Licenciatura en ciencia y tecnología de los alimentos

Microbiología General

Docentes: Lic. Martín Landriel

Lic. M. Eugenia Vignolo

Lic. M. Soledad Sarniguet

MICROSCOPIA
La microscopía es el conjunto de métodos que se utilizan para poder visualizar objetos muy
pequeños que están fuera del alcance de resolución del ojo humano. El microscopio es un
instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto pequeño. Mediante un sistema de
lentes y fuentes de iluminación se puede hacer visible un objeto microscópico.
Para el examen microscópico de los microorganismos se puede utilizar el microscopio óptico o
el microscopio electrónico. En general, el microscopio óptico se usa para observar células
intactas, mientras que el electrónico se usa para observar estructuras internas o detalles de las
superficies celulares.
En el microscopio óptico el aumento del objeto se consigue usando un sistema de lentes que
manipula el paso de los rayos de luz entre el objeto y los ojos. El microscopio electrónico utiliza
un rayo de electrones controlado por un campo magnético. Además del aumento es importante
la resolución, propiedad que permite observar dos puntos adyacentes como puntos separados.
Se utilizan varios tipos de microscopios ópticos: de campo claro, contraste de fases, campo
oscuro, y fluorescencia.

La mayoría de los microscopios están constituidos por tres componentes fundamentales: óptica,
mecánica y el sistema de iluminación:

PARTE MECÁNICA
1. Base: sirve de soporte al microscopio y suele tener el peso suficiente para darle estabilidad
2. Brazo: continuación de la base o pie que permite movilizar al microscopio con la mano.
3. Platina: sostiene las preparaciones con la muestra colocadas sobre una perforación central
que deja pasar la luz que viene del condensador.
4. Revolver: permite colocar en posición de trabajo, alternativamente, los objetivos que posee
el microscopio.
5. Tornillo macrométrico: mueve la platina o el tubo hacia arriba o hacia abajo, acercando o
alejando rápidamente el objetivo a la distancia de trabajo aproximada con respecto a la muestra.
6. Tornillo micrométrico: permite mover lentamente y con precisión el tubo hacia la platina o
viceversa

PARTE ÓPTICA
7. Oculares: compuestos por lentes que multiplican el aumento del objetivo. Un buen ocular
(10x) puede permitir un aumento total de 1000x.
8. Objetivos: compuesto por lentes de diferente aumento. Normalmente un microscopio de luz
dispone de tres lentes objetivo: 10X, 40X y 100X, independientes e intercambiables. Cada uno
de ellos tiene un aumento dado, y su propósito es magnificar el objeto para producir una imagen
real que se proyecta hasta el plano focal del ocular. Esta imagen, a su vez, es magnificada por el
ocular para producir la imagen, que es vista por el ojo del observador. El objetivo de 10X es el
más corto de los tres, le sigue el de longitud intermedia con un aumento de 40-45X. El más largo
de todos es el objetivo de inmersión que tiene un aumento de 100X.

SISTEMA DE ILUMINACIÓN
9. Fuente de luz: puede utilizarse luz artificial de una lámpara externa o una que se inserta en
la base del microscopio. Cuando se utiliza la lámpara externa se requiere de un espejo.
10. Espejo: lo requieren los microscopios que trabajan con lámparas externas y permite reflejar
hacia arriba la luz que debe pasar a través del diafragma, la platina, la preparación y el sistema
óptico.
11. Condensador: concentra el haz luminoso en la preparación.
12. Diafragma: regula la cantidad de luz que pasará a través de la preparación.

En el microscopio de campo claro, se calcula la ampliación total de un objeto multiplicando el

aumento del objetivo por el aumento del ocular. Su límite de resolución máximo es de 0.2
micrones.

Manejo del microscopio de campo claro utilizando aceite de inmersión

1. Colocar sobre la platina la lámina portaobjeto con la muestra colocada en la parte

superior.
2. Situar cuidadosamente la parte que va a examinar sobre el agujero central de la platina.
3. Enfocar primero con el objetivo de mediano aumento (40 X) un área conveniente.
4. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre la muestra.
5. Separar los objetivos de la lámina y colocar el de inmersión girando el revolver hasta
que éste encaje.
6. Bajar cuidadosamente el objetivo de inmersión, observando lateralmente, hasta que el
objetivo quede sumergido en el aceite.
7. Separar lentamente la lámina con el uso del tornillo macrométrico hasta lograr ver una
imagen.
8. Utilizar el tornillo micrométrico hasta que la imagen se vea nítida. Este enfoque puede
lograrse girando muy poco el tornillo micrométrico, puesto que la distancia de trabajo
del objetivo de inmersión es relativamente corta.
9. Ajustar el condensador y diafragma hasta lograr la iluminación adecuada.

TINCIÓN DE MUESTRAS
Debido a que las células por su diminuto tamaño pueden no reflejar la luz incidente sobre la
muestra, la tinción es un método sencillo para incrementar el contraste entre la célula y su
entorno y por lo tanto contribuye a mejorar la imagen observada y de fácil utilidad con el
microscopia de campo claro.
Los colorantes los podemos clasificar en:
Básicos: se combinan con los componentes celulares cargos negativamente (ac nucleicos y
polisacáridos). Ej: Azul de metileno, Cristal violeta
Acidos: se combinan con los componentes celulares cargos positivamente (Proteínas) Ej:
Fuccina ácida, Rojo congo
Sustancias liposolubles: Se combinan con el material lipídico de la célula. Ej Sudán
Para teñir las bacterias hay que fijarlas sobre una laminilla de vidrio llamada portaobjetos. La
fijación se realiza por medio de calor para coagular las proteínas de las membranas exteriores
sobre el portaobjetos y que puedan soportar los procedimientos de teñido

PROCEDIMIENTO:

1. Usar un portaobjetos limpio.

2. Con el ansa esterilizada, tomar una pequeña porción de cultivo bacteriano
3. Dejar secar el extendido en la columna de aire caliente que proviene de la llama del
mechero.
4. Fijar el extendido pasando el portaobjetos tres veces por la llama del mechero.

Las tinciones pueden ser POSITIVAS, en éstas se va a colorear en microorganismo y el fondo

queda incoloro, dentro de este grupo tenemos la tinción simple y la diferencial o NEGATIVAS
en las cuales se colorea el fondo y el microorganismo queda sin teñir. Estas últimas se utilizan
en microorganismos capsulados y un colorante típico es la tinta china que no presenta afinidad
con los componentes celulares.

TINCIÓN SIMPLE: se aplica un solo colorante, todas las bacterias se tiñen del mismo color. EL
colorante usado generalmente es el azul de metileno

1. Cubrir el extendido ya fijado con azul de metileno y dejar actuar 15 minutos.

2. Transcurrido el tiempo, lavar suavemente con agua de red.
3. Dejar secar el extendido teñido a temperatura ambiente.
4. Observar al microscopio

TINCIÓN DIFERENCIAL: se aplican dos colorantes, permite teñir en forma diferente distintas
bacterias (tinción de Gram) u otras estructuras bacterianas como son las esporas (tinción de
Shaeffer y Fulton)

Tinción Gram:
1. Cubrir el extendido con cristal violeta durante 2 minutos
 2. Lavar suavemente con agua de red
3. Cubrir con lugol durante 1 minuto
4. Cubrir con alcohol - acetona durante 5 segundos
5. Lavar suavemente con agua de red
6. Cubrir con safranina durante 30 segundos
7. Lavar con agua de red
8. Dejar secar el extendido teñido a temperatura ambiente
9. Observar al microscopio

Tinción de esporas:

1. Cubrir el extendido con verde de malaquita

2. Calentar por debajo del portaobjetos con la llama amarilla del mechero hasta la
aparición de vapores blancos durante 5 minutos
3. Lavar con agua de red
4. Cubrir con fucsina 1/10 o safranina durante 1 minuto
5. Lavar con agua de red
6. Secar el extendido teñido a temperatura ambiente
7. Observar al microscopio

Las bacterias se tiñen de color rosado y las esporas de color verde