Pruebas biológicas empleadas en la detección de mastitis

Presentado por: Nicolás Chaico Quichua

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Prueba de California CMT para mastitis
La prueba de California para el diagnóstico subclínico de la mastitis ha sido ampliamente
utilizada para el desarrollo de programas de medicina veterinaria preventiva
relacionados con lo que se reconoce como la enfermedad más común y la que más
pérdidas económicas genera a la ganadería lechera (Escobar y Ponce, 2001). Es un
método indirecto que permite estimar la cantidad de ácido desoxirribonucleico (ADN) de
las células nucleadas en la leche. Se considera un método fiable para determinar la
mastitis subclínica de una forma rápida durante el ordeño (Ruegg, 2003)
La mastitis es una enfermedad propia de las hembras en lactación, por lo que la prueba
ha sido utilizada para el diagnóstico de mastitis en, ovinos, caprinos, llamas y camellos,
en estas últimas se utilizado junto con conteo de células somáticas, donde los resultados
muestran un valor similar entre ambas pruebas (p<0.05), para predecir el estado que
gurda la infección de la ubre (Abdurahman, 1996). Además, se menciona que los
resultados son semejantes en trabajos realizados en otras especies.
La prueba de California de mastitis conocida como California Mastitis Test (CMT) es, de
acuerdo con Mellenberg (2001), un examen sencillo que con exactitud predice el conteo
de células somáticas ya sea, a partir de cada cuarto o en muestras de leche. Esta prueba
tiene una alta correlación con CS de la ubre, siendo un excelente indicador de los
cuartos sospechosos de la ubre en las vacas con descargas celulares (Divers y Peek,
2008). La exactitud del CMT se fundamenta en tres principios:
1. El número de leucocitos (células blancas) incrementa enormemente en número
cuando una lesión o una infección afectan el tejido mamario.
2. Los leucocitos, especialmente los polimorfonucleares tienen un núcleo extenso con
material nuclear (ADN) comparadas con otras células o bacterias de la leche.
3. Las paredes de los leucocitos son principalmente lípidos (grasa).

¿Cómo es que funciona el reactivo CMT?

La prueba consiste en el agregado de un detergente a la leche, el Alquilauril Sulfonato
de Sodio, causando la liberación del ADN de los leucocitos presentes en la ubre y este
se convierte en combinación con agentes proteicos de la leche en una gelatina. A mayor
presencia de células se libera una mayor concentración de ADN, por lo tanto, mayor
será la formación de la gelatina, traduciéndose en nuestra lectura e interpretación del
resultado como el grado más elevado de inflamación. Es decir, permite determinar la
respuesta inflamatoria con base en la viscosidad del gel que se forma al mezclar el
reactivo (púrpura de bromocresol 5',5-Dibromo-o-Cresolsulfonftaleína – C21H16Br2O5S) con
la misma cantidad de leche en una paleta con cuatro pozos independientes permitiendo
evaluar cada cuarto independientemente (Smith 1990; Saran y Chaffer, 2000; Medina y
Montaldo, 2003 Citados por Bedolla et al., 2007). La Prueba de California es un método
de diagnóstico que posee una sensibilidad del 97% y una especificidad del 93%. Cuando
la glándula está inflamada por un proceso infeccioso, junto con la leche se eliminan
cantidad de células, sobre todo neutrófilos, que son las responsables de proteger al
órgano de las bacterias. Cuantas más células haya, mayor infección se ha de esperar
que tenga la glándula.

Clasificación del resultado de CMT de acuerdo al resultado del conteo de células

somáticas de acuerdo con Mellenberg (2001).
Las lecturas de 1, 2 y 3 son positivos sin duda; una lectura Traza, indica una posible
infección. Cuando los cuatro cuartos indican trazas no es signo de infección, sin
embargo, si dos cuartos tienen indicativo de traza la infección es posible, una lectura
negativa indica no infección.
Para valoración de la prueba CMT se siguieron los criterios propuestos por Ávila, (1994),
para la interpretación de la misma en vacas del SBDP; donde se consideraron negativas
las muestras que presentaron una reacción sin evidencias o precipitación; trazas a las
que solo reaccionaron de una manera leve. Positiva 1, cuando no existió la formación
de gel, y si una muestra espesa; positiva 2, aquellas muestras que presentaron una
reacción espesa, más cierta formación de gel leve y positiva 3, cuando la reacción causa
la formación de gel y esta muestra una forma convexa.
Preparación del reactivo colorante
Reactivo Purpura de Bromocresol en polvo (Amarillo – Purpura) ; Indicador pH 5.2 – 6.8.
(C₂₁H₁₆Br₂O₅S; Nº CAS: 115-40-2)
Solución Madre: Pesar 1.5 gr de Purpura de Bromocresol y diluir en 100 ml de agua
destilada (solución1.5% P/V).
Solución de trabajo: Guardar en un envase ambar, en un sitio fresco a temperatura
ambiente
Preparación del reactivo CMT
Ingredientes necesarios para preparar un litro (1000 ml) de reactivo de CMT
1. Agua purificada 750 ml.
2. Jabón lavatrastes 250ml (sin aditivos).
3. Solución de trabajo del reactivo púrpura de Bromo Cresol 4 ml (0.4 % V/V).
4. Mezclar suavemente y guardar en un recipiente plástico que sea útil para emplearse
durante la prueba y mantener en un lugar fresco.
5. Para la prueba, coloque preferentemente en una paleta de cuatro pozos, en volumen
igual (1:1) de Reactivo CMT y de leche problema de la glándula correspondiente, mezcle
suavemente en forma circular y espere al menos 20 segundos para su interpretación.
Observaciones: Puede realizar la interpretación de acuerdo al criterio establecido en la
tabla siguiente, que muestra la relación entre el resultado de CMT y Recuento de Células
Somáticas (RCS).

Las dos tablas reflejan la opinión de cada autor siendo el primero de Mellenberg (2001)
y esta ultima de laboratorios cuya investigación definen esas cifras.

Prueba de Wisconsin para Mastitis (WMT)

La Prueba de Wisconsin para Mastitis (WMT), es principalmente una prueba de
laboratorio y es utilizada para estimar el contenido de células somáticas de muestras de
leche fresca mezclada o leche de tanques de enfriamiento, así como para muestreo de
vacas individuales. El resultado positivo del WMT se obtiene debido a la ruptura de la
pared celular y liberación del ácido nucleicos (DNA), por acción del detergente aniónico
en el reactivo, que contiene además un componente colorante (púrpura de
bromocresol), que tiene un color violeta que detecta cambios en el pH (ácidos o
alcalinos), por lo que esta prueba es muy similar al CMT, sin embargo, esta reacción no
es estimada sino medida cuantitativamente dependiendo de la viscosidad,
incrementando de esta forma la objetividad y se pueden determinar medidas más
precisas de la irritación presente en la ubre.
La técnica consiste en utilizar un tubo graduado en milímetros en donde se depositan 2
ml de leche y una mezcla de 2 ml de reactivo para CMT con agua destilada (1:1) ambas
a temperatura ambiente. Enseguida se agita durante 10 segundos, horizontalmente y
de izquierda a derecha. Se deja reposar 10 segundos y posteriormente se invierten los
tubos durante otros 10 segundos.
Una vez transcurrido el tiempo, se procede a realizar la lectura en el tubo por debajo de
la espuma que se forma. Los resultados se relacionan con la escala graduada en
mililitros del tubo y su valor de células somáticas, empleando para su interpretación una
tabla específica para la prueba (Fernández, 1997).
Se interpreta de acuerdo a la siguiente tabla:
MililitrosCélulas (X 10000)/ml 0 - 1.0 0 - 100 1.1 - 1.5 101 - 500 1.6 - 2.0 501 - 1000 2.1
- 2.5 1001 - 1700 2.6 - 3.0 1701 - 2500 > 3 > 2500
  Conteos celulares de 100 X 1000 células/ml se consideran valores normales,
valores de 500 a 1000 sospechosas y más de un millón de células se considera
mastitis subclínica.
 Los rebaños con una puntuación baja entre 3 y 12 están en condiciones buenas
a regular, mientras que los rebaños con puntuaciones superiores a 12 requieren
de atención inmediata (Carrión, 2001).

Procedimiento Wisconsin WMT para el diagnóstico de la mastitis subclínica

Procedimiento de siembra, incubación e identificación.

Interpretación para prueba de Wisconsin

Wisconsin Conteo Celular Pérdida de

(milímetros) Somático producción
3 140,000
4 165,000 5%
5 195,000
6 225,000
7 260,000
8 300,000 8%
9 340,000
10 380,000
11 420,000
12 465,000
13 515,000
14 565,000
15 620,000
 16 675,000
17 730,000 9-18%
18 790,000
19 855,000
20 920,000
21 990,000
22 1,055,000
23 1,130,000
24 1,200,000
25 1,200,000
26 1,360,000
27 1,440,000
28 1,525,000
29 1,610,000
30 1,700,000
31 1,800,000 19-25%
32 1,920,000
33 2,030,000
34 2,180,000
35 2,280,000
Fuente: Philpot y Nickerson, 1992.
Monitoreo del conteo de células somáticas
La leche de una ubre sana presenta pocas células somáticas. En este caso se trata de
células de tejido (células epiteliales) y células inmunes (neutrófilos polimorfonucleares,
granulocitos, macrófagos, linfocitos). El porcentaje de los diferentes tipos de células
somáticas en la leche de las glándulas mamarias sanas es como sigue: a) macrófagos
(60 %); b) linfocitos (25 %); y c) neutrófilos o leucocitos polimorfonucleares (15 %)
(Philpot, 2001; Wolter et al., 2004; Bedolla, 2004b).
De todas las células de la leche de un cuarto infectado, aproximadamente el 99 % serán
leucocitos, mientras que el resto 1% serán células secretoras que se originan de los
tejidos de la ubre. Juntos esos dos tipos de células constituyen la cuenta de células
somáticas (CCS) de la leche que comúnmente es expresada en mililitros (ml) (Philpot,
2001; Bedolla, 2004b).
Las glándulas mamarias que nunca se han infectado normalmente tienen CCS de
20,000 a 50,000/ml. En grandes poblaciones de vacas, 80 % de los animales no
infectados tendrán un CCS menor de 200,000/ml y 50% menor de 100,000/ml. Una
razón de las cuentas ligeramente elevadas en animales no infectados es que algunos
cuartos tuvieron una infección previa de la cual no se han recuperado totalmente
(Philpot, 2001; Bedolla, 2004b; Pérez et al., 2005).
Según Philpot, (2001) datos obtenidos de numerosos estudios, señalan que la mayoría
de las vacas con una CCS menor de 200,000/ml probablemente no están infectadas, y
que la mayoría de esas vacas con cuentas mayores de 300,000/ml probablemente están
infectadas. Mientras que aquellas con una CCS entre 200,000 y 300,000/ml son difíciles
de interpretar (Fernández, 1997).
En base a lo anteriormente expuesto, cabe señalar que el registro ordenado de los
resultados de las pruebas de monitoreo mensual de vacas individuales nos va a
proporcionar información muy útil para el manejo del hato, para el ganadero, y el
veterinario. Aunque estas pruebas de monitoreo no diagnostican la causa o tipo de
infección o si hay una lesión presente, si alertan al ganadero y al veterinario de que un
problema se está desarrollando, por lo que se debe poner mucha atención al respecto
(Fernández, 1997; Bedolla, 2004b; Pérez et al., 2005).
Los resultados del WMT son reportados en (mm), pero pueden ser utilizados para
predecir el promedio de células somáticas presentes en la leche.
Las muestras con puntuaciones altas en esta prueba (más de 19 mm), están sujetas a
ser sometidas a una prueba más crítica y segura. El WMT indica aquellos hatos que
necesitan un escrutinio más profundo. Esta prueba puede ser realizada en muestras
individuales de vacas, donde provee una información más segura y objetiva que el
California Mastitis Test (CMT), además de dar una indicación más exacta del deterioro
de la salud de la glándula mamaria.
El WMT provee de un método conveniente de monitoreo de la salud de la ubre sobre la
base del hato. Debido a que el WMT es una prueba más precisa, pueden ser observados
cambios más pequeños en la salud de la ubre. La meta para cada hato debe ser la de
mantener las lecturas del WMT en el tanque de volumen menores a 8 mm. En leche con
puntuaciones de WMT de 19 mm o mayores, generalmente es considerada inaceptable
para el consumo humano
Comparación de los resultados WMT Con el Conteo de Células Somáticas
WMT CCS Estado del Hato
6 ó menor debajo de 225,000 Excelente: Mantener medidas
de control
8-12 300,000 - 465,000 Regular: Busque casos e
introduzca medidas de control
14-16 565,000 - 675,000 Insatisfactorio: La mastitis
puede estar diseminada en el
hato
18-20 790,000 - 920,000 Pobre: Alto nivel de Infección
del hato. Pérdidas
económicas elevadas
debidas a Mastitis.
22 - mayor 1 millón o más Muy pobre: Requiere acción
inmediata para obtener
resultados individuales.
Desecho o eliminación de
vacas problema.

Ventajas
Las ventajas de esta técnica de diagnóstico es que es cuantitativa y pueden detectarse
animales sanos, sospechosos y enfermos. El material requerido es de fácil adquisición
e inclusive la gradilla puede realizarse manualmente. La prueba se puede realizar en
establos con gran cantidad de animales o de pequeños productores.
Bibliografía

https://www.uv.mx/veracruz/cienciaanimal/files/2013/11/Taller-para-la-produccion-del-
reactivo-de-California.pdf p 1- 2
https://repositorio.unisucre.edu.co/bitstream/001/461/2/636.089649E74.pdf p 42
https://www.uv.mx/veracruz/fmvz/files/2019/06/MastitisXVI104.pdf p20
https://citarea.cita-aragon.es/citarea/bitstream/10532/3829/1/VAC0028.pdf p 758
https://www.produccion-
animal.com.ar/sanidad_intoxicaciones_metabolicos/infecciosas/bovinos_leche/12-
mastitis.pdf p 9,10,11,12
http://www.ugrj.org.mx/index2.php?option=com_content&do_pdf=1&id=534 Autor de
este artículo: QFB Laura Hernández Andrade
http://www.repositorio.usac.edu.gt/5516/1/Tesis%20Med.%20Vet.%20Edgar%20E%20
Palma%20Sandoval.pdf p 16