta longitud unidos mediante enlace éster al p-
nitrofenol. Se puede cuantificar por su propiedad óptica, en medio ácido es
incolora, sin embargo a pH básico cambia la coloración a amarillo intenso,
así el pico de absorción es de 400 nm.

Cuando la enzima hidroliza el sustrato libera moléculas de p-nitrofenol cuya

concentración se puede medir espectrofotométricamente, aumentando el pH
de la mezcla de reacción, y la variación de absorbancia a lo largo del tiempo
puede relacionarse con la tasa de conversión de sustrato por las enzimas
mediante la Ley de Lambert-Beer.

- Cuantificación de Proteínas:

Para el ensayo de Bradford se utiliza el colorante Azul de Coomassie, en

condiciones ácidas es de color rojo, y que se une a los aminoácidos básicos
 y aromáticos de las proteínas formando un complejo de color azul, cuya
absorbancia puede ser medida a 595 nm y es una medida de la
concentración proteica.

11. Resultados Esperados

Una vez realizada la metodología, el resultado principal que se busca es la

obtención de enzimas lipasas de alto valor industrial para la producción de biodiesel.
Al mismo tiempo que se incrementa el número de investigaciones efectivas dentro
del río hirviente.

Dentro de la perspectiva objetiva, en referencia a la actividad de nuestra enzimas, se

espera en primer lugar, medir un incremento considerable en la producción de
biodiesel al incrementar la concentración de lipasa en el medio reactivo. Anteriores
investigaciones en ambientes similares, han tenido resultados muy favorables, en los
que la cantidad de biodiesel resultante llega a tener un incremento del 80% (Sahoo,
R. K. et al. 2016).

Por otro lado, esperamos poder medir algunas propiedades especiales de las
enzimas lipasas provenientes de fuentes de agua hidrotermales. Entre estas, se
puede mencionar la resistencia a condiciones extremas. Se ha observado que las
lipasas obtenidas de estos ambientes extremos son capaces de tolerar altos valores
de temperaturas y pH (Sahoo, R. K. et al. 2016).

Además, no muestran inhibición a altas concentraciones de solventes orgánicos,

como el mismo glicerol (Sahoo, R. K. et al. 2016). Este al ser un subproducto, suele
tener un efecto negativo en una gran cantidad de enzimas lipasas. Al medir su
actividad, se espera que se desempeñe de manera eficiente bajo estos parámetros.

Agregando valor a lo anterior, se espera que nuestra lipasa tenga la capacidad de

metabolizar una gran variedad de sustratos dentro de la producción de biodiesel.
Dicha característica ha sido medida en trabajos previos, donde se observa que
actividad relativa lipasa es cercana al 100% cuando se utilizan aceites de diversas
fuentes vegetales (Sahoo, R. K. et al. 2016).

Dicha actividad puede medirse en función a la actividad lipasa contra el aceite de

oliva, que suele utilizarse como estándar para estos ensayos. Se espera que trabaje
 correctamente con diversos residuos en forma de aceites, para así aprovechar estos
desechos.

Ahora, una vez medidos los parámetros pertinentes, puede pasarse a un proceso de
mejoramiento de la eficiencia de nuestras enzimas. Para esto, uno de los métodos
más utilizados es la inmovilización, ya sea celular o enzimática. Debido a que una
gran cantidad de especies productoras de lipasas en fuentes hidrotermales son no
cultivables, se optaría por utilizar técnicas metagenómicas para la selección de las
enzimas, que luego serían inmovilizadas. Una vez purificadas, luego de ser
sintetizadas por un correcto sistema vector hospedero, las enzimas inmovilizadas
podrán recuperarse luego de un paso de producción, para ser utilizados en uno
siguiente sin tener que comenzar desde cero (Amini, Z. et al. 2017).

Dentro de este ámbito, existen numerosas innovaciones para mejorar las técnicas de
inmovilización de enzimas lipasas, entre otras. Una de estas técnicas consiste en el
uso de matrices magnéticos, conocidos como Magnetic smart polymers, los cuales
potencian la actividad lipasa en medios extremos al poder realizar cambios
reversibles en su estructura luego de experimentar condiciones de pH y temperatura
extremos, que son las condiciones a las que trabajará nuestra enzima. Esta y otras
técnicas pertenecen a los métodos modernos de inmovilización y pueden tomarse en
cuenta para obtener mejores resultados (Quayson, E. et al. 2020).

12. Impactos Esperados

El principal impacto esperado será el incremento en las investigaciones dentro del

río hirviente, lo que resultará por elevar la cantidad de presupuesto invertido en las
actividades de bioprospección futuras. A nivel social, se busca aportar a los múltiples
estudios, lo cual se espera que consolide la línea de investigación, al resaltar el gran
potencial de esta. A su vez, se fomenta el trabajo conjunto de entidades, para
fortalecer el camino de investigaciones futuras. Al mismo tiempo que se guarda
relación con las empresas de interés en el mercado de los productos en cuestión.

Para lograr dicho impacto, el proyecto presente debe demostrar a las asociaciones
participantes que el trabajo ha sido realizado con éxito y que los resultados
esperados han sido alcanzados de manera satisfactoria. El vínculo con las
asociaciones y entidades será de vital importancia para la continuidad esperada de
los proyectos relacionados a la bioprospección en el río hirviente.
 El potencial que guarda el río hirviente para los proyectos de bioprospección es
proporcional al incremento de la eficiencia y competencia a nivel industrial para los
procesos en los que un catalizador enzimático puede significar la diferencia entre
una producción eficiente y sostenible, con una obsoleta para la competencia actual.
En tal motivo, esperamos impactar en el futuro de la investigación, aportando a esta
nuestra experiencia y éxito.

13. Riesgos

a. Que nuestra enzima no sea significativamente superior a la competencia

b. Que la especie productora sea no cultivable. Para solucionar esto, se buscaría
métodos para aislar la enzima o clonarla en otra especie cultivable para la
producción.
c. Que nos ganen la patente. Para evitar este riesgo, el grupo de investigación
tendrá esta actividad como una de las prioridades luego de identificar la enzima
deseada.

14. Referencias

Amini, Z., Ilham, Z., Ong, H. C., Mazaheri, H., & Chen, W.-H. (2017). State of the
art and prospective of lipase-catalyzed transesterification reaction for biodiesel
production. Energy Conversion and Management, 141, 339–353.
doi:10.1016/j.enconman.2016.09.049

Cifuentes, Victor & Lazo, Waldo. (2019). Acción antifúngica de clorpromacina,

ketoconazol y cicloheximida sobre dos cepas de pycnoporus cinnabarinus (Jacq.
Ex fr.) Karst.. Boletín Micológico. 5. 10.22370/bolmicol.1990.5.1-2.1589.

Debnath, T.; Archana, R.; Mitra, R.; Das, S. (2019). Microbial Diversity in
Ecosystem Sustainability and Biotechnological Applications.
https://doi.org/10.1007/978-981-13-8315-1_6

Quayson, E., Amoah, J., Hama, S., Kondo, A., & Ogino, C. (2020). Immobilized
lipases for biodiesel production: Current and future greening opportunities.
Renewable and Sustainable Energy Reviews, 134, 110355.
doi:10.1016/j.rser.2020.110355

Sahoo, R. K., Kumar, M., Sukla, L. B., & Subudhi, E. (2016). Bioprospecting hot
spring metagenome: lipase for the production of biodiesel. Environmental
Science and Pollution Research, 24(4), 3802–3809. doi:10.1007/s11356-016-
8118-7
Verdugo, C. (2011). Utilización de lipasas en la producción de un nuevo tipo de
biodiésel que evita la generación de glicerol. Tesis doctoral. Universidad de
Córdoba, Argentina.