TALLER FINAL

INTEGRANTES
GOMEZ GARCÍA CARLOS MARIO
PACHECO DÍAZ ELKIN JOSÉ
URÁN RAMOS YAIR EDUARDO

MARY CECILIA MONTAÑO CASTAÑEDA (DOCENTE)

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
ELECTIVA DE OBTENCIÓN Y ANÁLISIS DE SUSTANCIAS BIOACTIVAS

MONTERIA – CÓRDOBA
2021
Solución
a) Para calcular el IC50 del extracto en cuestión, primero se debe calcular el promedio
de la absorbancia en cada concentración, seguidamente calcular el porcentaje (%) de
inhibición con la ecuación dada, datos que se registran en la siguiente tabla:
0 ppm 60 ppm 80 ppm 100 ppm 120 ppm 140 ppm
Prom. Abs 0.627 0.480 0.415 0.360 0.324 0.275
% Inhibición 0.1595 23.60 33.97 42.74 48.48 56.30

Luego se procede a graficar, % Inhibición vs Concentración

De la gráfica tenemos la siguiente información, Concentración

𝑦 = 0.4057 𝑥 + 0.4037

Porcentaje (%) de inhibición

Ahora bien, para calcular el IC50 se remplaza 𝑦 por 50 y se despeja 𝑥, puesto que se plantea,
cual es la concentración (x) a la cual el porcentaje (%) de inhibición (y) es 50%, de lo anterior
se tiene:
50 = 0.4057 𝑥 + 0.4037
50 − 0.4037
𝑥=
0.4057
𝑥 = 122.25
La concentración en la que se inhibiría el 50% del radical es 122.25 ppm.
b) Para determinar estadísticamente a que concentración el extracto posee actividad
antioxidante, se es necesario un análisis de varianza (ANAVA) y posteriormente una
comparación de medias basados en el método de Tukey.
En primera instancia, se procede a plantear las hipótesis estadísticas y los datos de trabajo:
H0= El extracto de AcOEt obtenido de una Niveles= 5 niveles (60, 80, 100, 120 y 140
planta no tiene actividad antioxidante. ppm)
H1= Al menos una de las concentraciones Control o testigo: 1 control (0 ppm)
del extracto de AcOEt obtenido de una
Tratamientos: 6 tratamientos
planta tiene actividad antioxidante.
𝜶 = 0.05
Factor = 1 solo factor, la concentración.

Consecuentemente, se hace el análisis de varianza con la herramienta de Excel

ANÁLISIS DE VARIANZA
Origen de las variaciones Suma de cuadrados Grados de libertad Promedio de los cuadrados F Probabilidad Valor crítico para F
Entre grupos 0,240432944 5 0,048086589 208,116999 3,1723E-11 3,105875239
Dentro de los grupos 0,002772667 12 0,000231056

Total 0,243205611 17
* Por los resultados arrojados del análisis de varianza, la hipótesis nula (H0) se rechaza y se
acepta la hipótesis alternativa (H1), indicando que al menos una de las concentraciones del
extracto de AcOEt tiene actividad antioxidante.
Posteriormente, se hace la comparación de medias por el método de Tukey para determinar
cuáles tratamientos presenta o no diferencias significativas, usando la siguiente ecuación:

𝐶𝑀𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟
𝑇𝛼 = 𝑞𝛼(𝐾,𝑁−𝐾) ∗ √
𝑅𝑒𝑝

Para resolver dicha ecuación y hacer la comparación de medias, se extraen unos datos
proporcionados por ANAVA y el análisis, ilustrados en la siguiente tabla.
Para 𝜶 = 𝟎. 𝟎𝟓
K N-K CMerror Rep.
6 12 0,0002310 3

Para hallar 𝑞𝛼 , se hace una relación del número de tratamientos, K, con los grados de libertad
para error, N-K, tomando el intercepto de las tablas de Tukey en este caso con 𝜶 = 𝟎. 𝟎𝟓
∴ 𝒒𝟎.𝟎𝟓 = 𝟒. 𝟕𝟓
Remplazando en la ecuacion tenemos;

0,0002310
𝑇0.05 = 4.75 ∗ √ = 0,0417
3

Finalmente, se calcula el valor promedio de cada tratamiento y la diferencia de los promedios

de los tratamientos entre ellos, que se ilustra en las siguientes tablas
Concentración del extracto (ppm)
0 60 80 100 120 140
0.627 0.480 0.415 0.360 0.324 0.275

Diferencias de los Resultados Conclusión

promedios
|𝑻𝟏 − 𝑻𝟐 | 0.147 > 0,0417 Diferencia significativa
|𝑻𝟏 − 𝑻𝟑 | 0.212 > 0,0417 Diferencia significativa
|𝑻𝟏 − 𝑻𝟒 | 0.267 > 0,0417 Diferencia significativa
|𝑻𝟏 − 𝑻𝟓 | 0.303 > 0,0417 Diferencia significativa
|𝑻𝟏 − 𝑻𝟔 | 0.352 > 0,0417 Diferencia significativa
|𝑻𝟐 − 𝑻𝟑 | 0.065 > 0,0417 Diferencia significativa
|𝑻𝟐 − 𝑻𝟒 | 0.120 > 0,0417 Diferencia significativa
|𝑻𝟐 − 𝑻𝟓 | 0.156 > 0,0417 Diferencia significativa
|𝑻𝟐 − 𝑻𝟔 | 0.205 > 0,0417 Dferencia significativa
|𝑻𝟑 − 𝑻𝟒 | 0.055 > 0,0417 Diferencia significativa
 |𝑻𝟑 − 𝑻𝟓 | 0.091 > 0,0417 Diferencia significativa
|𝑻𝟑 − 𝑻𝟔 | 0.140 > 0,0417 Diferencia significativa
|𝑻𝟒 − 𝑻𝟓 | 0.036 < 0,0417 Diferencia No significativa
|𝑻𝟒 − 𝑻𝟔 | 0.085 > 0,0417 Diferencia significativa
|𝑻𝟓 − 𝑻𝟔 | 0.049 > 0,0417 Diferencia significativa

Tratamiento 1 0 ppm a
Tratamiento 3 60 ppm b
Tratamiento 2 80 ppm c
Tratamiento 4 100 ppm d
Tratamiento 5 120 ppm d
Tratamiento 6 140 ppm e

Se puede considerar que a partir de la concentración de 60 ppm el extracto presenta

actividad antioxidante.
Solución:
a) El diseño experimental utilizado para escoger un catalizador eficiente en la
descomposición térmica del compuesto N, es en bloque completados al azar. El
bloque que plantea el experimento es el tipo de sustancia catalizadora.

b) Para determinar con certeza, es decir estadísticamente, cuáles de sustancias

propuestas tiene efecto catalizador, se es necesario un análisis de varianza (ANAVA)
y posteriormente una comparación de medias basados en el método de Tukey.
En primera instancia, se procede a plantear las hipótesis estadísticas y los datos de trabajo:
H0= Ninguna de las sustancias propuestas Factor = 1 solo factor, tiempo (efecto
tienen efecto catalizador para la catalizador)
descomposición térmica del compuesto N.
Niveles= 4 niveles (B, C, D y E)
H1= Al menos una de las sustancias
Control o testigo: 1 control (A)
propuestas tiene efecto catalizador para la
descomposición térmica del compuesto N. Tratamientos: 5 tratamientos
Bloque= Tipo de catalizador 𝜶 = 0.05
Consecuentemente, se hace el análisis de varianza con la herramienta de Excel
ANÁLISIS DE VARIANZA
Origen de las variaciones Suma de cuadrados Grados de libertad Promedio de los cuadrados F Probabilidad Valor crítico para F
Entre grupos 5,181142857 4 1,295285714 33,9164589 9,8094E-11 2,689627574
Dentro de los grupos 1,145714286 30 0,038190476

Total 6,326857143 34

* Por los resultados arrojados del análisis de varianza, la hipótesis nula (H0) se rechaza y se
acepta la hipótesis alternativa (H1), indicando que al menos una sustancia tiene efecto
catalizador para la descomposición térmica del compuesto N.
Posteriormente, se hace la comparación de medias por el método de Tukey para determinar
cuáles tratamientos presenta o no diferencias significativas, usando la siguiente ecuación:

𝐶𝑀𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟
𝑇𝛼 = 𝑞𝛼(𝐾,𝑁−𝐾) ∗ √
𝑅𝑒𝑝

Para resolver dicha ecuación y hacer la comparación de medias, se extraen unos datos
proporcionados por ANAVA y el análisis, ilustrados en la siguiente tabla.

Para 𝜶 = 𝟎. 𝟎𝟓
K N-K CMerror Rep.
5 30 0,03819 7
Para hallar 𝑞𝛼 , se hace una relación del número de tratamientos, K, con los grados de libertad
para error, N-K, tomando el intercepto de las tablas de Tukey en este caso con 𝜶 = 𝟎. 𝟎𝟓
∴ 𝒒𝟎.𝟎𝟓 = 𝟒. 𝟏𝟎
Remplazando en la tenemos;

0,03819
𝑇0.05 = 4.10 ∗ √ = 0,3028
7

Finalmente, se calcula el valor promedio de cada tratamiento y la diferencia de los promedios

de los tratamientos entre ellos, que se ilustra en las siguientes tablas
Sin Tipos de sustancias catalizadoras
catalizador
Bloque I Bloque II Bloque III Bloque IV Bloque V
A B C D E
2,3142 2,3714 1,3571 1,9857 2,3428

Diferencias de los Resultados Conclusión

promedios
|𝑻𝟏 − 𝑻𝟐 | 0.0572 < 0,3028 Diferencia No significativa
|𝑻𝟏 − 𝑻𝟑 | 0.9571 > 0,3028 Diferencia significativa
|𝑻𝟏 − 𝑻𝟒 | 0.3285 > 0,3028 Diferencia significativa
|𝑻𝟏 − 𝑻𝟓 | 0.0286 < 0,3028 Diferencia No significativa
|𝑻𝟐 − 𝑻𝟑 | 1.0143 > 0,3028 Diferencia significativa
|𝑻𝟐 − 𝑻𝟒 | 0.3857 > 0,3028 Diferencia significativa
|𝑻𝟐 − 𝑻𝟓 | 0.0286 < 0,3028 Diferencia No significativa
|𝑻𝟑 − 𝑻𝟒 | 0.6286 > 0,3028 Diferencia significativa
|𝑻𝟑 − 𝑻𝟓 | 0.9857 > 0,3028 Diferencia significativa
|𝑻𝟒 − 𝑻𝟓 | 0.3571 > 0,3028 Diferencia significativa

Tratamiento 1 A a
Tratamiento 2 B a b
Tratamiento 5 E a b
Tratamiento 3 C c
Tratamiento 4 D d

Conclusion, de las sustancias propuestas las que en realidad son catalizadoras es la sustancia
C y la D dado que son estadisticamente diferentes al bloque I. Las sustancias B y E son
estadisticamente iguales, ademas no tienen diferencia significativa con el bloque I, que es
donde se efectua la reaccion sin ningun tipo de catalizador, dicho de otra manera, al ser
agregadas en la reaccion para la descompopsicion termica del compuesto N no presentan
efecto catalizador alguno.
 c) Partiendo que un catalizador es una sustancia que disminuye la energia activacion de
una reaccion, consecuentemente disminuye el tiempo de reaccion, se considera que
la que tiene mejor efecto catalizador es la sustancia C, puesto que en la comparacion
de media es la que presenta menor tiempo para que el compuesto N reduzca su
concetracion a la mitad.
3. Para determinar la concentración letal media (LC50) de un compuesto X, se diseñó un
experimento completamente aleatorizado, empleando como organismos blancos Artemia
salina. En cada unidad experimental se colocaron 10 organismos de A. salina y la solución
del compuesto X a la concentración correspondiente. Pasadas 24 horas se cuentan los
organismos muertos. Al realizar el experimento y hacer el conteo respectivo, se obtuvieron
los siguientes datos:

CONCENTRACION (ppm)
Control 2,5 5 7,5 10 15 20 40 60 80
0 1 2 2 3 5 4 6 6 9
0 1 2 3 4 4 5 6 7 7
0 1 3 3 3 4 5 6 7 8

a) Calcule el valor de LC50 para este compuesto, (graficar concentración vs. %

mortalidad). (Recomendación: puede transformar el valor de la concentración a log10
y luego hacer la gráfica, con el fin de ajustar mejor a la tendencia lineal)

Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza

Columna 1 3 3 1 0
Columna 2 3 7 2,333333333 0,33333333
Columna 3 3 8 2,666666667 0,33333333
Columna 4 3 10 3,333333333 0,33333333
Columna 5 3 13 4,333333333 0,33333333
Columna 6 3 14 4,666666667 0,33333333
Columna 7 3 18 6 0
Columna 8 3 20 6,666666667 0,33333333
Columna 9 3 24 8 1
PROMEDIO DE MORTALIDAD 31,8888

Teniendo en cuenta el análisis de varianza se obtiene el porcentaje de mortalidad.

𝑝𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑜𝑟𝑔𝑎𝑛𝑖𝑠𝑚𝑜𝑠 𝑚𝑢𝑒𝑟𝑡𝑜𝑠

%𝑚𝑜𝑟𝑡𝑎𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 = ( ) ∗ 100%
10
31,8888
%𝑚𝑜𝑟𝑡𝑎𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 = ( ) ∗ 100% = 3,18888889%
10
 CONCENTRACION (ppm)

Contro 2,5 5 7,5 10 15 20 40 60 80

l
0 1 2 2 3 5 4 6 6 9
0 1 2 3 4 4 5 6 7 7
0 1 3 3 3 4 5 6 7 8

Título del gráfico

9
8
7
% MORTALIDAD

6
5
EXPE 1
4
EXPE 2
3
EXPE 3
2
1
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80
CONCENTRACION(ppm)

Concentraciones del compuesto X vs % de mortalidad

En la siguiente ecuación se muestra el procedimiento para llevar las concentraciones a log10
para realizar el grafico correspondiente.
𝐿𝑜𝑔10 [2,5] = 0,39
Para las demás concentraciones se realizó el mismo procedimiento y los valores se
encuentran en la tabla

Concentraciones del compuesto X se expresan en log10 y porcentaje de mortalidad

CONCENTRACION (ppm)

Control 0,39 0,69 0,87 1 1,17 1,3 1,6 1,77 1,9

0 1 2 2 3 5 4 6 6 9
0 1 2 3 4 4 5 6 7 7
0 1 3 3 3 4 5 6 7 8
 log10 [X] vs % mortalidad
9
9 8
8 7
7
6 6
% MORTALIDAD

6
5 5
5 4 4 EXP 1
4 3 3 3 EXP 2
3 2 2 EXP 3
2 1
1
0
0,3 0,5 0,7 0,9 1,1 1,3 1,5 1,7 1,9
CONCENTRACION (ppm) (log 10)

Concentraciones del compuesto X expresada en log (10) vs % de mortalidad

b) Bajo las condiciones utilizadas, determine cuál sería el LOAEL y cuál es el NOAEL.

En el grafico que las concentraciones expresadas en log10 se observa un valor de NOAEL por
debajo de la concentración 0,39 para los tres experimentos donde se aplicó el compuesto X
y sus diferentes concentraciones no hay toxicidad. En el caso de LOAEL la gráfica muestra
toxicidad a partir de la concentración de 0,39 donde se nota la mortalidad de un organismo
(Artemia salina). En cuanto a los experimentos también podemos comentar que los 3
experimento del compuesto X son igual de potentes, en cuanto a la eficiencia el experimento
1 resulta más eficiente que los demás.
4. A partir de un organismo marino se aislaron dos toxinas, al evaluar su efecto sobre ratones
y determinar la LD50, se obtuvieron los siguientes datos.

GRAFICA

Dosis (mg/Kg) Vs %Mortalidad

90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 100 200 300 400 500 600 700 800

a) ¿Cuál de las dos toxinas es la más efectiva?, ¿Cuál es más potente? Explique
Basándose en la gráfica en la TOXINA X (AZUL) es donde empieza la actividad, es
decir, más del 50 %, o se puede decir que en 400 es donde va a empieza hacer el
efecto.

b) ¿Cuál tendrá menor valor de LD 50?

En 100 es cuando tienen menor valor.
5. Se realizó un experimento para determinar la posible actividad bactericida in vitro y
determinar el IC50, de un extracto metabólico obtenido de una planta, frente a Pseudomona
pseudoalcaligenes, empleando el método de difusión en agar. Se emplearon 6 tratamientos
con tres repeticiones. Cada concentración constituyó un tratamiento, más un control positivo
preparado con Amoxicilina 5 μg/mL (antibiótico comercial). Se colocaron 100 μL de cada
tratamiento en los pozos hechos sobre el agar en las cajas de Petri, posteriormente fueron
incubadas por 24 h a 37°C. Pasado este tiempo se procedió a medir el tamaño de las zonas
de inhibición del crecimiento (mm) alrededor de los pozos, obteniéndose los siguientes
resultados:
Concentraciones (μg/mL)
Amoxicilina 2.5 5 10 15 20
R1 36 15 16 18 26 35
R2 36 14 16 19 28 31
R3 35 14 16 19 26 33
PROM 35.67 14.33 16 18.67 26.67 33

a) Calcular el porcentaje de inhibición mediante la fórmula:

𝐷𝑖𝑎𝑚_𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
%𝐼𝑛ℎ = [ ] ∗ 100
𝐷𝑖𝑎𝑚_𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎
Diam: diámetro (mm)

Concentraciones 2.5 5 10 15 20
(μg/mL)
%Inh 40.2 45 52.34 74.77 92.52

Luego se procede a graficar, % Inhibición vs Concentración

IC50
100
80
60
%Inh

40
20
0
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3 1,4
log (μg/mL)

De la gráfica tenemos que el IC50 = 0,92

 b) ¿La concentración de 20 μg/mL se comporta igual que la amoxicilina?
Es necesario un análisis de varianza (ANOVA) y posteriormente una comparación de
medias basados en el método de Tukey.
H0= la concentración del extracto obtenido de la planta no influye en la actividad bactericida
H1= la concentración del extracto obtenido de la planta influye en la actividad bactericida
Factor = 1 solo factor, la concentración.
Niveles= 5 niveles
Control o testigo: 1 control (Amoxicilina)
Tratamientos: 6 tratamientos
𝜶 = 0.05
ANÁLISIS DE VARIANZA
Origen de las Suma de Grados Promedio de F Probabilid Valor
variaciones cuadrados de los cuadrados ad crítico
libertad para F
Entre grupos 1230.2777 5 246.055556 233.1052 1.621E-11 3.105875
8 63 24
Dentro de los 12.666666 12 1.05555556
grupos 7

Total 1242.9444 17
4

A partir de los datos obtenidos por ANOVA, se acepta la hipótesis NULA: la concentración
del extracto obtenido de la planta no influye en la actividad bactericida
Comparación de medias (método de Tukey)

𝐶𝑀𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟
𝑇𝛼 = 𝑞𝛼(𝐾,𝑁−𝐾) ∗ √
𝑅𝑒𝑝

Datos ANOVA
• Fcalculado = 233.105263
• Ftabulado = 3.10587524
• CMerror = 1.055
• N-K = 12
𝑞𝑎(𝑘,𝑁−𝐾) = 4.75
 𝑇𝑎 = 4.23 ∗ √(1.055/3 )
𝑇𝑎 = 2.5

diferencia de promedio
|T1-T2| =|35.67-14.33| 21.34 Diferencia significativa
|T1-T3| =|35.67-16| 19.67 Diferencia significativa
|T1-T4| =|35.67-18.67| 17 Diferencia significativa
|T1-T5| =|35.67-26.67| 9 Diferencia significativa
|T1-T6| =|35.67-33| 2.67 Diferencia significativa
|T2-T3| =|14.33-16| 1.67 Diferencia no significativa
|T2-T4| =|14.33-18.67| 4.34 Diferencia significativa
|T2-T5| =|14.33-26.67| 12.34 Diferencia significativa
|T2-T6| =|14.33-33| 18.67 Diferencia significativa
|T3-T4| =|16-18.67| 2.67 Diferencia significativa
|T3-T5| =|16-26.67| 10.67 Diferencia significativa
|T3-T6| =|16-33| 17 Diferencia significativa
|T4-T5| =|18.67-26.67| 8 Diferencia significativa
|T4-T6| =|18.67-33| 14.33 Diferencia significativa
|T5-T6| =|26.67-33| 6.33 Diferencia significativa

T1 Amoxicilina a
T2 2.5 μg/mL b
T3 5 μg/mL b
T4 10 μg/mL c
T5 15 μg/mL d
T6 20 μg/mL e

Finalmente, con los datos obtenidos se concluye que no se presenta un comportamiento

igual en la actividad bactericida de los extractos de la planta, entre la amoxicilina y la
concentración de 20 μg/mL

6. ¿En qué consiste la farmacognosia?

"Farmacognosia" deriva de dos palabras griegas, "pharmakon" o fármaco, y "gnosis" o

conocimiento. La farmacognosia es el estudio de moléculas de productos naturales
(típicamente metabolitos secundarios) que son útiles por sus propiedades medicinales,
ecológicas, gustativas u otras propiedades funcionales. Las especies naturales que son la
fuente de los compuestos en estudio abarcan todos los reinos biológicos, principalmente los
invertebrados marinos, las plantas, los hongos y las bacterias (American Society of
Pharmacognosy, 2016). El estudio de la farmacología se divide a su vez en dos áreas
principales. La farmacodinámica analiza los efectos de un agente en los sitios activos del
cuerpo. Por el contrario, la farmacocinética se ocupa de los efectos que tiene el cuerpo sobre
el medicamento y, específicamente, de las concentraciones que se pueden alcanzar en los
sitios activos (Bone, 2013).

¿Qué estudia cada una de las siguientes ramas de la farmacognosia?

• Farmacoergasia: se encarga del estudio del cultivo, recolección, secado y

almacenamiento de las plantas. Estos son los denominados factores implicados en la
producción de drogas (Osorio, 2009).
• Farmacoetnología: estudia los diferentes usos de las plantas medicinales en diferentes
pueblos y culturas dentro del contexto histórico. (Osorio, 2009).
• Farmacogeografía: estudia las zonas geográficas y la distribución de las drogas. Dos
factores determinan las fuentes geográficas comerciales de una droga como son la
facilidad de obtener la planta en un determinado entorno y los factores económicos
asociados a la producción de la droga en determinada área (Osorio, 2009).
• Farmacoetimología: estudia los diferentes nombres de las drogas en los diferentes
pueblos, de la misma o distinta lengua (Osorio, 2009).
• Farmacoemporia: estudia el comercio, los puertos y las rutas que son utilizadas para
la comercialización de las plantas. (Osorio, 2009).
• Farmacodiascomia: se encarga del estudio de los empaques o todo material que sirva
para el guardado de la droga vegetal (Osorio, 2009).
 BIBLIOGRAFÍA

American Society of Pharmacognosy (2016). About the ASP. Recuperado el 15/11/2020 de:
http://www.pharmacognosy.us/what-is-pharmacognosy/

López, A. (2018). Farmacoergasia. Prezzi. Recuperado el 15/11/2020 de:

https://prezi.com/p/8gjq8_uqxnbm/farmacoergasia/

Merchán, M. (2018). Evaluación de la actividad antibacteriana de extracto alcohólico y

extracto etéreo de annona muricata frente a Pseudomona aeruginosa. Recuperado el
15/11/2020 de:
http://dspace.uniandes.edu.ec/bitstream/123456789/8796/1/PIUAMFCH028-2018.pdf

Osorio, E. (2009). Aspectos básicos de farmacognosia. Facultad de Química Farmacéutica.

Universidad de Antioquia. Recuperado el 15/11/2020 de:
https://www.academia.edu/16696556/Aspectos_b%C3%A1sicos_de_farmacognosia

2 - Principles of herbal pharmacology (2013). In K. Bone, & S. Mills (Eds.), Principles and
practice of phytotherapy (second edition) (pp. 17-82). Saint Louis: Churchill Livingstone.
doi:https://doi.org/10.1016/B978-0-443-06992-5.00002-5 Retrieved
from http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780443069925000025